Nghiên cứu ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong vi nhân giống cây hồng môn (Anthurium andraeanum) từ mô lá

Quá trình nhân giống in vitro bị ảnh hưởng rất nhiều yếu tố như thành phần môi trường, nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng, yếu tố vật lý, nguồn vật liệu ban đầu…Một số nghiên cứu trướ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG



NGUYỄN TIẾN GIA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT TRONG VI NHÂN GIỐNG

CÂY HỒNG MÔN (Anthurium andraeanum) TỪ MÔ LÁ

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CỤM TỪ VIẾT TẮT ……… i

DANH MỤC CÁC BẢNG ……… ii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ……… iv

DANH MỤC CÁC HÌNH ……… v

LỜI MỞ ĐẦU ……… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……… 3

1.1 Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ……… 3

1.1.1 Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật … 3

1.1.2 Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật … 4 1.1.2.1 Tính toàn năng của tế bào ……… 4

1.1.2.2 Sự phân hóa, phản phân hóa của tế bào ……… 4

1.1.3 Ưu và nhược điểm của nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật ……… 5

1.1.3.1 Ưu điểm ……… 5

1.1.3.2 Nhược điểm ……… 6

1.1.4 Các kỹ thuật thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật … 6

1.1.4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ……… 6

1.1.4.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời ……… 7

1.1.4.3 Nuôi cấy mô sẹo ……… 8

1.1.4.4 Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ……… 9

1.1.4.5 Nuôi cấy tế bào đơn ……… 9

1.1.4.6 Nuôi cấy protoplast ……… 10

1.1.5 Các giai đoạn nhân giống in vitro ……… 10

1.1.5.1 Giai đoạn 1: Chuẩn bị ……… ……… 10

1.1.5.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu cấy……… 11

1.1.5.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh ……… 11

1.1.5.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh ……… 12

1.1.5.5 Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiện … 12

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô thực vật ………… 13

1.2.1 Môi trường nuôi cấy ……… 13

1.2.1.1 Khoáng đa lượng ……… 13

1.2.1.2 Khoáng vi lượng ……… 15

1.2.1.3 Nguồn cacbon hữu cơ ……… 15

1.2.1.4 Các vitamin ……… 16

1.2.1.5 Các amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác ………… 16

1.2.1.6 Các chất bổ sung ……… 17

1.2.1.7 pH môi trường ……… 18

1.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ……… 18

1.2.2.1 Cơ sở lý thuyết của việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng …… 18

1.2.2.2 Nhóm auxin ……… 19

1.2.2.3 Nhóm cytokinine ……… 20

1.2.2.4 Nhóm gibberelline ……… 21

1.2.2.5 Abscisic acid ……….……… 22

1.2.2.6 Nhóm ethylene ……… 23

1.2.3 Vật liệu nuôi cấy ……… 23

1.2.4 Điều kiện vô trùng ……… 24

1.2.5 Điều kiện nuôi cấy ……… 25

1.2.5.1 Nhiệt độ ……… 25

1.2.5.2 Ánh sáng ……… 26

1.3 Giới thiệu về cây Hồng môn (Anthurim andreanum) ……… 26

1.3.1 Nguồn gốc và phân loại ……… 26

1.3.2 Đặc điểm thực vật học ……… 27

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh thái ……… 29

1.3.4 Tình hình nghiên cứu cây hồng môn ……… 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 33

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu ………… 33

2.2 Vật liệu nghiên cứu ……… 33

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu ……… 33

2.2.3 Môi trường nuôi cấy ……… 33

2.2.4 Điều kiện nuôi cấy ……… 34

2.3 Nội dung nghiên cứu ……… 34

2.4 Phương pháp nghiên cứu ……… 35

2.4.1 Bố trí thí nghiệm ……… 35

2.4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian đến hiệu quả khử mẫu ……… 36

2.4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D, sự kết hợp giữa 2,4-D với BA và đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ……… 37

2.4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và Ki đến quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo ……… 38

2.4.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Ki và NAA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi ……… 39

