1.3.4.1. Tình hình ngồi nước.
Hoa Hồng mơn đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và đã tiến hành nhiều nghiên cứu, nhân giống hồng mơn và đã thu được nhiều kết quả đáng kể. Dưới đây là một số kết quả thu được trong thời gian gần đây.
Năm 2007, Judith Viegas và cs đã sử dụng mơ lá non để cảm ứng tạo mơ sẹo trên mơi trường ½ MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l BAP, mơ sẹo hình thành sau 56 ngày nuơi cấy với tỷ lệ là 45,7%. 99% mơ sẹo tái sinh chồi sau 70 ngày nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 1 mg/l BAP. Mơi trường ra rễ được sử dụng ở nghiên cứu này là MS bổ sung thêm 0,25 mg/l NAA và 0,04% than hoạt tính. 100% cây giống sau khi đưa ra vườn ươm để sinh trưởng và phát triển tốt.
Năm 2009, Jahan MT và cs đã tiến hành thành cơng thí nghiệm nhân giống vơ tính trong ống nghiệm Hồng mơn bằng phương pháp nuơi cấy mơ sẹo. Ở nghiên cứu này, vật liệu được sử dụng để tạo mơ sẹo là mẫu lá non và quả. Để cảm ứng tạo mơ sẹo, mẫu được nuơi cấy trong điều kiện tối, trên mơi trường N6 bổ sung 0,2
mg/l 2,4-D và 2,5 mg/l BAP là 85±2% mơ lá tạo sẹo (sẹo hình thành sau 35 ngày), 82±2% mơ cấy lấy từ quả (sẹo hình thành sau 40 ngày). Tỷ lệ mơ sẹo tái sinh chồi sau 30 ngày nuơi cấy cao nhất là 96±2% khi nuơi cấy trên mơi trường N6 bổ sung 1,0 mg/l BAP. Chồi tái sinh được chuyển sang mơi trường ½ MS bổ sung 1,0 mg/l IBA để tạo rễ, tỷ lệ chồi tạo được rễ là 85% sau 6 tuần nuơi cấy..
Năm 2009, Cimen Atak và cs đã nghiên cứu thành cơng quá trình nhân giống Hồng mơn từ mơ lá ở 2 giống là Arizona và Sumi. vi nhân giống hồng mơn 2 giống “Arizona” và “Sumi”, chồi được tạo thơng qua mơ sẹo, trong đĩ mơ lá được sử dụng để cảm ứng tạo sẹo. Kết quả cho thấy trên mơi trường ½ MS cĩ bổ sung 0,6 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA thì tỷ lệ tạo sẹo cao nhất là 81,25%, sau 30 ngày đối với là màu nâu (tức lá non) và 31,25% sau 65 ngày đối với là xanh (là già hơn), tỷ lệ tạo sẹo của giống Arizona (80%) cao hơn giống Sumi (70%). Mơi trường được sử dụng để tái sinh chồi là ½ MS bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA, tỷ lệ tái sinh chồi sau 6 tuần là 95-98%. Mơi trường ra rễ được sử dụng là ½ MS bổ sung 1 mg/l IBA và 0,04% than hoạt tính.
Năm 2010, S.A Islam và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hịa sinh trưởng như NAA, IBA và BAP lên quá trình tái sinh cơ quan của Hồng mơn trong điều kiện in vitro. Trên mơi trường MS cĩ chứa 1 mg/l NAA và 1 mg/l BAP cho thấy sự hình thành chồi cao nhất (68,3%), số chồi/mẫu cấy trung bình là 3,37 và chồi dài nhất (4,65 cm) sau 60 ngày. Sau 60 ngày nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ chứa 1 mg/l IBA và 1 mg/l BAP cho thấy hiệu suất tốt nhất cho quá trình tạo rễ là 83,85%, số lượng cao nhất của rễ là 4,29/chồi, chiều dài rễ là 5,5 cm.
Năm 2010, Saikat Gantait và cs là những người đã cĩ cơng trong việc tổng hợp lại các kết quả nghiên cứu và nhân giống Hồng mơn trên thế giới. Từ đĩ tạo cơ sở để tiến hành một số nghiên cứu để tối ưu quy trình nhân giống in vitro cây Hồng mơn cho các nghiên cứu sau.
