a. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ và thiết bị: Tủ ấm, máy ly tâm lạnh, cân phân tích, máy vortex, ống ly tâm, micropippet, eppendorf, que cấy vòng, kim tiêm 1cc
Môi trường và hóa chất: Môi trường NA, TSA, TCBS và KF Streptococcus có bổ
sung 1,5% NaCl, tá dược FCA (Freund’s complete adjuvant) và FIA (Freund’s incomplete adjuvant) lần lượt dùng cho lần miễn dịch nguyên phát và thứ phát, cồn sát trùng 700, đệm 1X PBS pH 7,2, Formaline.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
b. Chuẩn bị vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt
Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong 100ml môi trường TSB có bổ sung 1,5%
NaCl có lắc trong 24h. Bất hoạt vi khuẩn bằng cách thêm formaline vào hỗn hợp
dịch để đạt nồng độ formaline cuối cùng là 0,5% và ủ trong 24h ở 370C. Tiến hành thu sinh khối bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút, rồi rửa cặn ba lần
trong PBS và tạo dịch huyền phù. Bảo quản qua đêm ở 40C.
c. Kiểm tra tính vô khuẩn của kháng nguyên bất hoạt
Dung dịch vi khuẩn đã bất hoạt bằng formaline sẽ được kiểm tra lại trước khi tiêm cho gà: Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã bất hoạt lần lượt trên các môi trường NA,
TSA, TCBS và KF Streptococcus có bổ sung 1,5% NaCl tiến hành cấy trang, ủ ở
370C. Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trong một tuần.
d. Tiến hành gây miễn dịch trên gà đẻ trứng
Mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù sẽ được điều chỉnh để có mật độ phù hợp dùng cho tiến hành gây miễn dịch trên gà.
Thí nghiệm được thực hiện với 4 con gà mái chia thành 2 nhóm, gồm 2 gà thí nghiệm được miễn dịch với liều vi khuẩn S. iniae bất hoạt 1,5×108 CFU (nhóm 1) và 2 gà đối chứng không được miễn dịch (nhóm 2).
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm gây tạo miễn dịch trên gà đẻ trứng
Nhóm Nhóm 1 Nhóm 2
Số con gà/nhóm (con) 2 2
Mật độ vi khuẩn đã được bất hoạt (CFU/ml) 3×108 0
Thể tích kháng nguyên/con (ml) 0,5 0
Thể tích tá dược/con (ml) 0,5 0
Gà được tiêm vào hai cánh tại bốn vị trí (2 mũi/1 cánh).
Trước khi tiêm gà dịch vi khuẩnđược vortex thật kỹ với tá dược cho đến khi thu được dung dịch nhũ hóa hoàn toàn ở dạng sữa.
Qui trình tiêm bắt đầu vào ngày 0, mỗi con gà được tiêm với 0,5 ml dịch vi
khuẩn đã được nhũ hóa trong 0,5 ml tá dược Freund hoàn toàn (Freund’s complete adjuvant). Sau 4 tuần, tiến hành tiêm nhắc lại với liều lượng vi khuẩn
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
như cũ nhưng trong 0,5 ml tá dược Freund không hoàn toàn (Freund’s incomplete adjuvant).
Trứng gà sẽ được thu nhận lại hằng ngày (có kí hiệu rõ ràng) để theo dõi sự thay đổi nồng độ IgY theo thời gian. Trứng gà được thu ngay sau khi tiêm và kéo dài trong suốt 10 tuần. Trứng được lưu trữ trong tủ lạnh cho đến khi tiến hành tách chiết.
2.4.6 Tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp Polson [17]
a. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ và thiết bị: Tủ ấm, tủ lạnh, máy ly tâm lạnh, cân phân tích, máy vortex, đũa thủy tinh, phễu, giấy lọc, túi nylon, ống ly tâm, micropippet,
eppendorf
Môi trường và hóa chất: PEG 6000, đệm 1X PBS pH 7,2, đệm Phosphate
b. Tách chiết lòng đỏ
Trứng được rửa sạch và tráng bằng nước cất trước khi tinh sạch. Trứng được
bổ đôi và loại bỏ lòng trắng trứng một cách nhẹ nhàng. Lòng đỏ trứng được rửa
với đệm PBS 3 lần để loại tối đa albumin.
Dùng đầu côn chọc thủng màng và tách màng khỏi lòng đỏ. Thu dịch lòng đỏ
vào bị nylon, bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
c. Tinh sạch kháng thể IgY theo phương pháp Polson
Hòa 2 ml lòng đỏ vào 2 ml đệm PBS pH 7,2, thêm 3 ml dung dịch PEG 7%. Hỗn hợp được khuấy cho đến khi hòa tan toàn bộ polymer. Tiến hành ly tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Dịch sau ly tâm sẽ được lọc bằng giấy lọc rồi tiếp tục cho PEG dạng bột vào tới
nồng độ 12% (w/v). Khuấy hỗn hợp cho đến khi toàn bộ polymer được hòa tan.
