Cây được chọn để lấy mẫu là những cây sinh trưởng khỏe, khơng bị sâu bệnh thường được lấy vào buổi sáng của ngày khơ ráo và cĩ nắng, trên mỗi cây lựa chọn những lá non từ 2 tuần tuổi, vừa xịe ra, tương đối đồng đều.
Hình 2.1.Mẫu lá 2 tuần tuổi. 2.4.2.2. Phương pháp xử lý khử trùng mẫu.
Bước 1:
- Mẫu lá được rửa sơ bằng nước sạch vài lần, tránh làm dập mẫu. - Ngâm trong nước xà phịng lỗng từ 10-15 phút.
Bước 2:
- Rửa sạch xà phịng dưới vịi nước chảy từ 15-20 phút. - Tráng lại bằng nước cất, chuyển vào tủ cấy.
Bước 3:
- Tráng lại bằng nước cất từ 3-5 lần.
- Ngâm trong dung dịch javen trong thời gian từ 3-10 phút tùy theo từng cơng thức khử trùng.
- Tráng lại bằng nước cất từ 3-5 lần.
Trong quá trình khử trùng, mẫu cấy được ngâm ngập hồn tồn trong mơi trường xử lý. Những phần mơ bị tác nhân vơ trùng làm dập cũng được loại bỏ trước khi cấy vào mơi trường.
2.4.2.1. Phương pháp cấy mẫu.
Mẫu lá sau khi được khử trùng được cắt thành những phần nhỏ kích thước là 1cm2, đưa vào ống nghiệm chứa mơi trường khơng cĩ chất điều hịa sinh trưởng.
Mơ sẹo được chọn với trạng thái, kích thước đồng nhất 0,5 cm2 để cấy vào các bình tam giác chứa mơi trường MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau.
Cụm chồi được lựa chọn để bố trí thí nghiệm nhân nhanh cĩ đường kính cụm chồi 0,5 cm cĩ 3 chồi được cấy vào các bình tam giác chứa mơi trường MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau.
2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi và phƣơng pháp xác định.
2.4.3.1. Giai đoạn khử trùng mẫu.
Thời gian theo dõi: 2, 4 tuần sau khi nuơi cấy. Tỷ lệ nhiễm (%) =
∑ số mẫu nhiễm ∑ số mẫu đưa vào
× 100
Tỷ lệ thành cơng (%) =
∑ số mẫu đưa vào × 100 ∑ số thành cơng
2.4.3.2. Giai đoạn cảm ứng tạo mơ sẹo.
Quan sát sự thay đổi hình thái mẫu cấy theo thời gian Thời gian theo dõi: 4, 7, 10 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.3. Giai đoạn tái sinh chồi.
X: số chồi cây.
N: số mẫu cĩ chồi tái sinh.
Chất lượng chồi cây: số lá, chiều cao chồi, tình trạng chồi Thời gian theo dõi: 6 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.4. Giai đoạn nhân nhanh chồi.
∑ số mẫu tạo sẹo ∑ số mẫu nuơi cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tỷ lệ tạo calus (%) = × 100 n i i Xi 1 N
Số chồi trung bình / mẫu = × 100
∑ số chồi tạo thành ∑ số chồi ban đầu nuơi cấy Hệ số nhân (lần) =
∑ chiều cao các chồi theo dõi ∑ số chồi theo dõi
Chiều cao TB của chồi (cm) =
∑ số mẫu nuơi cấy
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) = × 100 ∑ Số mẫu tái sinh chồi
Tỷ lệ cảm ứng với mơi trường nuơi cấy (%) =
∑ số mẫu phản ứng
∑ số mẫu nuơi cấy
Chất lượng chồi cây:thể hiện số lá/chồi, chiều cao trung bình/chồi. Tình trạng chồi:
+++ : Tốt (chồi phát triển mạnh, thân to, lá to xanh đậm) ++ : Trung bình (chồi nhỏ, thân nhỏ, lá nhỏ xanh)
+ : Yếu (chồi nhỏ, lá rất nhỏ hoặc chưa hồn chỉnh hình thái, xanh nhạt) Thời gian theo dõi: 6 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.5. Giai đoạn ra rễ.
Thời gian theo dõi sau 6 tuần nuơi cấy.
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý thơng kê mơ tả bằng phần mềm SPSS 18 và Microsoft Excel. Các nghiệm thức được so sánh dựa trên kết quả phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA single factor) với kiểm định Duncan.