Năm 2012, Mojtaba Khorrami Raad và cs đã nghiên cứu về quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo và tái sinh cơ quan của 2 giống hồng mơn đĩ là Casino và Antadra dưới tác động của IBA, NAA, 2,4-D và BA. Trong đĩ, mơ sẹo được hình thành sau 65 ngày nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0,5 mg/l NAA và 3 mg/l BA. Mơi trường tối ưu nhất cho quá trình tái sinh chồi là MS chứa 3 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA. Rễ được quan sát thấy phát triển tốt nhất trên mơi trường 1,0 mg/l IBA và 0,2 mg/l Ki (số rễ trung bình là 11,5 rễ/cây). Đồng thời cũng nghiên cứu kỹ quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo ở các điều kiện khác nhau như giống, độ tuổi của mơ lá, điều kiện chiếu sáng và các chất điều hịa sinh trưởng. Cụ thể là quá trình tạo mơ sẹo ở mơ lá non dễ dàng hơn mơ lá già, quá trình này diễn ra trong tối tốt hơn mơ ngồi sáng, tùy vào giống nuơi cấy mà điều chỉnh nồng độ chất điều hịa sinh trưởng sẽ khác nhau.
1.3.4.2.Tình hình trong nước.
Ở nước ta, việc nhân giống in vitro cây Hồng mơn cũng đã được đề cập từ nhiều năm trước đây nhưng cịn rất hạn chế. Cĩ một số nghiên cứu nổi bậc như sau:
Năm 1999: Chu Bá Phúc và các cộng sự là những người Việt Nam đầu tiên đã áp dụng phương pháp nuơi cây mơ để nhân nhanh các loại Hồng mơn, đem lại những thành cơng ban đầu cho việc áp dụng nuơi cấy mơ để nhân giống hồng mơn.
Năm 2003: Đồn Duy Thanh và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu quá trình tạo phơi vơ tính ở cây Hồng mơn.
Năm 2005: các nhà khoa học cơng nghệ thực vật Viện Sinh học nhiệt đới tại Đà Lạt đã cơng bố một số kết quả nghiên cứu cơ bản về sự hình thành mơ sẹo, phơi vơ tính từ nuơi cấy mơ lá và ứng dụng trong việc nhân nhanh giống hoa này. Kết quả nghiên cứu cho thấy mỗi giống Hồng mơn cĩ sự cảm ứng hình thành mơ sẹo, tái sinh chồi, ra rễ rất khác nhau, thậm chí trong cùng một mơi trường và điều kiện nuơi cấy cĩ một số giống hồn tồn khơng cảm ứng tạo mơ sẹo.
Năm 2011: Nguyễn Thị Lý Anh và các cộng sự đã áp dụng phương pháp nuơi cấy mơ để nhân nhanh giống hoa Hồng mơn mới nhập nội.Theo đĩ, mơi trường thích hợp để cảm ứng mơ sẹo từ phiến là non là MS bổ sung 2 mg/l Ki và 0,5 mg/l 2,4 – D, cho tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo là 100%. Chồi được tái sinh từ mơ sẹo sơ cấp khi được nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung 1 mg/l BA nhưng tỷ lệ tạo chồi thấp (12,5%), phương pháp nuơi cấy dát mỏng mơ sẹo thứ cấp (0,5 - 1 mm) hiệu quả nhân nhanh chồi cao nhất, trên mơi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IAA và 0,75 Ki, hệ số nhân đạt 12,5 chồi/lát sau 6 tuần nuơi cấy. Mơi trường tối ưu để tạo rễ là mơi trường MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính, cho tỷ lệ cây ra rễ la 100%.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu.
Thời gian tiến hành thí nghiệm từ 15/1/2013 đến 1/6/2013.
Thí nghiệm được bố trí tạo phịng nuơi cấy mơ thuộc Trung tâm ứng dụng và chuyển giao cơng nghệ tỉnh Phú Yên – Sở khoa học và cơng nghệ tỉnh Phú Yên.
2.2. Vật liệu nghiên cứu.
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu.
Thí nghiệm được tiến hành trên cây Hồng mơn Tropical (Anthurium andreanum).
Nguồn mẫu là những lá non 2 tuần tuổi trồng tại trạm thực nghiệm Sinh học Hịa Quang và bình giống tại phịng nuơi cấy mơ thuộc Trung tâm ứng dụng và chuyển giao cơng nghệ tỉnh Phú Yên.
2.2.2. Mơi trường nuơi cấy.
Áp dụng kết quả đạt được từ các nghiên cứu trước, chúng tơi chọn mơi trường nuơi cấy là : MS, ½ MS (Murashige và Skoog, 1962). Trong đĩ mơi trường ½ MS cĩ thành phần đa lượng của mơi trường MS giảm đi một nửa, ngồi ra mơi trường cĩ bổ sung các thành phần như:
- Đường 30g/l. - Agar 8 g/l.
