ABA thuộc nhĩm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đĩng khí khổng.
ABA cịn cĩ tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào mơi trường nuơi cấy và mang lại hiệu quả nhất định.
Trong nuơi cấy mơ và tế bào, ABA cĩ tác dụng tạo phơi vơ tính, kích thích sự chín của phơi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều lồi thực vật.
Các tác dụng cơ bản của ABA là:
- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả.
- ABA thường được sản sinh khi cĩ các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đĩng băng.
- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt.
- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm sốt sự kéo dài thân cành. - Gây ra sự đĩng khí khổng.
1.2.2.6. Ethylene [3], [4].
Các chức năng cơ bản của ethylene:
- Gây già hố lá, kích thích sự rụng lá và quả. - Làm chín quả.
- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hố, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh.
- Điều khiển sự chín của một số loại quả.
- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xồi, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene.
- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hố của hoa và lá
1.2.3. Vật liệu nuơi cấy.
Theo lý thuyết tất cả các mơ chưa hĩa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mơ phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phơi đang phát triển, thịt quả non..., khi đặt vào mơi trường cĩ chứa một lượng hormone thích hợp đều cĩ khả năng tạo mơ sẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mơ khác nhau cĩ khả năng tạo mơ sẹo, phân hĩa rễ, thân, cành, lá,...rất khác nhau. Do đĩ, kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuơi cấy. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuơi cấy cĩ vai trị quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ khơng thu được kết quả, hoặc thu được những cây khơng phát triển mạnh, thậm chí cây cĩ thể ngừng phát triển ở
một giai đoạn nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vơ tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến chồi bên và mơ phân sinh đỉnh.
1.2.4. Điều kiện vơ trùng.
Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ chứa đường, muối khống và vitamin, thích hợp cho các lồi nấm, vi khuẩn phát triển. Do đĩ tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu mơi trường nuơi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần tồn bộ bề mặt mơi trường nuơi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, buộc phải loại bỏ thí nghiệm vì mơ nuơi cấy sẽ khơng phát triển và chết dần trong điều kiện này.
Để đảm điều kiện vơ trùng trong quá trình nuơi cấy địi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:
- Vơ trùng mơ cấy.
- Vơ trùng dụng cụ thủy tinh, mơi trường và nút đậy.
- Trong thao tác nuơi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt mơi trường nuơi cấy.
Mơ cấy cĩ thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với mơi trường bên ngồi mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vơ trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng hĩa chất cĩ hoạt tính diệt nấm, vi khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mơ cấy. Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng khơng triệt để và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của mơ cấy. Ngồi ra, người ta cịn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol, cồn 70%...[23]
Bảng 1.1. Một số hĩa chất khử trùng thơng dụng [5] STT Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) 1 Calcium hypocholorite 9 - 10 5 - 30 2 Sodium hypocholorite 0.5 - 5 5 - 30 3 Hydrogen peroxide 3 - 12 5 - 15 4 Bromine water 1 - 2 2 - 10 5 Ethyl alcohol 70 - 95 0.1 - 5.0 6 Silver nitrate 1 5 - 30 7 Murcuric choloride 0.1 - 1.0 2 - 10 8 Benzalkonium choloride 0.01 - 0.1 5 - 20 9 Antibiotics 4 - 50 mg/l 30 - 60
Trong quá trình xử lý mơi cấy phải ngập hồn tồn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn, với các bộ phận cĩ bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch xà phịng và rửa lại dưới vịi nước chảy. Sau khi xử lý xong, mơ nuơi cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vơ trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vơ trùng trước khi đặt lên mơi trường nuơi cấy nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vơ trùng lên mơ cấy (Trần Văn Minh, 2004). Để tăng hiệu quả khử trùng người ta thường kết hợp nhiều loại hĩa chất khác nhau.
1.2.5. Điều kiện nuơi cấy. 1.2.5.1. Nhiệt độ. 1.2.5.1. Nhiệt độ.
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mơ. Ảnh hưởng của nhiệt độ bên trong và bên ngồi. Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nĩi chung, ngồi ra nĩ cịn ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của từng tế bào riêng rẻ và khả năng tạo các cơ quan của mơ nuơi cấy.