2.4.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ ……… 40

2.4.2 Phương pháp tiến hành ……… 41

2.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu ……… 41

2.4.2.2 Phương pháp xử lý khử trùng mẫu ……… 41

2.4.2.1 Phương pháp cấy mẫu ……… 42

2.4.3 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định ……… 42

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu ……… 44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……… 45

3.1 Nghiên cứu quy trình khử trùng mẫu ……… 45

3.2 Nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo mô sẹo ……… 49

3.3 Nghiên cứu quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo ……… 55

3.4 Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi ……… 59

3.5 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh ……… 66

3.6 Đề xuất quy trình vi nhân giống Hồng môn ……… 71

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… 74

4.1 Kết luận ……… 74

4.2 Kiến nghị ……… 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 75 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CỤM TỪ VIẾT TẮT

4 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình

5 Bảng 2.5 Ảnh hưởng của Ki lên khả năng tái sinh chồi từ mô

14 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình

cảm ứng tạo mô sẹo sau 10 tuần nuôi cấy 51

15 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của Ki lên khả năng tái sinh chồi của từ mô

16

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi của từ

17 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng nhân nhanh 60

18 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của BA và Ki lên khả năng nhân nhanh

19 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của BA, Ki và NAA lên khả năng nhân

20 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng

ra rễ của Hồng môn sau 4 tuần 67

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

1 Biểu đồ 3.1 Hiệu quả khử trùng với tỷ lệ javen: nước và thời gian

2 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ tạo mô sẹo dưới tác động của 2,4-D và BA 51

3 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của BA và Ki đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô

6 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến chiều dài và

số rễ trung bình ở cây Hồng môn 68

DANH MỤC HÌNH

6 Hình 3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình

cảm ứng tạo mô sẹo sau 10 tuần nuôi cấy 53

7 Hình 3.3 Quá trình hình thành mô sẹo trên mẫu lá 54

8

Hình 3.4 Hình thái cụm chồi khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung

9 Hình 3.5 Ảnh hưởng của BA khả năng tái sinh chồi của từ mô sẹo 58

10 Hình 3.6 Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA trong quá trình tái

Đà Lạt, Di Linh, Bảo Lộc và Hà Nội; và trở thành mặt hàng tiêu thụ nhanh trên thị trường

Khả năng nhân giống của Hồng môn trong tự nhiên rất thấp, chỉ đạt 1-3 cây con/cây mẹ trong một năm, nên khi sản xuất với quy mô lớn sẽ gặp khó khăn về nguồn giống Tại một số nước có nền công nghiệp trồng Hồng môn phát triển, nguồn giống Hồng môn được chủ động hoàn toàn thông qua việc sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô Nhờ có phương pháp nuôi cấy mô đã ra một số lượng lớn cây giống đồng nhất, chất lượng, sạch bệnh và chủ động nguồn giống phục vụ sản xuất quanh năm

Quá trình nhân giống in vitro bị ảnh hưởng rất nhiều yếu tố như thành phần môi trường, nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng, yếu tố vật lý, nguồn vật liệu ban đầu…Một số nghiên cứu trước đây cho thấy, việc nhân giống Hông môn thành công cao nhất từ mẫu lá non của cây phải trải qua nhiều giai đoạn khác nhau: mô sẹo, tái sinh chồi và phát triển thành cây hoàn chỉnh Quá trình phát triển hình thái qua các giai đoạn nhân giống chịu sự tác động của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật Mỗi giai đoạn phụ thuộc vào loại chất điều hoà sinh trưởng và nồng độ khác nhau

Chính vì vậy, để tìm hiểu mức độ tác động của chúng đến các giai đoạn nhân

giống của cây Hồng môn, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu ảnh hưởng các chất

điều hòa sinh trưởng thực vật trong vi nhân giống cây Hồng môn (Anthurium

andraeanum) từ mô lá”, trên cơ sở kết quả nghiên cứu này xây dựng quy trình

nhân giống in vitro và áp dụng trong điều kiện thực tế

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật

1.1.1 Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là phạm trù khái niệm cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [8]

Quá trình hình thành cơ quan in vitro chịu sự tác động trực tiếp từ 3 nhân tố: môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy

mô, con người đã nhân giống các loại thực vật nhanh hơn gấp nhiều lần so với trong

tự nhiên, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ

và rút ngắn thời gian đưa một giống mới phục vụ sản xuất với quy mô lớn

Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loại thực vật, giúp mở ra những hướng nghiên cứu mới về sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến và nhiều vấn đề sinh học khác…

1.1.2 Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật

1.1.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng của tế bào

Gottlibeb Haberlandt (1902) – nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời” Theo ông:

“Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di

truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”

Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy

mô thương mại bằng cách nuôi cấy mô trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn

1.1.2.2 Sự phân hóa, phản phân hóa của tế bào

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau

Sự phản phân hóa là quá trình ngược lại với quá trình phân hóa, tức là tế bào

đã phân hóa thành mô chức năng không hòa toàn mất đi khả năng phân chia mà trong một điều kiện thích hợp nhất định chúng có thể quay về dạng phôi sinh và tái phân chia

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực chất là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa Các quá trình có thể tóm tắt như sau:

Sơ đồ 1 Quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen nhất định được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị ức chế) cho ta tính trạng mới, một số khác bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào, làm cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác trong khối mô bình thường tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh Khi tế bào được tách riêng rẽ, sự ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen sẽ được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một chương trình định sẵn [11]

1.1.3 Ưu và nhược điểm của nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào ở thực vật [7], [8]

1.1.3.1 Ưu điểm

Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền

Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

Tiết kiệm không gian: các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu

để loại trừ virus, vi khuẩn, nấm khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15-25% so với giống được thực hiện bằng phương pháp nhân giống thông thường

Chủ động trong việc lưu trữ, bảo quản nguồn gen quý hiếm mà các kỹ thuật trong tự nhiên khó áp dụng

Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa

dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế

Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ, chủ động trong sản xuất vì được thực hiện trong phòng thí nghiệm [3]

1.1.3.2 Nhược điểm

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền [3]

1.1.4 Các kỹ thuật thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Trong nuôi cấy in vitro, một phương pháp thường được sử dụng để tạo những giống hoàn toàn sạch virus là phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Hiểu

một cách đúng nghĩa thì nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,1 –0,15mm tính từ chóp sinh trưởng Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường không cao [3], [9]

Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ lệ sống và tính ổn định giảm

Trên thực tế người ta thường nuôi cả đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát

triển thành cây hoàn chỉnh

1.1.4.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường

và các muối của các nguyên tố đa lượng ( N, P, K, Ca) và vi lượng ( Mg, Fe, Mn,

Co, Zn, ) Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3, .) và các chất điều hoà sinh trưởng

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acid amine, đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này [3]

1.1.4.3 Nuôi cấy mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…

Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ quan phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hoà sinh trưởng thực vật…) Sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường mới theo chu kỳ Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…

Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên Nhìn chung quá trình tạo mô sẹo in vitro trải qua 3 quá trình:

- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi

- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn song

tử diệp dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin thậm chí không cần auxin ngoại sinh như ở các loài cây cỏ hay dây leo

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được

ưu tiên áp dụng ở đơn tử diệp, vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản phân hoá so với song tử diệp

Nồng độ và loại chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo Thường

mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin, hàm lượng hormone nội sinh

và chiều di chuyển của các hormone này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát

sinh mô sẹo, có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây

Ngoài ra, quá trình tạo mô sẹo còn phụ thuộc vào nguồn mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy [3]

1.1.4.4 Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn dựa trên cơ sở đơn tính đực, người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phân đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội

Thực vật hạt kín, mỗi chồi hoa có thể chứa các bao phấn ở các giai đoạn khác nhau Vì vậy mỗi chồi hoa phải kiểm tra để xác định tất cả các giai đoạn phát triển giúp lựa chọn những bao phấn có độ tuổi phù hợp cho nuôi cấy

Các phương pháp nuôi cấy bao phấn và hạt phấn:

- Nuôi cấy bao phấn trên môi trường đặc: mô sẹo và cây đơn bội xuất hiện trên bề mặt bao phấn

- Nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng và lắc: hạt phấn giải phóng vào môi trường, mô sẹo và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn

- Nuôi cấy hạt phấn tách rời trong môi trường lỏng và lắc hoặc trong môi trường bán lỏng: mô sẹo và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn

1.1.4.5 Nuôi cấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp Những công trình về nuôi cấy

tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau

Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hoá của tế bào Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào

1.1.4.6 Nuôi cấy protoplast

Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960) Ông

là người đầu tiên dùng enzyme để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ

tế bào rễ cà chua Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành

tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene [3]

1.1.5 Các giai đoạn nhân giống in vitro

1.1.5.1 Giai đoạn 1: Chuẩn bị

Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là tạo ra nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy Khâu này có thể coi như một bước thuần hóa vật liệu nuôi cấy, vì cây giống sẽ được đưa ra khỏi môi trường sống tự nhiên để thích ứng với môi trường mới

Khi chọn cây giống cần lưu ý một số điểm như sau: cây mẹ để lấy mẫu thường

là cây có đặc tính ưu việt, khỏe, sạch bệnh, chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi, đoạn thân có chồi ngủ, nụ hoa, lá v.v…mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định

Khi đã có nguồn nguyên liệu ta tiến hành xử lí mẫu cấy trong những điều kiện

vô trùng để đảm bảo nguồn mẫu sạch cho quy trình nhân giống Trong nuôi cấy mô người ta thường sử dụng một số loại hóa chất như: HgCl2 0,1%, cồn 700, H2O2, Ca(OCl)2,… để khử trùng mẫu cấy Tùy thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy mà lựa chọn hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp

1.1.5.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp

Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình tam giác Các mẫu nuôi cấy thành công sẽ được lưu giữ trong phòng ở những điều kiện phù hợp Sau một thời gian nhất định, mẫu cấy có thể tạo mô sẹo hoặc tái sinh chồi

Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau:

- Tỷ lệ nhiễm thấp

- Tỷ lệ sống cao

- Tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả bước này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu Quan trọng nhất vẫn

là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ…

Thời gian nuôi cấy ở giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần

1.1.5.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao Vì vậy giai đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống

Giai đoạn này sẽ kích thích mô cấy phát sinh nhiều chồi mầm để cung cấp cho các giai đoạn sau, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích nhân nhanh

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như:

- Bổ sung tổ hợp các chất điều hóa sinh trưởng mới (tăng cytokinine giảm auxin) Tăng tỷ lệ auxin/cytokinine sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi

- Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1000 lux

- Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30oC

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất nhưng không ảnh hưởng tới sức sống và bản chất di truyền của cây

1.1.5.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Ở một số loài khác, các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất Giai đoạn này thông thường cần 2 - 8 tuần

1.1.5.5 Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiện

Đây là giai đoạn đầu tiên, trong đó cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Đối với một số loài có thể chuyển chồi chưa có rễ ra đất, nhưng đa số chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra vườn ươm Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây cần

sự chăm sóc đặc biệt Vì cây chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu cầu:

- Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ ẩm và làm mát

- Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc mùn cưa, tro, rêu, rễ cây,… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần

Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và tránh những yếu tố bất lợi sau:

- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô

- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn

- Cháy lá do nắng

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô thực vật

1.2.1 Môi trường nuôi cấy

1.2.1.1 Khoáng đa lượng

Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy Nói chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trường ít nhất là

300 ppm (30 mg/l) Chúng là nguyên liệu để tế bào xây dựng nên các thành phần cấu trúc của mình [3]

3), nitrat amon (NH

Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc

NH4NO3 Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3 Tổng

nồng độ của NO3+ và NH4+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu [8]

- Phospho (P):

Photpho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nuclêic và tham gia cấu trúc của màng

Trong môi trường nuôi cấy, Photpho được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium

Phospho ở dạng HPO

4

2- được hấp thụ nhờ hệ thống rễ của thực vật và ngược lại với nitrat, sunfat, nó không bị khử [3]

- Lưu huỳnh (S):

Lưu huỳnh như SO

4

2- được hấp thụ ở rễ cây với tốc độ chậm Giống như nitrat, lưu huỳnh phải được khử trước khi sử dụng để sinh tổng hợp các hợp chất có chứa lưu huỳnh như amino axít, protein và enzym Lưu huỳnh ở dạng chưa khử được kết hợp trong các sulpholipide và các polysaccharide [3]

- Kali (K):

K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước [3]

K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3, KCl 6H2O, KH2PO4 [1].