Ly tâm tiếp dịch trên ở 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Thu cặn chứa IgY
rồi hòa lại trong 2ml đệm phosphate và được trộn với 2 ml của dung dịch PEG 24% trong đệm cho lần kết tủa thứ hai. Hỗn hợp được voxter đến khi tan hoàn toàn. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tại 40C. Cặn sau ly tâm sẽ được
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang hòa lại trong 1 ml đệm. Kháng thể sau khi tinh sạch được bảo quản lạnh ở - 200C đến khi sử dụng.
2.4.7 Phương pháp Bradforda. Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ và thiết bị: máy vortex, ống nghiệm, pipette, quả bóp, cuvette,
micropippet, bình tia
Môi trường và hóa chất: dung dịch chuẩn bovine serum albumin (BSA), đệm
Phosphate, thuốc thử Bradford
b.Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp Bradford dựa trên sự thay đổi bước sóng cựu đại của thuốc nhuộm Coomassive Brilliant Blue G-250. Thuốc nhuộm này khi phản ứng protein sẽ tạo màu xanh và làm thay đổi bước sóng hấp thu cực đại từ
465 nm của thuốc nhuộm sang 595 nm của phức thuốc nhuộm-protein. Độ hấp
thu ở bước sóng 595 nm cũng như cường độ màu của dung dịch phức hợp tỉ lệ
với nồng độ protein trong dung dịch.
c. Dựng đường chuẩn
Lấy các ống nghiệm pha loãng dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin, 100
µg/ml) theo bảng bên dưới.
Bảng 2.3 Phương pháp pha dung dịch BSA dựng đường chuẩn
Ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Dung dịch BSA (µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Nước cất (µl) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hút 5000 µl dung dịch thuốc thử Bradford lần lượt cho vào các ống có chứa
1000 µl dịch protein vừa pha ở trên, lắc đều. Sau 20 phút đem đo dung dịch ở bước sóng 595 nm. Tại mỗi nồng độ sẽ tiến hành đo 3 lần và xác định giá trị OD
trung bình. Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (OD) theo sự biến thiên nồng độ protein chuẩn (µg/ml).
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
d. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford
Mẫu được pha loãng đến nồng độ phù hợp để cho Odmẫu.
Hút 900 µl dung dịch protein đã pha loãng và thêm vào đó 4500 µl thuốc thử
Bradford, lắc đều. Sau 20 phút đem đo OD ở bước sóng 595 nm. Với mỗi mẫu được thực hiện 3 lần , lấy giá trị OD trung bình và tính OD. Từ đường chuẩn có được suy ra nồng độ protein trong mẫu phân tích như sau:
Nồng độ IgY của mẫu = nồng độ tính toán*độ pha loãng
2.4.8 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Số liệu sau khi thu thập được phân tích và xử lý bằng phần mềm Excel với
mức ý nghĩa p<0,05. Sử dụng phép phân tích Data Analysis để đánh giá hiệu quả
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân
lập từ cá chẽm
3.1.1 Các dấu hiệu bệnh lý
Các mẫu cá bệnh được thu có một số biểu hiện chung: bơi lờ đờ, mất phương hướng, vận động khó khăn, kém linh hoạt. Khi quan sát bên ngoài thấy: màu sắc cơ
thể cá nhợt nhạt, mang tái nhợt, mắt cá bị lồi và đục, bụng trương to, trên thân có những đốm xuất huyết ở vây ngực và vây bụng. Tiến hành mổ khám bên trong thấy
rằng xoang bụng có chứa dịch màu vàng, nội tạng bị xuất huyết, thận và lách có sự gia tăng về kích thước (Hình 3.1). Các dấu hiệu bệnh lý của cá mà chúng tôi thu
được sau khi tiến hành thu mẫu và mổ khám giống với dấu hiệu bệnh do S. iniae
gây ra và phù hợp với các thông báo đã có của các nghiên cứu trước đó [3], [22].
Hình 3.1 Cá chẽm nhiễm Streptococcus iniae (a: xuất huyết ở thân, gốc vây và miệng. b: lồi và xuất huyết ở mắt. c: xuất huyết ở gan. d: sưng thận)
a b
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
3.1.2 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập
Sau khi tiến hành phân lập vi khuẩn từ các mẫu thận, não và gan trên các môi
trường NA, TSA, và KF Streptococcus. Chúng tôi thấy rằng các chủng vi khuẩn thu
được cho hai dạng khuẩn lạc đặc trưng: một dạng là khuẩn lạc không nhầy, đục và một
dạng là khuẩn lạc nhầy, trong (Hình 3.2). Kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn 2 mm sau 24h nuôi cấy.