Trong nuơi cấy mơ in vitro, mỗi một lồi cĩ biên nhiệt độ thích nghi khác nhau. Nhiệt độ được hạn chế trong hệ thống nuơi cấy nên mơ nuơi cấy sẽ dễ thích nghi hơn với mơi trường. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nuơi cấy in vitro chưa được xác đinh chính xác, nhưng nhiệt độ phịng nuơi cấy khoảng từ 20 – 270C là được sử dụng nhiều nhất.
1.2.5.2. Ánh sáng.
Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phân hĩa của mơ và hình thái của cây. Các chỉ tiêu cần chú ý là: cường độ ánh sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh trưởng và sự hình thành các cơ quan của mơ cấy. Cường độ ánh sáng trong phịng thí nghiệm thường ở mức 2000-3000 lux.
Chu kỳ chiếu sáng cũng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình phát triển cây. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các lồi cây là 12 – 16 giờ/ngày.
Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khơng nhỏ đến quá trình sinh trưởng của mơ cấy và cĩ liên quan đến sự thay đổi nồng độ hormone nội sinh. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, cịn ánh sáng xanh sẽ ức chế sinh trưởng chiều cao nhưng tốt đối với sự sinh trưởng của mơ sẹo.
1.3. Giới thiệu về cây hồng mơn (Anthurim andreanum).
1.3.1. Nguồn gốc và phân loại thực vật.
Giới: Plantae Bộ: Alismatales Họ: Araceae Chi: Anthurium
Họ Ráy hoặc họ Mơn, họ Chân bê là một họ thực vật một lá mầm, trong đĩ hoa của chúng được sinh ra theo một kiểu cụm hoa được gọi là bơng mo. Họ này cĩ 107 chi và trên 3.700 lồi. Hồng mơn, được nhập nội vào Việt Nam cĩ khoảng 30 chi và 130-140 lồi thuộc họ Ráy.
1.3.2. Đặc điểm thực vật học.
Đặc điểm hình thái:
Hình 1.1. Cây Hồng mơn Anthurium andraeanum.
- Cây Hồng Mơn mọc thành bụi, sống lâu năm, thân ngắn. Lá mọc tập trung trên mặt đất, dạng bầu dục thuơn nhọn đầu rộng từ 5 – 7 cm, dài 7 -12 cm, gốc tim, cuống dài cong, kích thước trung bình của cuống lá dài từ 20 – 30 cm, rũ xuống. Lá màu xanh bĩng dài, nổi bật gân chân vịt màu xanh nhạt.
- Hoa mọc ra từ nách lá, hoa cĩ cấu tạo đặc trưng gồm một cuống hoa dài, trên cĩ một bản to hình trái tim, cĩ thể cĩ màu đỏ, hồng, cam, trắng…,quả mọng,sự biến thái sắc màu của hoa Tiểu Hồng Mơn rất kì diệu. Khi hoa cịn non thì màu rực rỡ, khi hoa trưởng thành thì màu nhạt hơn và khi hoa già thì màu hồng chuyển sang bạc màu pha lục của lá cây.Vì vậy trên một cây Hồng Mơn thì hoa cĩ nhiều sắc độ màu khác nhau. Khi hoa bung ra hết cỡ thì chiều rộng trung bình của hịa 3 – 5 cm và dài từ 4 – 6 cm.
1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh thái.
Cây Hồng Mơn là cây chịu bĩng râm (ánh nắng bán phần), Loại cây này nhân giống dễ dàng bằng cách tách bụi. Các loại Hồng Mơn nĩi chung là thích sống theo bụi, nên khi nĩ nhảy ra 1- 2 con mà tách ra là cây mẹ bị suy rất lâu phát triển. Nên muốn tách cây con thì chọn bụi nào cĩ khoảng từ 3 - 5 con thì tách ra 1 con để nuơi riêng.
