Cá chẽm Lates calcarifer (Bolch, 1790) có những biểu hiện bệnh lí đặc trưng:
bơi không định hướng, mắt lồi, xuất huyết ở các gốc vây, bụng trướng to…
2.2.2 Gà mái đẻ trứng
4 con gà mái đẻ 25 tuần tuổi thuộc giống gà ISA – Brown, cho năng suất trứng
rất cao (300-310 trứng/năm).
Gà được nuôi trong chuồng có mái che, đặt nơi thoáng mát, che chắn cẩn thận và được nuôi bằng thức ăn dạng viên dành cho gà đẻ trứng. Hàng ngày chuồng được
vệ sinh và thay nước để giữ điều kiện chuồng luôn sạch sẽ.
Hình 2.1Gà mái đẻ trứng ISA-Brown
2.2.3 Chủng vi khuẩn
Chủng chuẩn S. iniae ATCC 29178 được cung cấp bởi trung tâm nghiên cứu
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Hình 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 phương pháp phân lập vi khuẩna. Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Tủ ấm, nồi hấp, que cấy đầu tròn, bông, kéo, panh, túi nylon
Hóa chất và môi trường: TSA (Merk, Germany) bổ sung 1,5% NaCl và KF Streptococcus agar (Merk, Germany), alcool 700.
b. Thu mẫu cá
Các mẫu cá chẽm có dấu hiệu lờ đờ, xuất huyết thu từ trại nuôi cá chẽm ở
Cam Ranh - Khánh Hòa được cho vào túi nylon chứa khoảng 1/2 lượng nước, sau
đó bơm khí oxy vào cột chặt túi. Vận chuyển nhanh về PTN, Trường Đại học Nha Trang để phân tích. Chỉ những mẫu bệnh phẩm còn sống mới được sử dụng để phân
lập vi khuẩn.
Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm
chẽm
Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập (đặc điểm hình thái, test sinh hóa, định danh di truyền)
Xác định độ nhạy
kháng sinh củaS. iniae
Nghiên cứu khả năng sản sinh IgY lòng đỏ trứng của gà được miễn dịch
với S. iniae bất hoạt
Nghiên cứu phân bố khối lượng
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
c. Phân lập vi khuẩn
Trước khi phân lập vi khuẩn, tiến hành mổ khám và quan sát các dấu hiệu
bệnh lý của cá bệnh. Mổ xoang bụng cá: mặt ngoài cơ thể cá được đánh sạch vảy và sát trùng thật kỹ bằng cồn 70o tại vị trí mổ để tránh sự tạp nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài. Cắt bỏ vây lưng và vây ngực. Tiến hành mổ xoang bụng cá bằng dao mổ và kéo tiệt trùng theo 3 đường cắt (Hình 2.3). Dùng kẹp đã khử trùng gắp bỏ phần cơ
bụng cá đã cắt. Quan sát mô, cơ quan bên trong và ghi lại các dấu hiệu bệnh lí.
Hình 2.3 Cá chẽm Lates calcarifer
Sau khi các dấu hiệu lâm sàng của cá bệnh được ghi lại. Vi khuẩn sẽ được phân lập
từ 3 bộ phận là thận, gan và não của cá. Dùng kẹp vô trùng gạt các phần nội tạng sang
một bên, thận cá nằm sâu trong xoang bụng cá, ngay phía dưới xương sống. Dùng mũi kéo đã khử trùng cắt một vết nhỏ trên thận. Sau đó đưa que cấy vòng nhúng và xoay nhẹ
vào chỗ cắt cấy ria trên môi trường TSA (Merk, Germany) bổ sung 1,5% NaCl và KF Streptococcus agar (Merk, Germany). Vi khuẩn được nuôi cấy ở 370C trong 24h. Sau đó
các khuẩn lạc đơn được chuyển sang môi trường nuôi cấy tương tự để cấy thuần.
Mẫu gan và não cá cũng được lấy và nuôi cấy vi khuẩn tương tự như khi lấy ở mẫu
thận.