Hình3.2 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên cá chẽm (A: khuẩn lạc
không nhầy, đục; B: khuẩn lạc nhầy, trong)
Kết quả này phù hợp với báo cáo của Nguyen và Kanai (1999) các tác giả này cho biết một số chủng vi khuẩn S. iniae cho khuẩn lạc trong suốt có tính nhầy sau
24h nuôi cấy. Nghiên cứu của Pier và các cộng sự (1987) báo cáo chủng vi khuẩn S.
iniae có hai dạng khuẩn lạc khác nhau sau 24h nuôi cấy một dạng khuẩn lạc có tính
nhầy và trong còn một dạng không nhầy và đục. Tuy nhiên theo kết quả nghiên cứu
của Pier và các cộng sự (1987) thông báo rằng khuẩn lạc nhầy có thể chuyển thành khuẩn lạc không nhầy khi kéo dài thời gian ủ.
Bên cạnh đó, kết quả nhuộm Gram các chủng vi khuẩn thu được cho thấy
chúng có hình thái dạng liên cầu khuẩn (các tế bào dính lại với nhau) và bắt màu
tím đặc điểm của nhóm vi khuẩn Gram + (Hình 3.3). Những đặc điểm này đều
giống với những đặc điểm của vi khuẩn S. iniaeđã được công bố [9],[20].
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Hình 3.3 Hình thái vi khuẩn nhuộm Gram
3.1.3 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập
Để tiến tới việc định danh vi khuẩn phân lập ngoài các đặc điểm hình thái
đã thu được chúng tôi tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của các chủng.
Đầu tiên hai phản ứng catalase và oxidase được tiến hành kiểm tra trên
các đĩa khuẩn lạc thuần. Theo hệ thống phân loại của Bergey vi khuẩn S. iniae
cho phản ứng âm tính với cả hai phản ứng này. Vì vậy, chỉ những chủng phân
lập cho kết quả âm tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase sẽ được chọn để kiểm tra tiếp khả năng dung giải máu. Theo hệ thống phân loại của Bergey
S. iniae có khả năng dung huyết α/β. Ngoài ra khi tham khảo các nghiên cứu trước đó cho thấy phản ứng dung huyết α của vi khuẩn Streptococcus iniae
được nói đến trong báo cáo của Bromage và các cộng sự (1999) và Foo và các cộng sự (1985), và phản ứng dung huyết β của S. iniaeđược nhắc đến trong báo
cáo của Perera và các cộng sự (1994) và Pier & Madin (1976) [12], [20]. Như
vậy khả năng dung giải máu của các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch máu
BA (Blood agar base) có bổ sung 5% máu cừu sẽ cho phép sàng lọc tiếp các
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Hình 3.4 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập được trên cá chẽm (bên trái – kiểu dung huyết β, bên phải- kiểu dung huyết α)
Sau khi kiểm tra, sàng lọc bằng các phản ứng catalase, oxidase và dung huyết chúng tôi thu được hai chủng vi khuẩn nghi ngờ là CR06 và CR11. Hai chủng này sẽ tiếp tục được kiểm tra các đặc điểm sinh hóa bằng bộ Kit API 20 STREP
(BioMerieux, France). Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của hai chủng vi
khuẩn được thể hiện trong Bảng 3.1 và Phụ lục 4.
Qua Bảng 3.1 chúng tôi thấy rằng những đặc điểm đặc trưng của hai chủng vi
khuẩn phân lập gồm: vi khuẩn có dạng liên cầu khuẩn, khuẩn lạc nhỏ hơn 2 mm sau 24h nuôi cấy, Gram (+), không có khả năng di động, không sinh trưởng ở điều kiện độ mặn NaCl 6,5%, cho phản ứng catalase và oxidase âm tính, có khả năng dung
huyết α/β. Các đặc điểm này rất giống với đặc điểm sinh hóa của chủng chuẩn S. iniae ATCC 29178 và phù hợp với mô tả của Pier & Madin (1976) về S. iniae [9].
