Các nghiên cứu trước đây về cây Hồng mơn (Kuehn an Sugii, 1991; Singh and Sagama, 1991) đều đã khẳng định sự tái sinh chồi từ mơ lá cần phải thơng qua mơ sẹo. Mơ sẹo là nguồn vật liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như phân hĩa mơ, tế bào để tạo chồi, hình thành cây hoặc sản xuất các hợp chất thứ cấp cĩ hoạt chất sinh học...Ở nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo từ mơ lá Hồng mơn trên mơi trường dinh dưỡng là ½ MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng 2,4-D và cĩ sự kết hợp 2,4-D với BA để kích thích quá trình cảm ứng tạo sẹo. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo. Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D mg/l) Tỷ lệ tạo mơ sẹo (%) Tỷ lệ cảm ứng với mơi trƣờng nuơi cấy (%)
Hình thái mẫu cấy
ĐC 0 0,00a 0,00a Mẫu cấy hĩa nâu và chết. NT1 0,2 0,00a 11,11 ± 0,22b
Mẫu cấy uốn cong, vết cắt cĩ hiện tượng phình
to giữa 2 mặt lá. NT2 0,4 0,00a 28,96 ± 0,86c
NT3 0,6 0,00a 68,58 ± 0,23e
NT4 0,8 0,00a 55,75 ± 0,55d
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Qua bảng 3.3 cho thấy, khi cĩ sự bổ sung chất điều hịa sinh trưởng vào mơi trường nuơi cấy thì quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo xảy ra rõ ràng hơn so với mẫu đối chứng. Tại nồng độ 2,4-D khác nhau thì tỷ lệ mẫu cảm ứng với mơi trường nuơi cấy cũng khác nhau. Quá trình cảm ứng mơ sẹo đạt hiệu quả cao nhất tại nồng độ 0,6 mg/l với tỷ lệ 68,58 ± 0,23% và mẫu cấy uốn cong nhiều nhất, các mép lá cũng phình to rõ rệt hơn các nghiệm thức khác; thấp nhất tại nồng độ 0,2 mg/l với tỷ lệ 11,11 ± 0,22%. Tuy nhiên từ tuần nuơi cấy thứ 7 trở đi, các mẫu cấy khơng tiếp tục cảm ứng tạo mơ sẹo mà bắt đầu hố nâu và chết.
Như vậy trong nghiên cứu sử dụng 2,4-D, các mẫu lá chỉ mới cảm ứng với mơi trường nuơi cấy mà chưa cĩ sự phân hố thành mơ sẹo. Hiện tượng cảm ứng rõ rệt nhất khi mẫu cấy được nuơi cấy khi bổ sung nồng độ 0,6 mg/l.
Theo một số nghiên cứu trước của các tác giả như Kuehnle và Sugii (1991), Teng (1997) Somaya (1998), Yu (2009), Cimen Atak (2009), thì khi cĩ sự kết hợp của 2,4-D và BA trong mơi trường nuơi cấy sẽ thúc đẩy quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo tốt hơn. Để tiếp tục nghiên cứu quá trình tạo mơ sẹo từ lá hồng mơn, chúng tơi
tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D với nồng độ là 0,6 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ là 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l. Kết quả ghi nhận thể hiện tại bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo sau 10 tuần nuơi cấy.
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Biểu đồ 3.2.Tỷ lệ tạo mơ sẹo dưới tác động của 2,4-D và BA
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều
hịa sinh trƣởng (mg/l) Tỷ lệ tạo mơ
sẹo (%) Hình thái mẫu cấy
2,4-D BA
NT1 0,6 0,5 60,00 ± 0,13c Mẫu cấy phình to, uống cong, sùi sẹo ở mép cắt tại vị trí xung quanh gân lá và phát triển quanh lá. Hầu hết các mơ sẹo tạo thành cĩ màu vàng nhạt.