2.4.2 Định danh vi khuẩn a. Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Tủ lạnh, kính hiển vi, nồi hấp, đèn cồn, lam kính, lamen, que cấy đầu tròn, đũa thủy tinh, micropipette
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Hóa chất và môi trường: Test API 20 Strep để thử đặc điểm sinh hóa của các
chủng liên cầu khuẩn; giấy tẩm Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid để thử phản ứng Oxidase; H2O2 để thử phản ứng Catalase; hóa chất nhuộm Gram:
tím Violet, hồng Fushin, Liugol, dầu soi kính, cồn 70o; môi trường tổng hợp bổ
sung 1,5% NaCl: TSA (Tryptic Soy Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), BA (Blood Agar) có bổ sung 5% máu cừu; môi trường manitol để kiểm tra khả năng di động và lên men đường manitol của vi khuẩn
b. Phương pháp tiến hành
Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm được xác định
bằng phương pháp nhuộm Gram. Các chủng cầu khuẩn Gram dương sẽ tiếp tục được kiểm tra bằng hai phản ứng catalase và oxidase.
Để kiểm tra hoạt tính Catalase của vi khuẩn, tiến hành nhỏ một giọt H2O2 30% vào tâm khuẩn lạcđược đặt trên lam kính sạch.
Để kiểm tra hoạt tính Oxidase của vi khuẩn, dùng đũa thủy tinh lấy khuẩn lạc của vi khuẩn miết lên miếng giấy đã tẩm sẵn thuốc thử oxidase (tetramethyl-p- phenylenediamine hydrochloride).
Các chủng cầu khuẩn Gram dương, âm tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase sẽ được phân lập lại trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl nhằm thu được chủng vi khuẩn thuần khiết, sau đó các chủng này được lưu giữ ở -80oC trong
môi trường TSB bổ sung 1,5% NaCl và có 20% glycerol.
Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn lưu giữ được xác định bằng bộ Kit API20 STREP (BioMerieux, Pháp). Khả năng dung giải máu của các chủng vi
khuẩn này được xác định bằng cách cấy ria các chủng vi khuẩn lên môi trường
thạch máu BA (Blood agar base) có bổ sung 5% máu cừu. Việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được dựa theo hệ thống định danh vi khuẩn của Bergey (1974) so sánh với các phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn S. iniae ATCC 29178 chuẩn và các kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác [8], [9], [20]. Đồng thời
chúng tôi cũng kết hợp với việc định danh vi khuẩn mục tiêu bằng phần mềm của
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang Các chủng được xác định là vi khuẩn S. iniae bằng các chỉ tiêu sinh hóa và hình thái học sẽ được gửi định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại Công ty
Nam khoa. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh, tách chiết và giải trình tự
16S rDNA và so sánh trình tự này với ngân hàng gene có sẵn bằng công cụ BLAST.
2.4.3 Xác định độ nhạy kháng sinh của chủng Streptococcus iniae phân lập
Việc kiểm tra độ nhạy của chủng vi khuẩn phân lập được với các loại kháng sinh được tiến hành theo phương pháp của Bauer, 1996 [7].
a. Môi trường và hóa chất
Đĩa thạch Mueller-Hinton agar (MHA)
Đĩa giấy tẩm kháng sinh: Norfloxacine (10 µg), Ciprofloxacin (5 µg),
Sulphamethoxazol/trimethoprim (23,75/1,25 µg), Ampicillin (10 µg), Doxycycline (30 µg), Erythromycin (15 µg), Amoxicyclin (25 µg), Nalidicid acid (30 µg), Oxytetracycline (30 µg), Gentamycin (10 µg), Cephalexin (30 µg) và streptomycin (10 µg).
b. Phương pháp tiến hành
Vi khuẩn thử nghiệm độ nhạy kháng sinh được lấy từ các khuẩn lạc đã được làm thuần và nuôi cấy trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl trong 24-48h. Sau đó
huyền phù trong nước muối sinh lý vô trùng.
Hút 100 µl dung dịch huyền phù vi khuẩn này, dùng que cấy trang thủy tinh trang đều dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch Mueller-Hinton agar, đặt vào tủ ấm
khoảng 15 phút.
Đặt các đĩa giấy kháng sinh lên bề mặt thạch để đảm bảo nó được tiếp xúc hoàn toàn với môi trường.
Lật ngược đĩa, đem ủ ở 300C/24h.
Đo đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy kháng sinh.