∑ lá của các chồi theo dõi
∑ số chồi theo dõi Số lá TB/chồi (lá/chồi) =
∑ số chồi nuơi cấy
Tỷ lệ ra rễ (%) = × 100
∑ chồi ra rễ
∑ chiều dài rễ các chồi theo dõi ∑ số chồi theo dõi
Chiều dài TB của rễ (cm) =
∑ rễ của các chồi theo dõi ∑ số chồi theo dõi Số rễ TB/chồi (rễ/chồi) =
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 3.1. Nghiên cứu quy trình khử trùng mẫu.
Mẫu cây ngồi tự nhiên thường bị nhiễm một số loại nấm, vi khuẩn, virus,…nên khi đưa mẫu vào nuơi cấy in vitro cần tiến hành khử trùng mẫu để loại bỏ nguồn nhiễm bệnh này. Đây là yếu tố quan trọng để tạo nguồn vật liệu ban đầu để phục vụ các giai đoạn nghiên cứu khác của quy trình nhân giống in vitro. Phương pháp khử trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là sử dụng các hĩa chất cĩ hoạt tính diệt khuẩn cao như hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già,….Mỗi loại hố chất hiệu quả xử lý mẫu khác nhau. Tùy thuộc đặc điểm, tình trạng mẫu sẽ khử trùng mẫu với nồng độ cao hay thấp và thời gian khử trùng dài hay ngắn. Việc khử trùng thành cơng khi tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất, khả năng mẫu sống và tái sinh mẫu đạt cao nhất.
Với nguồn vật liệu ban đầu là mẫu lá non 2 tuần tuổi được trồng trong nhà lưới nên trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng dịch javen thương mại làm chất khử trùng. Đây là loại hĩa chất dễ tìm, rẻ tiền, dễ sử dụng, ít gây độc người thao tác. Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ javen:nước là 1:3 phù hợp cho các mẫu dễ khử trùng như hạt phấn, lá,...; tỷ lệ 1:2 đối với những mẫu tương đối khĩ khử trùng như chồi đỉnh, chồi bên,…và tỷ lệ 1:1 dùng cho các mẫu khĩ khử trùng như hạt, củ, rễ,…với thời gian khử trùng từ 15 – 30 phút [14]. Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng tỷ lệ javen:nước cất tương ứng 1:2 và 1:1 để khảo sát hiệu quả khử trùng với thời gian khử trùng là 3, 5, 7, 10 phút. Kết quả được ghi nhận tại bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen:nước là 1:2. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) (sau 2 tuần) Tỷ lệ mẫu sống (%) (sau 4 tuần) NT1 3 63,33 ± 3,33b 20,00 ± 5,77 bc NT2 5 35,55 ± 6,94b 41,11 ± 10,18d NT3 7 30,00 ± 3,33b 31,11 ± 5,09cd NT4 10 13,33 ± 0a 6,67 ± 5,77ab
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua bảng 3.1 và kết quả phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA single factor) với kiểm định Duncan thì:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất là 13,33% (NT4), nhưng tỷ lệ mẫu sống khơng cao chỉ đạt 6,67 ± 5,77%.
- Ở các nghiệm thức cịn lại thì tỉ lệ mẫu nhiễm khơng cĩ sự sai khác về mặt thống kê (P>0,05), dao động từ 30,00% đến 63,33% và tỷ lệ mẫu thành cơng nằm trong khoảng 31,11% đến 41,11% .
- Hiệu quả khử trùng cao nhất khi sử dụng tỷ lệ javen:nước tương ứng 1:2 với thời gian khử trùng 5 phút. Kết quả tỷ lệ mẫu sống đạt 41,11 ± 10,18% sau 4 tuần vơ mẫu.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen:nước là 1:1. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) (sau 2 tuần) Tỷ lệ mẫu sống (%) (sau 4 tuần) NT1 3 50,00 ± 13,33c 26,67 ± 20cd NT2 5 11,11 ± 5,09b 62,22 ± 10,18e NT3 7 9,44 ± 5,09b 15,56 ± 9,62abc NT4 10 0,00a 0,00a
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Qua bảng 3.2 cho thấy:
- Tỷ lệ nhiễm cĩ sự khác biệt rõ theo 3 nhĩm: nhĩm 1 (NT1) tỷ lệ nhiễm vẫn cịn cao là 50,00 ± 13,33%; nhĩm 2 (NT2, NT3) tỷ lệ nhiễm giảm đáng kể, dao động từ 9,44 – 11,11%; nhĩm 3 (NT4) khơng cĩ mẫu nào nhiễm.
- Hiệu quả khử trùng cao nhất với thời gian khử trùng là 5 phút, khi đĩ tỷ lệ nhiễm cịn 11,11 ± 5,09% và tỷ lệ mẫu sống là 62,22 ± 10,18% (NT2).