Khi so sánh đặc điểm sinh hóa theo kết quả của bộ kit API 20 STREP của hai
chủng thu được và chủng chuẩn Streptococcus iniae ATCC 29178 cho thấy có sự tương đồng rất cao được thể hiện ở Bảng 3.1. Tất cả các chủng đều âm tính với các
phản ứng Voges Proskauer (VP), Hippurate (HIP), α–Galactosidase (α-GAL), β-
Glucuronidase (β-GUL), β–Galactosidase (β-GAL), Alkalin Phosphatase (PAL), L- arabinose (ARA), D-sorbitol (SOR), D-raffinose, Glycogen (GLYG) và dương tính
với các phản ứng Pyrrolidonyl acrylamidase, Leucine Aminopeptidase (LAP), D- ribose (RIB), D-manitol (MAN), Starch (AMD).
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Bảng 3.1 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm
Đặc điểm Các chủng phân lập so sánh với chủng chuẩn ATCC 29178 Bergey CR06 CR11 ATCC 29178 Nhuộm Gram + + + + Hình dạng tế bào Cầu, liên cầu Cầu, liên cầu Cầu, liên cầu Cầu, liên cầu Sinh Catalase - - - - Sinh Oxidase - - - - Voges Proskauer (VP) - - - ND
Dung huyết (5% máu cừu) α/β α/β Β α/β
Môi trường BHIA + + +
TSA + + + TSB + + + BA + + + Nhiệt độ sinh trưởng 100C - - - - 270C + + + + 350C + + + + NaCl 6,5% - - - - Hippurate (HIP) - - - - Esculin (ESC) + + + + Pyrrolidonyl acrylamidase + + + ND α–Galactosidase (α-GAL) - - - ND β-Glucuronidase (β-GUL) - - - ND β – Galactosidase (β-GAL) - - -
Alkalin Phosphatase (PAL) - - - ND
Leucine Aminopeptidase (LAP) + + + +
L-arginie (ADH) - - + ND D-ribose (RIB) + + + ND L-arabibose (ARA) - - - D-manitol (MAN) + + + + D-sorbitol (SOR) - - - - D-lactase - - - - D-trehalose + - + + Inulin - - - - D-raffinose - - - - Starch (AMD) + + + Glycogen (GLYG) - - -
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang Sự khác nhau giữa các chủng được thể hiện ở 2 phản ứng L-arginine dihydrolase (ADH) và D-trehalose. Đối với phản ứng L-arginine dihydrolase, hai chủng phân lập CR06 và CR11 cho kết quả âm tính trong khi đó chủng chuẩn cho
kết quả dương tính. Trong hệ thống phân loại của Bergey, thì phản ứng ADH không
được kiểm tra tuy nhiên khi tham khảo nghiên cứu của Barnes & Ellis (2003) có báo cáo rằngS. iniae phân lập từ các địa điểm khác nhau ở Mỹ có thể cho phản ứng dương tính hoặc âm tính với ADH hoặc cũng có thể cho phản ứng trung tính với
ADH không nhất thiết phải là một dạng phản ứng, và phản ứng âm tính với ADH
được coi là một dạng biến thể của S. iniae. Dựa vào phản ứng với ADH thì Barnes & Ellis (2003) đưa ra phân loại S. iniae theo phản ứng huyết thanh thành 2 nhóm serotype I và serotype II, với serotype I là S. iniae cho phản ứng dương tính với L- arginine dihydrolase và serotype II là S. iniae cho phản ứng âm tính với L-arginine dihydrolase [5]. Hai phản ứng huyết thanh học của S. iniae cũng được Pier và các cộng sự (1978) nói đến [9]. Phản ứng âm tính của S. iniae với L-arginine dihydrolase cũng đã được Susanna và các cộng sự (2002) báo cáo [18].
Như vậy, dựa vào phản ứng L-arginine dihydrolase các chủng vi khuẩn phân lập được chia thành 2 nhóm: Chủng CR06 và chủng CR11 được xếp vào nhóm vi khuẩn S. iniae serotype II trong khi chủng chuẩn ATCC 29178 được xếp vào nhóm vi khuẩn S. iniae serotype I.
Với phản ứng D - trehalose, chủng CR06 và chủng chuẩn cho phản ứng dương tính với D - trehalose, kết quả này tương tự trong hệ thống phân loại của
Bergey. Tuy nhiên, chủng CR11 cho phản ứng âm tính với D - trehalose, kết quả
này cũng đã được thông báo trước đó bởi Kusuda và các cộng sự (1976) [9].
Chúng tôi cũng đã tiến hành định danh vi khuẩn bằng phần mềm định danh vi
khuẩn API dựa trên các kết quả của test sinh hóa. Tuy nhiên, việc định danh hai
chủng vi khuẩn bằng phần mềm định danh này không thành công (unceptable profile). Khi tham khảo các tài liệu khác, chúng tôi thấy rằng Suanyuk và các cộng sự
(2010) và Lau và các cộng sự (2002) cũng thông báo rằng, không thành công trong