Đường kính vòng vô khuẩn sẽ được ghi lại để xác định độ nhạy của vi khuẩn với
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
2.4.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE [4]
SDS - PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
là phương pháp được Shapiro và cộng sự giới thiệu năm 1967, kể từ đó nó trở thành một phương pháp được sử dụng rộng nhất để phân tích hỗn hợp protein. Phương pháp này điện di protein theo phương thẳng đứng và phân tách protein theo trọng lượng phân tử.
a. Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị điện di protein của hãng Bio – Rad (Mini PROTEAN® Tetra Cell) (Hình 2.4); máy ly tâm nhỏ, bể ổn nhiệt, máy đo OD; micropippet, đầu típ, eppendorf, cuvette
Hóa chất: Monomer solution, 4X running gel buffer, 4x stacking gel buffer, SDS 10%, ammonium persulfate 10%, 2X treatment buffer (loading buffer), tank buffer, TEMED, protein thang chuẩn, staining solution, destaining solution I;
đệm TES, Mix mutanolysine
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
b. Nguyên tắc
Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng phân tử bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS) là một chất tẩy mang điện tích âm nó sẽ
phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Dithiothreitol (DTT)
cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS - protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Phức này sau đó cũng chính là mẫu để chạy điện di. Nguyên lý của chạy điện di là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử sẽ dịch chuyển về phía anode với
tốc độ dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Các
phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả từ một điểm chung các phân
tử khác nhau sẽ được phân bố ở các vị trí (các band) khác nhau tương ứng với độ
lớn của chúng.
Phương pháp SDS - PAGE được tiến hành sử dụng gel polyacrylamide. Gel
polyacylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acylamide
(polyacylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị (Hình 2.5). Gel
polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và bisacrylamide. Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang
học. Có hai tác nhân hóa học cần thiết, đó là ammonium persulfate đóng vai trò peroxide khởi động (initiator peroxidase) và quanternary amine N.N.N’.N’- tetramethylene diamine (TEMED) làm vai trò chất xúc tác. Tác nhân quang học là
ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động và TEMED làm tác nhân xúc tác. Quá trình hình thành gel dẫn đến sinh nhiệt nên việc
tối ưu nồng độ tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình này hoàn tất
không quá nhanh.
Có hai thông số để xác định kích thước gel: Tỉ lệ toàn bộ thành phần chất rắn
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang Chúng ta thấy rằng %T tăng thì kích thước gel sẽ nhỏ đi. Trong khi đó %C cho biết
tỉ lệ bisacrylamide trong tổng số thành phần rắn và thông số này cũng ảnh hưởng đến kích thước gel.
Có hai hệ thống điện di, một loại là hệ thống đệm liên tục và một là hệ thống đệm không liên tục. Hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần
hệ thống đệm liên tục. Hiện nay, SDS - PAGE thường dùng hệ thống đệm không
liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (1970) biến thể từ hệ thống của Ornstein (1960) và Davis (1960).
Hình 2.5 Sự hình thành polymer hóa của acrylamide
Trong hệ thống đệm không liên tục thì gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp. Lớp ở trên có kích thước gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp stacking
gel. Ở lớp dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được
gọi là running gel (Hình 2.6). Hai lớp này được pha với hai dung dịch đệm khác
nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH. Dung dịch điện di cũng được pha loãng bằng một dung dịch đệm khác, gọi là tank buffer.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Ở hệ thống đệm không liên tục, khi bắt đầu điện di các ion và thành phần protein di
chuyển trước hết vào lớp stacking gel. Các thành phần protein tập trung thành một
lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion), sau đó
lớp mỏng protein này được di chuyển dần đến để tiếp cận lớp running gel. Chính nhờ vậy mà các thành phần protein được phân giải rất tốt khi di chuyển trong
running gel.