Cây Hồng mơn cho hoa quanh năm, thời gian giữa hai lần ra hoa dài hay ngắn phụ thuộc vào sự thay đổi mơi trường sống. Vào mùa hè, cây ra hoa nhiều hơn do nhiều ánh sáng và nhiệt độ cao hơn.
Cây Tiểu Hồng Mơn cĩ nhu cầu nước trung bình, ưa khí hậu mát ẩm.
1.3.4. Tình hình nghiên cứu cây hồng mơn.
1.3.4.1. Tình hình ngồi nước.
Hoa Hồng mơn đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và đã tiến hành nhiều nghiên cứu, nhân giống hồng mơn và đã thu được nhiều kết quả đáng kể. Dưới đây là một số kết quả thu được trong thời gian gần đây.
Năm 2007, Judith Viegas và cs đã sử dụng mơ lá non để cảm ứng tạo mơ sẹo trên mơi trường ½ MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l BAP, mơ sẹo hình thành sau 56 ngày nuơi cấy với tỷ lệ là 45,7%. 99% mơ sẹo tái sinh chồi sau 70 ngày nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 1 mg/l BAP. Mơi trường ra rễ được sử dụng ở nghiên cứu này là MS bổ sung thêm 0,25 mg/l NAA và 0,04% than hoạt tính. 100% cây giống sau khi đưa ra vườn ươm để sinh trưởng và phát triển tốt.
Năm 2009, Jahan MT và cs đã tiến hành thành cơng thí nghiệm nhân giống vơ tính trong ống nghiệm Hồng mơn bằng phương pháp nuơi cấy mơ sẹo. Ở nghiên cứu này, vật liệu được sử dụng để tạo mơ sẹo là mẫu lá non và quả. Để cảm ứng tạo mơ sẹo, mẫu được nuơi cấy trong điều kiện tối, trên mơi trường N6 bổ sung 0,2
mg/l 2,4-D và 2,5 mg/l BAP là 85±2% mơ lá tạo sẹo (sẹo hình thành sau 35 ngày), 82±2% mơ cấy lấy từ quả (sẹo hình thành sau 40 ngày). Tỷ lệ mơ sẹo tái sinh chồi sau 30 ngày nuơi cấy cao nhất là 96±2% khi nuơi cấy trên mơi trường N6 bổ sung 1,0 mg/l BAP. Chồi tái sinh được chuyển sang mơi trường ½ MS bổ sung 1,0 mg/l IBA để tạo rễ, tỷ lệ chồi tạo được rễ là 85% sau 6 tuần nuơi cấy..
Năm 2009, Cimen Atak và cs đã nghiên cứu thành cơng quá trình nhân giống Hồng mơn từ mơ lá ở 2 giống là Arizona và Sumi. vi nhân giống hồng mơn 2 giống “Arizona” và “Sumi”, chồi được tạo thơng qua mơ sẹo, trong đĩ mơ lá được sử dụng để cảm ứng tạo sẹo. Kết quả cho thấy trên mơi trường ½ MS cĩ bổ sung 0,6 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA thì tỷ lệ tạo sẹo cao nhất là 81,25%, sau 30 ngày đối với là màu nâu (tức lá non) và 31,25% sau 65 ngày đối với là xanh (là già hơn), tỷ lệ tạo sẹo của giống Arizona (80%) cao hơn giống Sumi (70%). Mơi trường được sử dụng để tái sinh chồi là ½ MS bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA, tỷ lệ tái sinh chồi sau 6 tuần là 95-98%. Mơi trường ra rễ được sử dụng là ½ MS bổ sung 1 mg/l IBA và 0,04% than hoạt tính.
Năm 2010, S.A Islam và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hịa sinh trưởng như NAA, IBA và BAP lên quá trình tái sinh cơ quan của Hồng mơn trong điều kiện in vitro. Trên mơi trường MS cĩ chứa 1 mg/l NAA và 1 mg/l BAP cho thấy sự hình thành chồi cao nhất (68,3%), số chồi/mẫu cấy trung bình là 3,37 và chồi dài nhất (4,65 cm) sau 60 ngày. Sau 60 ngày nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ chứa 1 mg/l IBA và 1 mg/l BAP cho thấy hiệu suất tốt nhất cho quá trình tạo rễ là 83,85%, số lượng cao nhất của rễ là 4,29/chồi, chiều dài rễ là 5,5 cm.
Năm 2010, Saikat Gantait và cs là những người đã cĩ cơng trong việc tổng hợp lại các kết quả nghiên cứu và nhân giống Hồng mơn trên thế giới. Từ đĩ tạo cơ sở để tiến hành một số nghiên cứu để tối ưu quy trình nhân giống in vitro cây Hồng mơn cho các nghiên cứu sau.
Năm 2012, Mojtaba Khorrami Raad và cs đã nghiên cứu về quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo và tái sinh cơ quan của 2 giống hồng mơn đĩ là Casino và Antadra dưới tác động của IBA, NAA, 2,4-D và BA. Trong đĩ, mơ sẹo được hình thành sau 65 ngày nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0,5 mg/l NAA và 3 mg/l BA. Mơi trường tối ưu nhất cho quá trình tái sinh chồi là MS chứa 3 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA. Rễ được quan sát thấy phát triển tốt nhất trên mơi trường 1,0 mg/l IBA và 0,2 mg/l Ki (số rễ trung bình là 11,5 rễ/cây). Đồng thời cũng nghiên cứu kỹ quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo ở các điều kiện khác nhau như giống, độ tuổi của mơ lá, điều kiện chiếu sáng và các chất điều hịa sinh trưởng. Cụ thể là quá trình tạo mơ sẹo ở mơ lá non dễ dàng hơn mơ lá già, quá trình này diễn ra trong tối tốt hơn mơ ngồi sáng, tùy vào giống nuơi cấy mà điều chỉnh nồng độ chất điều hịa sinh trưởng sẽ khác nhau.
1.3.4.2.Tình hình trong nước.
Ở nước ta, việc nhân giống in vitro cây Hồng mơn cũng đã được đề cập từ nhiều năm trước đây nhưng cịn rất hạn chế. Cĩ một số nghiên cứu nổi bậc như sau:
Năm 1999: Chu Bá Phúc và các cộng sự là những người Việt Nam đầu tiên đã áp dụng phương pháp nuơi cây mơ để nhân nhanh các loại Hồng mơn, đem lại những thành cơng ban đầu cho việc áp dụng nuơi cấy mơ để nhân giống hồng mơn.
Năm 2003: Đồn Duy Thanh và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu quá trình tạo phơi vơ tính ở cây Hồng mơn.
Năm 2005: các nhà khoa học cơng nghệ thực vật Viện Sinh học nhiệt đới tại Đà Lạt đã cơng bố một số kết quả nghiên cứu cơ bản về sự hình thành mơ sẹo, phơi vơ tính từ nuơi cấy mơ lá và ứng dụng trong việc nhân nhanh giống hoa này. Kết quả nghiên cứu cho thấy mỗi giống Hồng mơn cĩ sự cảm ứng hình thành mơ sẹo, tái sinh chồi, ra rễ rất khác nhau, thậm chí trong cùng một mơi trường và điều kiện nuơi cấy cĩ một số giống hồn tồn khơng cảm ứng tạo mơ sẹo.
Năm 2011: Nguyễn Thị Lý Anh và các cộng sự đã áp dụng phương pháp nuơi cấy mơ để nhân nhanh giống hoa Hồng mơn mới nhập nội.Theo đĩ, mơi trường thích hợp để cảm ứng mơ sẹo từ phiến là non là MS bổ sung 2 mg/l Ki và 0,5 mg/l 2,4 – D, cho tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo là 100%. Chồi được tái sinh từ mơ sẹo sơ cấp khi được nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung 1 mg/l BA nhưng tỷ lệ tạo chồi thấp (12,5%), phương pháp nuơi cấy dát mỏng mơ sẹo thứ cấp (0,5 - 1 mm) hiệu quả nhân nhanh chồi cao nhất, trên mơi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IAA và 0,75 Ki, hệ số nhân đạt 12,5 chồi/lát sau 6 tuần nuơi cấy. Mơi trường tối ưu để tạo