NT2 0,6 1,0 80,00 ± 0,23d
NT3 0,6 1,5 40,86 ± 0,68b NT4 0,6 2,0 8,45 ± 0,45a
Qua bảng 3.4 cho thấy, khi cĩ sự kết hợp 2,4-D và BA thì sự cảm ứng mẫu tạo mơ sẹo thể hiện rõ hơn so với dùng 2,4-D riêng lẻ. Tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo và chất lượng mơ sẹo thay đổi theo nồng độ BA. Tại nồng độ 1 mg/l BA thì tỷ lệ tạo mơ sẹo đạt cao nhất là 80,00 ± 0,23%. Khi tiếp tục tăng nồng độ BA thì tỷ lệ tạo mơ sẹo đã giảm từ 80,00 ± 0,23% xuống 40,86 ± 0,68% ở NT3 (1,5 mg/l BA) và 8,45 ± 0,45% ở NT4 (2 mg/l BA). Nồng độ BA cao ức chế quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo, hay nĩi cách khác tỷ lệ auxin/cytokine quá cao sẽ khơng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tạo mơ sẹo.
Như vậy, mơi trường tốt nhất cho quá trình tạo mơ sẹo ở lá cây Hồng mơn Tropical là ½ MS cĩ bổ sung 0,6 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA. Hiệu quả tạo mơ sẹo đạt 80,00 ± 0,23 %. Các mơ sẹo tạo thành cĩ màu vàng nhạt. Điều kiện để cho quá trình cảm ứng mơ sẹo tạo ra, đặt mẫu trong điều kiện tối hồn tồn. Kết quả này tương tự với nghiên cứu về quá trình nhân giống Hồng mơn từ mơ lá của các tác giả Cimen Atak (2009), Atak và Celik (2009).
(a) 0,6 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l BA (b) 0,6 mg/l 2,4-D và 1 mg/l BA
(c) 0,6 mg/l 2,4-D và 1,5 mg/l BA (d) 0,6 mg/l 2,4-D và 2 mg/l BA
Hình 3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo sau 10 tuần nuơi cấy.
Đồng thời khi khảo sát sự cảm ứng mơ sẹo với chất điều hồ sinh trưởng 2,4 D kết hợp BA, chúng tơi ghi nhận quá trình tạo mơ sẹo được bắt đầu vào tuần thứ 4 và thể hiện rõ vào tuần thứ 6 sau khi chuyển sang mơi trường nuơi cấy. Mơ sẹo ban đầu được hình thành tại vị trí vết cắt gân lá với đường kính 0,5 mm sau đĩ to lên và phát triển lan rộng tại các vị trí vết cắt mẫu lá vào tuần thứ 8. Mơ sẹo được tạo thành và được ghi nhận rõ ràng nhất vào tuần thứ 10. Theo thời gian, tỷ lệ tạo thành mơ sẹo cĩ sự thay đổi, tỷ lệ mơ sẹo tạo thành nhiều nhất tập trung vào tuần thứ 5 đến tuần thứ 7. Quá trình hình thành mơ sẹo trên mẫu lá Hồng mơn được ghi nhận tại hình 3.4.
Mẫu sống sau 4 tuần nuơi cấy.
Mẫu cảm ứng với mơi trường sau 2 tuần chuyển sang mơi trường cĩ
chất điều hịa sinh trưởng.
Mẫu sùi sẹo ở mép cắt gần gân lá sau 6 tuần nuơi cấy
Mẫu phình to hai mép cắt sau 4 tuần nuơi cấy.
Mơ sẹo phát triển và lan rộng xung quanh lá
.
3.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo.
Khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo là một trong những yếu tố quyết định và nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ cho nghiên cứu quá trình nhân nhanh trong nhân giống in vitro. Để điều khiển sự tái sinh chồi thì trong mơi trường nuơi cấy thường phải bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, tăng sự kích thích sự phân hố mơ tế bào. Trong các chất điều hồ sinh trưởng, nhĩm cytokinine cĩ chức năng rõ rệt lên sự phân hĩa các cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hĩa chồi. BA là một cytokinine tổng hợp cĩ tác dụng kích thích sự phân chia, hình thành và tạo điều kiện cho chồi phát triển. Kinetine kích thích sự phát sinh chồi mơ nuơi cấy, phân chia tế bào ở các mơ khơng phân hĩa, tạo các cụm chồi. Chính vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát sự ảnh hưởng của hai loại cytokinine này đến quá trình tái sinh chồi từ mơ sẹo. Kết quả được thể hiện trong các bảng 3.5 và bảng 3.6.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Kinetine lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo.
Nghiệm thức Nồng độ Ki (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi cây
(%) Đƣờng kính cụm chồi (cm) Số chồi cây TB/mẫu Tình trạng chồi
ĐC 0 0,00a 0,6 ± 0,07a 0,00a Khơng cĩ chồi cây
NT1 0,5 0,00a 0,8 ± 0,08b 0,00a Khơng cĩ chồi cây
NT2 1,0 9,70 ± 0,55b 1,0 ± 0,07c 0,9 ± 0,32b +
NT3 1,5 26,85 ± 0,90d 1,3 ± 0,07e 1,2 ± 0,42c ++
NT4 2,0 15,41 ± 0,51c 1,0 ± 0,10d 1,3 ± 0,48c ++
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Chú thích:
+ : Yếu (chồi nhỏ, lá rất nhỏ hoặc chưa hồn chỉnh hình thái, xanh nhạt) ++ : Trung bình (chồi nhỏ, thân nhỏ, lá nhỏ xanh)
Qua bảng 3.5 cho thấy: khi sử dụng kinetine, hầu hết các mẫu tái sinh chồi từ mơ sẹo đều phát sinh hình thái thành cụm chồi màu xanh và tỷ lệ tạo chồi cây cao nhất 26,85 ± 0,90% tại nồng độ Ki là 1,5 mg/l. Đối với các mẫu tạo chồi cây, cĩ số lượng chồi cây/mẫu trung bình 1 chồi/mẫu, chiều cao chồi thấp.
(a) 0,5 mg/l Ki (b) 1,0 mg/l ki
(c) 1,5 mg/l Ki (d) 2,0 mg/l Ki
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo.
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi cây
(%) Đƣờng kính cụm chồi (cm) Số chồi cây TB/mẫu Tình trạng chồi
ĐC 0 0,00a 0,6 ± 0,07a 0,00a Khơng tạo chồi cây
NT1 0,5 11,16 ± 0,37b 0,9 ± 0,09b 1,2 ± 0,42b ++
NT2 1,0 68,89 ± 0,69e 1,2 ± 0,10d 3,2 ± 0,42e ++
NT3 1,5 27,72 ± 1,19d 1,0 ± 0,06bc 2,4 ± 0,52d ++
NT4 2,0 15,54 ± 0,59c 0,9 ± 0,08bc 1,9 ± 0,32c ++
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Chú thích:
++ : Trung bình (chồi nhỏ, thân nhỏ, lá nhỏ xanh)
Qua bảng 3.6, khi tăng nồng độ BA từ 0,5 lên 1 mg/l, tỷ lệ tạo chồi cây tăng từ 11,16% đến 68,89%, đường kính cụm chồi cũng tăng lên từ 0,9 lên 1,2 cm, số chồi cây tăng từ 1,2 lên 3,2 chồi cây/mẫu; nhưng khi tăng nồng độ BA lên 1,5 và 2,0 mg/l thì tỷ lệ tạo chồi cây cĩ xu hướng giảm từ 68,89% xuống cịn 15,54%, đường kính chồi giảm xuống đạt 0,9 cm/mẫu và số lượng chồi cây xuống cịn 1,9 chồi/mẫu. Tình trạng các chồi tái sinh từ nghiệm thức 2 đến nghiệm thức 4 đều cĩ màu xanh, riêng nghiệm thức đối chứng cĩ màu vàng xanh.
Như vậy, ảnh hưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo trong nghiên cứu này cho thấy tại nồng độ 1 mg/l BA khả năng mẫu tạo thành chồi cây đạt 68,89 ± 0,69 %, số chồi tái sinh 3,2 ± 0,42 chồi cây/mẫu, đường kính chồi 1,2 ± 0,10 cm. Kết quả nghiên cứu này tương tự với kết quả nghiên cứu của Somaya và cộng sự (1998).
(a) 0,5 mg/l BA (b) 1,0 mg/l BA
(c) 1,5 mg/l BA (d) 2,0 mg/l BA
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của BA và Ki đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mơ sẹo.
Qua biểu đồ 3.3 cho thấy, sử dụng BA cho quá trình tái tạo chồi từ mơ sẹo hiệu quả hơn so với dùng kinetine. Tỷ lệ mẫu tạo chồi cây cao nhất là 26,85 ± 0,90% (dùng kinetine), trong khi đĩ tỷ lệ mẫu tạo chồi cây cao nhất là 68,89 ± 0,69% (dùng BA). Chất lượng chồi tạo ra trong các nghiệm thức sử dụng BA cho kết quả tốt hơn khi sử dụng kinetine. Số lượng chồi cây đạt 3,2 ± 0,42 chồi cây/mẫu.
Kết luận: Mơi trường tối ưu cho quá trình tái sinh chồi từ mơ sẹo là mơi trường MS cĩ bổ sung 1,0 mg/l BA.
3.5. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi.
Giai đoạn nhân chồi là giai đoạn mang tính quyết định, tạo ra hệ số nhân nhanh trong vi nhân giống in vitro. Hệ số nhân càng cao thì số lượng cây tạo thành càng nhiều dẫn đến giá thành sản xuất cây giống càng thấp. Để làm được điều đĩ, người ta thường nghiên cứu bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng với nồng độ thích hợp vào mơi trường nuơi cấy. Chất điều sinh trưởng thường sử dụng là nhĩm chất cytokinine hoặc kết hợp với auxin để nhân nhanh chồi. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tơi sử dụng BA với nồng độ là 1 mg/l (nồng BA tối ưu cho sự
tái sinh chồi) kết hợp với NAA và BA kết hợp với Ki ở các nồng độ khác nhau để khảo sát quá trình nhân nhanh chồi Hồng mơn. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.7, 3.8, 3.9.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng nhân nhanh chồi.
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng
(mg/l) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao TB chồi (cm) Số lá TB/chồi (lá/chồi) Tình trạng chồi BA NAA ĐC 1,0 0 1,1 ± 0,10a 1,1 ± 0,05a 2,3 ± 0,48b + NT1 1,0 0,2 1,7 ± 0,15b 1,3 ± 0,10b 2,3 ± 0,48b + + NT2 1,0 0,4 2,2 ± 0,10c 1,4 ± 0,10b 3,0 ± 0,47c + + + NT3 1,0 0,6 3,1 ± 0,10d 1,6 ± 0,09c 2,5 ± 0,53b + + + NT4 1,0 0,8 2,3 ± 0,73c 1,4 ± 0,05b 1,9 ± 0,48a + +
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Chú thích:
+++ : Tốt (chồi phát triển mạnh, thân to, lá to xanh đậm) ++ : Trung bình (chồi nhỏ, thân nhỏ, lá nhỏ xanh)
+ : Yếu (chồi nhỏ, lá rất nhỏ hoặc chưa hồn chỉnh hình thái, xanh nhạt)
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, khi sử dụng kết hợp BA và NAA đã làm tăng hệ số nhân chồi và chất lượng chồi được cải thiện đáng kể so với đối chứng. Cụ thể là khi bổ sung thêm NAA với nồng độ từ 0,2 - 0,8 mg/l thì hệ số nhân nhanh chồi đã tăng lên, dao động từ 1,7 đến 3,1 lần, đạt cao nhất là 3,1 ± 0,10 lần ở nồng độ 0,6 mg/l NAA và thấp nhất 1,7 ± 0,15 lần ở nồng độ 0,2 mg/l NAA. Tại nồng độ 0,8 mg/l NAA cho thấy hệ số nhân chồi đã cĩ xu hướng giảm, chồi tạo thành cĩ hiện tượng biến dạng, phần gốc phình to cĩ xu hướng tạo mơ sẹo (hình 3.7). Vấn đề này
cần tiếp tục nghiên cứu khảo sát thêm. Chất lượng chồi tốt nhất tại nồng độ 0,4 và 0,6 mg/l NAA. Các chồi cĩ màu xanh đậm.