Hình 2.6 Mô hình gel điện di (SDS - PAGE)
c. Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu điện di
Chủng vi khuẩn Streptococcus iniae được nuôi cấy thuần trong môi trường
TSA bổ sung 1,5% NaCl ở 370C trong 24h. Sau đó, lấy khuẩn lạc đơn nuôi tăng
sinh trong 10 ml môi trường TSB bổ sung 1,5% NaCl lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ
phòng trong 24h. Hút 40µl dịch vi khuẩn có OD600 = 2,7 sang 1 ml PBS được đựng
sẵn trong eppendorf. Tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút rồi thu cặn và bỏ dịch. Cặn tiếp tục được hòa lại trong 500 µl Mix mutanolysine. Mix đều rồi ủ ở
370C trong 2h. Sau 2h tiến hành ly tâm tiếp ở 8000 vòng/phút trong 10 phút để thu
dịch. Hàm lượng protein trong dịch sau ly tâm sẽ được xác định bằng phương pháp Bradford và dịch protein được bảo quản ở -200C đến khi sử dụng.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Tiến hành điện di SDS - PAGE
Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
Lau các tấm kính bằng nước cất, gắn vào giá đỡ
Lắp ráp các khuôn đổ gel theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Pha dung dịch running gel 12% (Bảng 2.1). Tải nhanh gel vào khuôn bằng
micropipette 1ml một cách nhẹ nhàng (khoảng 4,5 ml/khuôn). Tải nước cất
hai lần lên lớp running gel (giúp tránh tình trạng gel đông không tốt do bị oxi
hóa và giúp bề mặt trơn láng). Đợi gel đông khoảng 30 - 45 phút.
Trong khi đợi running gel trùng hợp tiến hành pha stacking gel 5% acrylamide (Bảng 2.1). Khi running gel trùng hợp hoàn toàn. Cho tiếp stacking gel vào
khuôn điện di cho đến khi gần đầy khuôn. Cắm lược và để khoảng 30 - 45 phút.
Sau khi stacking gel trùng hợp hoàn toàn, rút lược nhẹ nhàng ra khởi gel. Rửa
sạch các giếng gel bằng tank buffer. Sau đó, ráp khuôn gel vào buồng điện di. Đổ đầy tank buffer vào hai máng trên và dưới của buồng điện di để chuẩn bị cho điện di.
Bảng 2.1 Thành phần và các dung dịch điện di protein
Thành phần Gel cô 5% (Stacking gel) Gel tách 12% (Running gel) Nước cất 6,2 ml 4,4 ml Monomere Solution 40% 1,3 ml 3 ml
4X Running gel Buffer (pH 8,8) - 2,5 ml
4X Stacking gel Buffer (pH 6,8) 2,5 ml -
SDS 10% 0,1 ml 0,1 ml
APS 10% 50 µl 50 µl
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang Chuẩn bị mẫu để điện di
Lượng mẫu thích hợp để tải vào mỗi giếng trong SDS - PAGE là 50 µg/giếng.
Dịch protein được hòa tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu 2X - treatment buffer (tỉ lệ 1:1) trong eppendorf. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi trong 5
phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong được giữ trong đá bào đến khi sử dụng.
Dùng micropipette, hút trộn đều mẫu và tải mẫu từ từ vào giếng gel.
Chạy điện di
Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cấp điện.
Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng để chạy điện di ở cường độ 15 mA, quan sát sự di
chuyển của vạch màu trong gel điện di khi vạch màu đến gần đáy của gel khoảng
1 - 1,5 giờ (thời gian có thể thay đổi theo số lượng mẫu). Nhuộm gel và rửa gel
Ngâm gel trong acid acetic 7% khoảng 10 phút
Ngâm gel trong methanol 50% khoảng 20 phút
Rửa gel trong nước loại ion khoảng 10 phút
Ngâm gel trong dịch nhuộm (bạc nitrat) khoảng 15 phút
Sau đó, rửa gel thật kỹ lại với nước loại ion
Ngâm gel trong dịch giải nhuộm khoảng 2 – 15 phút cho tới khi có thể thấy rõ các band protein.
2.4.5 Phương pháp gây miễn dịch trên gà bằng vi khuẩn S. iniae bất hoạta. Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ và thiết bị: Tủ ấm, máy ly tâm lạnh, cân phân tích, máy vortex, ống ly tâm, micropippet, eppendorf, que cấy vòng, kim tiêm 1cc
Môi trường và hóa chất: Môi trường NA, TSA, TCBS và KF Streptococcus có bổ
sung 1,5% NaCl, tá dược FCA (Freund’s complete adjuvant) và FIA (Freund’s incomplete adjuvant) lần lượt dùng cho lần miễn dịch nguyên phát và thứ phát, cồn sát trùng 700, đệm 1X PBS pH 7,2, Formaline.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
b. Chuẩn bị vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt