a. Dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Tủ lạnh, kính hiển vi, nồi hấp, đèn cồn, lam kính, lamen, que cấy đầu tròn, đũa thủy tinh, micropipette
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Hóa chất và môi trường: Test API 20 Strep để thử đặc điểm sinh hóa của các
chủng liên cầu khuẩn; giấy tẩm Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid để thử phản ứng Oxidase; H2O2 để thử phản ứng Catalase; hóa chất nhuộm Gram:
tím Violet, hồng Fushin, Liugol, dầu soi kính, cồn 70o; môi trường tổng hợp bổ
sung 1,5% NaCl: TSA (Tryptic Soy Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), BA (Blood Agar) có bổ sung 5% máu cừu; môi trường manitol để kiểm tra khả năng di động và lên men đường manitol của vi khuẩn
b. Phương pháp tiến hành
Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm được xác định
bằng phương pháp nhuộm Gram. Các chủng cầu khuẩn Gram dương sẽ tiếp tục được kiểm tra bằng hai phản ứng catalase và oxidase.
Để kiểm tra hoạt tính Catalase của vi khuẩn, tiến hành nhỏ một giọt H2O2 30% vào tâm khuẩn lạcđược đặt trên lam kính sạch.
Để kiểm tra hoạt tính Oxidase của vi khuẩn, dùng đũa thủy tinh lấy khuẩn lạc của vi khuẩn miết lên miếng giấy đã tẩm sẵn thuốc thử oxidase (tetramethyl-p- phenylenediamine hydrochloride).
Các chủng cầu khuẩn Gram dương, âm tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase sẽ được phân lập lại trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl nhằm thu được chủng vi khuẩn thuần khiết, sau đó các chủng này được lưu giữ ở -80oC trong
môi trường TSB bổ sung 1,5% NaCl và có 20% glycerol.
Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn lưu giữ được xác định bằng bộ Kit API20 STREP (BioMerieux, Pháp). Khả năng dung giải máu của các chủng vi
khuẩn này được xác định bằng cách cấy ria các chủng vi khuẩn lên môi trường
thạch máu BA (Blood agar base) có bổ sung 5% máu cừu. Việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được dựa theo hệ thống định danh vi khuẩn của Bergey (1974) so sánh với các phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn S. iniae ATCC 29178 chuẩn và các kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác [8], [9], [20]. Đồng thời
chúng tôi cũng kết hợp với việc định danh vi khuẩn mục tiêu bằng phần mềm của
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang Các chủng được xác định là vi khuẩn S. iniae bằng các chỉ tiêu sinh hóa và hình thái học sẽ được gửi định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại Công ty
Nam khoa. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh, tách chiết và giải trình tự
16S rDNA và so sánh trình tự này với ngân hàng gene có sẵn bằng công cụ BLAST.