(a) 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (b) 1 mg/l BA + 0,4 mg/l NAA
(c) 1 mg/l BA + 0,6 mg/l NAA (d) 1 mg/l BA + 0,8 mg/l NAA
Hình 3.6. Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA trong quá trình tái sinh chồi.
Chúng tơi tiếp tục khảo sát quá trình nhân nhanh chồi với BA kết hợp Ki, trong đĩ chúng tơi vẫn sử dụng BA với nồng độ là 1 mg/l và kết hợp với Ki ở các nồng độ tương ứng 0,5; 1,0; 1,5; 2 mg/l. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BA và Ki lên khả năng nhân nhanh chồi. Nghiệm thức Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao TB chồi (cm) Số lá TB/chồi (lá/chồi) Tình trạng chồi BA Ki ĐC 1,0 0 1,1 ± 0,10a 1,1 ± 0,05a 2,3 ± 0,48a + NT1 1,0 0,2 1,8 ± 0,10c 1,3 ± 0,10b 2,3 ± 0,48a + + NT2 1,0 0,4 2,4 ± 0,06d 1,3 ± 0,08b 2,5 ± 0,53b + + NT3 1,0 0,6 3,5 ± 0,10e 1,6 ± 0,08c 2,7 ± 0,48c + + NT4 1,0 0,8 1,9 ± 0,06b 1,5 ± 0,05c 2,3 ± 0,47a + +
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Chú thích:
++ : Trung bình (chồi nhỏ, thân nhỏ, lá nhỏ xanh).
+ : Yếu (chồi nhỏ, lá rất nhỏ hoặc chưa hồn chỉnh hình thái, xanh nhạt).
Qua bảng 3.8 cho thấy, khi BA kết hợp Ki đã làm gia tăng số lượng chồi lên đáng kể so với đối chứng, chất lượng chồi hình thành tốt hơn. Cụ thể là khi bổ sung thêm Ki từ 0,2 đến 0,6 mg/l thì hệ số nhân chồi tăng từ 1,8 đến 3,5 lần, nhưng tăng đến nồng độ 0,8 mg/l Ki thì số lượng chồi giảm cịn 1,9 ± 0,06lần. Tất cả các chồi đều cao trên 1cm, số lá/chồi dao động từ 2-3cm, tình trạng chồi phát triển tốt. Như vậy, kết quả khảo sát cho thấy nồng độ 0,6 mg/l Ki cho số chồi cao nhất đạt 3,5 ± 0,1 chồi/mẫu, chiều cao chồi 1,6 ± 0,08 cm, số lá 2,7 ± 0,48 lá/chồi.
(a) 1 mg/l BA + 0,2 mg/l Ki (b) 1 mg/l BA + 0,4 mg/l Ki
(c) 1 mg/l BA + 0,6 mg/l Ki (d) 1 mg/l BA + 0,8 mg/l Ki
Hình 3.7. Ảnh hưởng của BA kết hợp với Ki trong quá trình tái sinh chồi.
Trong mơi trường nuơi cấy, việc sử dụng nhĩm auxin kết hợp nhĩm