- Canxi (Ca):

Calcium cũng là một cation chủ yếu giúp cân bằng các anion trong cây nhưng cách thức không giống như K+ và Mg+ vì Ca2+ không phải là ion linh động Calciun có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào Sự hoạt động của nhiều enzim khác của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca2+ vì calcium là đồng yếu tố với những enzim phân giải ATP [3]

Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin [7]

Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào Số lượng lớn

Ca2+ gắn trên thành tế bào đóng vai trò chủ yếu trong củng cố độ vững chắc cho thành tế bào và điều hoà cấu trúc màng tế bào [3]

1.2.1.3 Nguồn cacbon hữu cơ

Sự quang hợp ở mô và tế bào nuôi cấy, thường bị hạn chế, nên trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung nguồn cacbon để mô tăng trưởng Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường (đóng góp 50 – 70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường [7]) Đường saccharose là loại được sử dụng phổ biến nhất với liều lượng 20 – 30 g/l, tùy thuộc vào đối tượng nuôi cấy Trong một số trường hợp đặc biệt, có thể dùng các nguồn đường khác như glucose, maltose, galactose,

1.2.1.4 Các vitamin

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol

Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HCl (B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic acid, trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được

sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật Các vitamin khác như biotin, acid forlic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy

Inositol thường được nói đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật [3]

1.2.1.5 Các amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác [3]

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự

bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của

tế bào Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ

Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-

asparagine và adenine Casein hydrolysate nói chung được sử dụng với nồng độ 0,05-0,1% Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưởng của tế bào

1.2.1.6 Các chất bổ sung

Nước dừa

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996) Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Nước dừa thường được lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản

Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v) [3]

Dịch nghiền một số loại rau, quả tươi

Dịch nghiền một số loại rau, quả tươi như khoai tây, cà rốt, chuối, táo,…cung cấp các thành phần hóa học: acid nucleic, acid amin, vitamin, khoáng,…

Dịch thủy phân casein hay pepton

Dịch thủy phân casein hay pepton chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung acid amin

Agar

Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết vì thiếu ôxy Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại bằng agar (đây là một loại tinh bột được chế từ rong biển) và mô được cấy trên bề mặt của môi trường Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1%

Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc Than hoạt tính có tác dụng hút các hợp chất cản, các chất điều hòa sinh trưởng hoặc các chất làm đen môi trường do nó kết hợp với các hợp chất

phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường vì NAA, Ki, IAA, BAP, 2iP có khả năng liên kết với than hoạt tính

Ngoài ra, than hoạt tính còn có tác dụng làm xốp môi trường nuôi cấy và giúp quá trình tạo rễ nhanh chóng

Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5-3% (w/v)

1.2.1.7 pH môi trường

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy, lựa chọn pH tối ưu là rất cần thiết trong nuôi cấy in vitro

pH môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây dao động từ 5,5 – 6,0 Trường hợp pH thấp hơn 5,5 thạch có thể không đông sau khi hấp khử trùng môi trường, còn lớn hơn 6,0 agar sẽ rất cứng Khi pH < 4 và pH > 7 sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ làm chết mẫu

1.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

1.2.2.1 Cơ sở lý thuyết của việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật [3]

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau, được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ phận nhất định của cây để điều hòa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, các bộ phận trong

cơ thể thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hóa mô, phát sinh phôi, tác động lên chức năng của DNA và RNA, ảnh hưởng lớn đến các quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá trình sinh

tổng hợp enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp,… Do đó, chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng, phát triển của cây và là yếu tố quan trong nhất trong môi trường quyết định kết quả nuôi cấy

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật bao gồm: Nhóm auxin, nhóm cytokinine, gibbereline, acia abscisic, ethylene

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các

hệ thống nuôi cấy Theo Murashige (1980), quá trình phân hóa chồi phụ thuộc vào

tỷ lệ auxin và cytokinine trong môi trường nuôi cấy Nếu tỷ lệ cytokinine/auxin cao

sẽ kích thích sự hình thành chồi, thấp sẽ kích thích sự hình thành rễ và nếu tỷ lệ này

ở mức độ cân bằng thì thì sẽ thuận lợi cho quá trình hình thành mô sẹo

1.2.2.2 Nhóm các auxin [3], [4]

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như:

IAA: 1H- indole-3-acetic acid

NAA: 1-naphthaleneacetic acid

IBA: 1H-indole-3-butyric acid

2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin không có tác dụng

Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormonee thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn

Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất trương Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ

Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, tạo phôi vô tính, tạo rễ,…

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinine

Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào tạo sẹo và phân hóa rễ Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA, NAA, 2,4-D Trong đó, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng trong việc đẩy nhanh quá trình tạo chồi 2,4-D rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển mô sẹo

1.2.2.3 Nhóm cytokinine [3], [4]

Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là:

BAP: 6-benzylaminopurine BA: 6-benzyladenin

2-iP: 6---dimethyl-aminopurine Kinetine: N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine Zeatin: 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine Trong đó Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetine là các cytokinine nhân tạo

Các cytokinine là dẫn xuất của adenine, đây là những hormonee liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô

Các cytokine thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:

- BA là một cytokinine tổng hợp có tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển chồi phổ biến và trong một số trường hợp BA là một chất không thể thay thế

- Kinetine kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế ở các mô không phân hóa

- Zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin Trong thực tiễn nuôi cấy mô người

ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetine hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là BAP

Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetine và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất

Chức năng chủ yếu của các cytokinine được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberelline chưa thật rõ ràng Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó

Gibberelline có các chức năng cơ bản sau:

- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit

- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun gibberelline, kéo dài đốt thân Các cây lùn thường bị thiếu gibberelline

- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch

- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi Năm đầu thân mầm nằm in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa

- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt

- Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi

1.2.2.5 Abscisic acid (ABA) [3], [4]

ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng

ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy

và mang lại hiệu quả nhất định

Trong nuôi cấy mô và tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích

sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật

Các tác dụng cơ bản của ABA là:

- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả

- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng

- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt

- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành

- Gây ra sự đóng khí khổng

1.2.2.6 Ethylene [3], [4]

Các chức năng cơ bản của ethylene:

- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả

- Làm chín quả

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh

- Điều khiển sự chín của một số loại quả

- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene

- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá

1.2.3 Vật liệu nuôi cấy

Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non , khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormone thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa rễ, thân, cành, lá, rất khác nhau Do đó, kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy

có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu được kết quả, hoặc thu được những cây không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngừng phát triển ở

một giai đoạn nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến chồi bên và mô phân sinh đỉnh

1.2.4 Điều kiện vô trùng

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Do đó tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật Nếu môi trường nuôi cấy

bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, buộc phải loại bỏ thí nghiệm vì mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần trong điều kiện này

Để đảm điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:

- Vô trùng mô cấy

- Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy

- Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy

Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng hóa chất có hoạt tính diệt nấm, vi khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian

xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của mô cấy Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề

mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol, cồn 70% [23]

vô trùng lên mô cấy (Trần Văn Minh, 2004) Để tăng hiệu quả khử trùng người ta thường kết hợp nhiều loại hóa chất khác nhau

1.2.5 Điều kiện nuôi cấy

1.2.5.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mô Ảnh hưởng của nhiệt độ bên trong và bên ngoài Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung, ngoài ra

nó còn ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của từng tế bào riêng rẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô in vitro, mỗi một loài có biên nhiệt độ thích nghi khác nhau Nhiệt độ được hạn chế trong hệ thống nuôi cấy nên mô nuôi cấy sẽ dễ thích nghi hơn với môi trường Nhiệt độ thích hợp nhất cho nuôi cấy in vitro chưa được xác đinh chính xác, nhưng nhiệt độ phòng nuôi cấy khoảng từ 20 – 270C là được sử dụng nhiều nhất

1.2.5.2 Ánh sáng

Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phân hóa của mô và hình thái của cây Các chỉ tiêu cần chú ý là: cường độ ánh sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng

Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh trưởng và sự hình thành các cơ quan của mô cấy Cường độ ánh sáng trong phòng thí nghiệm thường

ức chế sinh trưởng chiều cao nhưng tốt đối với sự sinh trưởng của mô sẹo

1.3 Giới thiệu về cây hồng môn (Anthurim andreanum)

1.3.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật

Họ Ráy hoặc họ Môn, họ Chân bê là một họ thực vật một lá mầm, trong đó hoa của chúng được sinh ra theo một kiểu cụm hoa được gọi là bông mo Họ này có

107 chi và trên 3.700 loài Hồng môn, được nhập nội vào Việt Nam có khoảng 30 chi và 130-140 loài thuộc họ Ráy

- Cây Hồng Môn mọc thành bụi, sống lâu năm, thân ngắn Lá mọc tập trung trên mặt đất, dạng bầu dục thuôn nhọn đầu rộng từ 5 – 7 cm, dài 7 -12 cm, gốc tim, cuống dài cong, kích thước trung bình của cuống lá dài từ 20 – 30 cm, rũ xuống Lá màu xanh bóng dài, nổi bật gân chân vịt màu xanh nhạt

- Hoa mọc ra từ nách lá, hoa có cấu tạo đặc trưng gồm một cuống hoa dài, trên có một bản to hình trái tim, có thể có màu đỏ, hồng, cam, trắng…,quả mọng,sự biến thái sắc màu của hoa Tiểu Hồng Môn rất kì diệu Khi hoa còn non thì màu rực

rỡ, khi hoa trưởng thành thì màu nhạt hơn và khi hoa già thì màu hồng chuyển sang bạc màu pha lục của lá cây.Vì vậy trên một cây Hồng Môn thì hoa có nhiều sắc độ màu khác nhau Khi hoa bung ra hết cỡ thì chiều rộng trung bình của hòa 3 – 5 cm

và dài từ 4 – 6 cm

Hình 1.3 Các sắc thái của hoa Hồng môn

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh thái

Cây Hồng Môn là cây chịu bóng râm (ánh nắng bán phần), Loại cây này nhân giống dễ dàng bằng cách tách bụi Các loại Hồng Môn nói chung là thích sống theo bụi, nên khi nó nhảy ra 1- 2 con mà tách ra là cây mẹ bị suy rất lâu phát triển Nên muốn tách cây con thì chọn bụi nào có khoảng từ 3 - 5 con thì tách ra 1 con để nuôi riêng

Cây Hồng môn cho hoa quanh năm, thời gian giữa hai lần ra hoa dài hay ngắn phụ thuộc vào sự thay đổi môi trường sống Vào mùa hè, cây ra hoa nhiều hơn

do nhiều ánh sáng và nhiệt độ cao hơn

Cây Tiểu Hồng Môn có nhu cầu nước trung bình, ưa khí hậu mát ẩm

1.3.4 Tình hình nghiên cứu cây hồng môn

1.3.4.1 Tình hình ngoài nước

Hoa Hồng môn đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và đã tiến hành nhiều nghiên cứu, nhân giống hồng môn và đã thu được nhiều kết quả đáng

kể Dưới đây là một số kết quả thu được trong thời gian gần đây

Năm 2007, Judith Viegas và cs đã sử dụng mô lá non để cảm ứng tạo mô sẹo trên môi trường ½ MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l BAP, mô sẹo hình thành sau 56 ngày nuôi cấy với tỷ lệ là 45,7% 99% mô sẹo tái sinh chồi sau 70 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BAP Môi trường ra rễ được sử dụng ở nghiên cứu này là MS bổ sung thêm 0,25 mg/l NAA và 0,04% than hoạt tính 100% cây giống sau khi đưa ra vườn ươm để sinh trưởng và phát triển tốt

Năm 2009, Jahan MT và cs đã tiến hành thành công thí nghiệm nhân giống

vô tính trong ống nghiệm Hồng môn bằng phương pháp nuôi cấy mô sẹo Ở nghiên cứu này, vật liệu được sử dụng để tạo mô sẹo là mẫu lá non và quả Để cảm ứng tạo

mô sẹo, mẫu được nuôi cấy trong điều kiện tối, trên môi trường N6 bổ sung 0,2