a. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ và thiết bị: máy vortex, ống nghiệm, pipette, quả bóp, cuvette,
micropippet, bình tia
Môi trường và hóa chất: dung dịch chuẩn bovine serum albumin (BSA), đệm
Phosphate, thuốc thử Bradford
b.Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp Bradford dựa trên sự thay đổi bước sóng cựu đại của thuốc nhuộm Coomassive Brilliant Blue G-250. Thuốc nhuộm này khi phản ứng protein sẽ tạo màu xanh và làm thay đổi bước sóng hấp thu cực đại từ
465 nm của thuốc nhuộm sang 595 nm của phức thuốc nhuộm-protein. Độ hấp
thu ở bước sóng 595 nm cũng như cường độ màu của dung dịch phức hợp tỉ lệ
với nồng độ protein trong dung dịch.
c. Dựng đường chuẩn
Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin, 100
µg/ml) theo bảng bên dưới.
Bảng 2.3 Phương pháp pha dung dịch BSA dựng đường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Dung dịch BSA (µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Nước cất (µl) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hút 5000 µl dung dịch thuốc thử Bradford lần lượt cho vào các ống có chứa
1000 µl dịch protein vừa pha ở trên, lắc đều. Sau 20 phút đem đo dung dịch ở bước sóng 595 nm. Tại mỗi nồng độ sẽ tiến hành đo 3 lần và xác định giá trị OD
trung bình. Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (OD) theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (µg/ml).
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
d. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford
Mẫu được pha loãng đến nồng độ phù hợp để cho Odmẫu.
Hút 900 µl dung dịch protein đã pha loãng và thêm vào đó 4500 µl thuốc thử
Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Với mỗi mẫu được thực hiện 3 lần , lấy giá trị OD trung bình và tính OD. Từ đường chuẩn có được suy ra nồng độ protein trong mẫu phân tích như sau:
Nồng độ IgY của mẫu = nồng độ tính toán*độ pha loãng