Qua biểu đồ 3.1, chúng tơi nhận thấy:
- Ở cùng một tỷ lệ chất khử trùng, khi thời gian khử trùng tăng thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm. Ở tỷ lệ javen : nước cất là 1:2 khi thời gian khử trùng là 3 – 5 – 7 – 10 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm tương ứng là 63,33 ± 3,33% - 35,55 ± 6,94% - 30,00 ± 3,33% - 9,44 ± 5,09% - 0,00%.
- Ở cùng một khoảng thời gian khử trùng, khi tăng tỷ lệ javen:nước lên thì tỷ lệ nhiễm giảm. Với thời gian khử trùng mẫu cùng là 5 phút, tại tỷ lệ javen : nước là 1:2 thì tỷ lệ nhiễm là 35,55 ± 6,94% và khi tăng tỷ lệ này lên 1:1 thì tỷ lệ nhiễm giảm cịn 11,11 ± 5,09%.
- Đối với tỷ lệ mẫu sống thì chỉ tiêu này phụ thuộc vào lượng mẫu nhiễm và mẫu chết của các nghiệm thức. Sự tương quan này được thể hiện theo cơng thức sau:
Trong đĩ: Số mẫu nuơi cấy ban đầu là 100%.
Theo cơng thức trên và các bảng 3.1, 3.2 ta thấy, khi tiến hành khử trùng mẫu trong thời gian 7, 10 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhưng tỷ lệ mẫu thành cơng khơng cao, như vậy tỷ lệ mẫu chết ở các nghiệm thức này cao hơn các nghiệm thức khác. Điều này cho thấy, khi nồng chất khử trùng càng cao và thời gian khử trùng càng kéo dài đã làm tổn thương và dẫn đến tình trạng chết mẫu.
Như vậy, hiệu quả cao nhất khi khử trùng mẫu lá Hồng mơn trong nghiên cứu này, sử dụng tỷ lệ javen:nước là 1:1 với thời gian khử trùng 05 phút cho tỷ lệ mẫu thành cơng cao nhất là 62,22 ± 10,18%.
(a) Mẫu chết sau 4 tuần (b) Mẫu thành cơng sau 4 tuần
Hình 3.1. Tình trạng lá sau khi khử trùng.
3.2. Nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo.
Các nghiên cứu trước đây về cây Hồng mơn (Kuehn an Sugii, 1991; Singh and Sagama, 1991) đều đã khẳng định sự tái sinh chồi từ mơ lá cần phải thơng qua mơ sẹo. Mơ sẹo là nguồn vật liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như phân hĩa mơ, tế bào để tạo chồi, hình thành cây hoặc sản xuất các hợp chất thứ cấp cĩ hoạt chất sinh học...Ở nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo từ mơ lá Hồng mơn trên mơi trường dinh dưỡng là ½ MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng 2,4-D và cĩ sự kết hợp 2,4-D với BA để kích thích quá trình cảm ứng tạo sẹo. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo. Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D mg/l) Tỷ lệ tạo mơ sẹo (%) Tỷ lệ cảm ứng với mơi trƣờng nuơi cấy (%)
Hình thái mẫu cấy
ĐC 0 0,00a 0,00a Mẫu cấy hĩa nâu và chết. NT1 0,2 0,00a 11,11 ± 0,22b
Mẫu cấy uốn cong, vết cắt cĩ hiện tượng phình
to giữa 2 mặt lá. NT2 0,4 0,00a 28,96 ± 0,86c
NT3 0,6 0,00a 68,58 ± 0,23e
NT4 0,8 0,00a 55,75 ± 0,55d
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Qua bảng 3.3 cho thấy, khi cĩ sự bổ sung chất điều hịa sinh trưởng vào mơi trường nuơi cấy thì quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo xảy ra rõ ràng hơn so với mẫu đối chứng. Tại nồng độ 2,4-D khác nhau thì tỷ lệ mẫu cảm ứng với mơi trường nuơi cấy cũng khác nhau. Quá trình cảm ứng mơ sẹo đạt hiệu quả cao nhất tại nồng độ 0,6 mg/l với tỷ lệ 68,58 ± 0,23% và mẫu cấy uốn cong nhiều nhất, các mép lá cũng phình to rõ rệt hơn các nghiệm thức khác; thấp nhất tại nồng độ 0,2 mg/l với tỷ lệ 11,11 ± 0,22%. Tuy nhiên từ tuần nuơi cấy thứ 7 trở đi, các mẫu cấy khơng tiếp tục cảm ứng tạo mơ sẹo mà bắt đầu hố nâu và chết.