- Nước dừa 10% thể tích.
- pH mơi trường trước khi hấp khử trùng là 5,8 (điều chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N). Mơi trường sau khi pha chế được đổ vào bình tam giác cĩ dung tích 250 ml với thể tích 60 ml/bình, sau đĩ được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm
trong 20 phút. Sau đĩ được giữ ở nhiệt độ 250C trong 3-5 ngày để kiểm tra nhiễm trước khi cấy mẫu.
Tùy vào mục đích thí nghiệm, trong mơi trường bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng: 2,4-D, NAA, BA, Ki với các nồng độ khác nhau.
2.2.4. Điều kiện nuơi cấy.
Nhiệt độ phịng nuơi: 25 ± 20C.
Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày.
Độ ẩm phịng nuơi: 60 – 70%.
2.3. Nội dung nghiên cứu.
Quy trình nghiên cứu dự kiến như sau:
Nghiên cứu quy trình khử trùng mẫu Thí nghiệm 1: Tỷ lệ javen : nước cất là 1 : 2. Thời gian: 3, 5, 7, 10 phút. Thí nghiệm 2: Tỷ lệ javen : nước cất là 1 : 1. Thời gian: 3, 5, 7, 10 phút.
Nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo
Thí nghiệm 3:
½ MS + 2,4-D: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l.
Thí nghiệm 4:
½ MS + 2,4-D tối ưu + BA: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.4.1. Bố trí thí nghiệm.
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hồn tồn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm được lập lại 3 lần, 15 mẫu/lần. Mỗi bình tam giác chứa 60 ml mơi trường.
Nghiên cứu quá trình tái sinh chồi
Thí nghiệm 5: MS + Ki: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l. Thí nghiệm 6: MS + BA: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l.
Nghiên cứu quá trình nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 7:
MS + BA tối ưu + NAA: 0,2 mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8 mg/l.
Thí nghiệm 8:
MS + BA tối ưu + Ki: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l.
Thí nghiệm 9:
MS + BA tối ưu + Ki + NAA (dựa vào kết quả thí nghiệm 7,8)
Nghiên cứu quá trình ra rễ
Thí nghiệm 10:
MS + 0,5 g/l than hoạt tính + NAA: 0,1mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l + 0,7mg/l.
2.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian đến hiệu quả khử mẫu. quả khử mẫu.
Chất khử trùng là javen thương mại. Mơi trường được sử dụng là ½ MS Vật liệu vơ mẫu là lá non 2 tuần tuổi.
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen : nước cất là 1:2.
Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút)
NT1 3
NT2 5
NT3 7
NT4 10
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen : nước cất là 1:1.
Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút)
NT1 3
NT2 5
NT3 7
2.4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D, BA đến khả năng cảm ứng tạo mơ sẹo.
Mơi trường nuơi cấy là ½ MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng theo bố trí thí ngiệm ở bảng 2.3 và 2.4.
Vật liệu thí nghiệm là các mẫu lá khử trùng thành cơng.
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo.
Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D (mg/l) ĐC 0 NT1 0,2 NT2 0,4 NT3 0,6 NT4 0,8
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo.
(A là nồng độ tối ưu của 2,4-D thu được ở thí nghiệm 3)
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
2,4-D BA
NT1 A 0,5
NT2 A 1,0
NT3 A 1,5
2.4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của Ki và BA đến quá trình tái sinh chồi.
Mơi trường nuơi cấy là MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng như bố trí thí nghiệm trong bảng 2.5 và 2.6.
Vật liệu thí nghiệm là mơ sẹo thu được từ thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo.
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của Ki lên khả năng tái sinh chồi.
Nghiệm thức Nồng độ Ki (mg/l) ĐC 0 NT1 0,5 NT2 1,0 NT3 1,5 NT4 2,0
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi.
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) ĐC 0 NT1 0,5 NT2 1,0 NT3 1,5 NT4 2,0
2.4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Ki, NAA đến khả năng nhân nhanh chồi.
Mơi trường nuơi cấy là MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng như bố trí thí nghiệm trong bảng 2.7, 2.8 và 2.9.
Vật liệu thí nghiệm là các cụm chồi thu được từ thí nghiệm tái sinh chồi.
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng nhân nhanh chồi
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
BA NAA ĐC B 0 NT1 B 0,2 NT2 B 0,4 NT3 B 0,6 NT4 B 0,8
(B là nồng độ BA tối ưu cho quá trình tái sinh chồi)
Bảng 2.8. Ảnh hưởng của BA và Ki lên khả năng nhân nhanh chồi
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
BA Ki ĐC B 0 NT1 B 0,2 NT2 B 0,4 NT3 B 0,6 NT4 B 0,8
Bảng 2.9. Ảnh hưởng của BA, Ki và NAA lên khả năng nhân nhanh chồi
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
BA Ki NAA ĐC B C 0 NT1 B C 0,1 NT2 B C 0,2 NT3 B C 0,3 NT4 B C 0,4
Trong đĩ: B là nồng độ BA tối ưu cho quá trình tái sinh chồi. C là nồng độ Ki tối ưu ở thí nghiệm 8.
2.4.1.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ.
Mơi trường nuơi cấy là MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng như bố trí thí nghiệm trong bảng 2.10.
Vật liệu thí nghiệm là các chồi cây thu được từ thí nghiệm nhân nhanh chồi.
Bảng 2.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ.
Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) Nồng độ NAA (mg/l)
ĐC 0,5 0
NT1 0,5 0,1
NT2 0,5 0,3
NT3 0,5 0,5
2.4.2. Phƣơng pháp tiến hành.
2.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu.
Cây được chọn để lấy mẫu là những cây sinh trưởng khỏe, khơng bị sâu bệnh thường được lấy vào buổi sáng của ngày khơ ráo và cĩ nắng, trên mỗi cây lựa chọn những lá non từ 2 tuần tuổi, vừa xịe ra, tương đối đồng đều.
Hình 2.1.Mẫu lá 2 tuần tuổi. 2.4.2.2. Phương pháp xử lý khử trùng mẫu.
Bước 1:
- Mẫu lá được rửa sơ bằng nước sạch vài lần, tránh làm dập mẫu. - Ngâm trong nước xà phịng lỗng từ 10-15 phút.
Bước 2:
- Rửa sạch xà phịng dưới vịi nước chảy từ 15-20 phút. - Tráng lại bằng nước cất, chuyển vào tủ cấy.
Bước 3:
- Tráng lại bằng nước cất từ 3-5 lần.
- Ngâm trong dung dịch javen trong thời gian từ 3-10 phút tùy theo từng cơng thức khử trùng.
- Tráng lại bằng nước cất từ 3-5 lần.
Trong quá trình khử trùng, mẫu cấy được ngâm ngập hồn tồn trong mơi trường xử lý. Những phần mơ bị tác nhân vơ trùng làm dập cũng được loại bỏ trước khi cấy vào mơi trường.
2.4.2.1. Phương pháp cấy mẫu.
Mẫu lá sau khi được khử trùng được cắt thành những phần nhỏ kích thước là 1cm2, đưa vào ống nghiệm chứa mơi trường khơng cĩ chất điều hịa sinh trưởng.
Mơ sẹo được chọn với trạng thái, kích thước đồng nhất 0,5 cm2 để cấy vào các bình tam giác chứa mơi trường MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau.
Cụm chồi được lựa chọn để bố trí thí nghiệm nhân nhanh cĩ đường kính cụm chồi 0,5 cm cĩ 3 chồi được cấy vào các bình tam giác chứa mơi trường MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau.
2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi và phƣơng pháp xác định.
2.4.3.1. Giai đoạn khử trùng mẫu.
Thời gian theo dõi: 2, 4 tuần sau khi nuơi cấy. Tỷ lệ nhiễm (%) =
∑ số mẫu nhiễm ∑ số mẫu đưa vào
× 100
Tỷ lệ thành cơng (%) =
∑ số mẫu đưa vào × 100 ∑ số thành cơng
2.4.3.2. Giai đoạn cảm ứng tạo mơ sẹo.
Quan sát sự thay đổi hình thái mẫu cấy theo thời gian Thời gian theo dõi: 4, 7, 10 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.3. Giai đoạn tái sinh chồi.
X: số chồi cây.
N: số mẫu cĩ chồi tái sinh.
Chất lượng chồi cây: số lá, chiều cao chồi, tình trạng chồi Thời gian theo dõi: 6 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.4. Giai đoạn nhân nhanh chồi.
∑ số mẫu tạo sẹo ∑ số mẫu nuơi cấy
Tỷ lệ tạo calus (%) = × 100 n i i Xi 1 N
Số chồi trung bình / mẫu = × 100
∑ số chồi tạo thành ∑ số chồi ban đầu nuơi cấy