Như vậy trong nghiên cứu sử dụng 2,4-D, các mẫu lá chỉ mới cảm ứng với mơi trường nuơi cấy mà chưa cĩ sự phân hố thành mơ sẹo. Hiện tượng cảm ứng rõ rệt nhất khi mẫu cấy được nuơi cấy khi bổ sung nồng độ 0,6 mg/l. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo một số nghiên cứu trước của các tác giả như Kuehnle và Sugii (1991), Teng (1997) Somaya (1998), Yu (2009), Cimen Atak (2009), thì khi cĩ sự kết hợp của 2,4-D và BA trong mơi trường nuơi cấy sẽ thúc đẩy quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo tốt hơn. Để tiếp tục nghiên cứu quá trình tạo mơ sẹo từ lá hồng mơn, chúng tơi
tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D với nồng độ là 0,6 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ là 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l. Kết quả ghi nhận thể hiện tại bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo sau 10 tuần nuơi cấy.
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Biểu đồ 3.2.Tỷ lệ tạo mơ sẹo dưới tác động của 2,4-D và BA
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều
hịa sinh trƣởng (mg/l) Tỷ lệ tạo mơ
sẹo (%) Hình thái mẫu cấy
2,4-D BA
NT1 0,6 0,5 60,00 ± 0,13c Mẫu cấy phình to, uống cong, sùi sẹo ở mép cắt tại vị trí xung quanh gân lá và phát triển quanh lá. Hầu hết các mơ sẹo tạo thành cĩ màu vàng nhạt.
NT2 0,6 1,0 80,00 ± 0,23d
NT3 0,6 1,5 40,86 ± 0,68b NT4 0,6 2,0 8,45 ± 0,45a
Qua bảng 3.4 cho thấy, khi cĩ sự kết hợp 2,4-D và BA thì sự cảm ứng mẫu tạo mơ sẹo thể hiện rõ hơn so với dùng 2,4-D riêng lẻ. Tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo và chất lượng mơ sẹo thay đổi theo nồng độ BA. Tại nồng độ 1 mg/l BA thì tỷ lệ tạo mơ sẹo đạt cao nhất là 80,00 ± 0,23%. Khi tiếp tục tăng nồng độ BA thì tỷ lệ tạo mơ sẹo đã giảm từ 80,00 ± 0,23% xuống 40,86 ± 0,68% ở NT3 (1,5 mg/l BA) và 8,45 ± 0,45% ở NT4 (2 mg/l BA). Nồng độ BA cao ức chế quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo, hay nĩi cách khác tỷ lệ auxin/cytokine quá cao sẽ khơng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tạo mơ sẹo.
Như vậy, mơi trường tốt nhất cho quá trình tạo mơ sẹo ở lá cây Hồng mơn Tropical là ½ MS cĩ bổ sung 0,6 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA. Hiệu quả tạo mơ sẹo đạt 80,00 ± 0,23 %. Các mơ sẹo tạo thành cĩ màu vàng nhạt. Điều kiện để cho quá trình cảm ứng mơ sẹo tạo ra, đặt mẫu trong điều kiện tối hồn tồn. Kết quả này tương tự với nghiên cứu về quá trình nhân giống Hồng mơn từ mơ lá của các tác giả Cimen Atak (2009), Atak và Celik (2009).
(a) 0,6 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l BA (b) 0,6 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA
(c) 0,6 mg/l 2,4-D và 1,5 mg/l BA (d) 0,6 mg/l 2,4-D và 2 mg/l BA
Hình 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo sau 10 tuần nuơi cấy.
Đồng thời khi khảo sát sự cảm ứng mơ sẹo với chất điều hồ sinh trưởng 2,4 D kết hợp BA, chúng tơi ghi nhận quá trình tạo mơ sẹo được bắt đầu vào tuần thứ 4 và thể hiện rõ vào tuần thứ 6 sau khi chuyển sang mơi trường nuơi cấy. Mơ sẹo ban đầu được hình thành tại vị trí vết cắt gân lá với đường kính 0,5 mm sau đĩ to lên và phát triển lan rộng tại các vị trí vết cắt mẫu lá vào tuần thứ 8. Mơ sẹo được tạo thành và được ghi nhận rõ ràng nhất vào tuần thứ 10. Theo thời gian, tỷ lệ tạo thành mơ sẹo cĩ sự thay đổi, tỷ lệ mơ sẹo tạo thành nhiều nhất tập trung vào tuần thứ 5 đến tuần thứ 7. Quá trình hình thành mơ sẹo trên mẫu lá Hồng mơn được ghi nhận tại hình 3.4.
Mẫu sống sau 4 tuần nuơi cấy.
Mẫu cảm ứng với mơi trường sau