Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ chứa đường, muối khống và vitamin, thích hợp cho các lồi nấm, vi khuẩn phát triển. Do đĩ tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu mơi trường nuơi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần tồn bộ bề mặt mơi trường nuơi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, buộc phải loại bỏ thí nghiệm vì mơ nuơi cấy sẽ khơng phát triển và chết dần trong điều kiện này.
Để đảm điều kiện vơ trùng trong quá trình nuơi cấy địi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:
- Vơ trùng mơ cấy.
- Vơ trùng dụng cụ thủy tinh, mơi trường và nút đậy.
- Trong thao tác nuơi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt mơi trường nuơi cấy.
Mơ cấy cĩ thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với mơi trường bên ngồi mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vơ trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng hĩa chất cĩ hoạt tính diệt nấm, vi khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mơ cấy. Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng khơng triệt để và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của mơ cấy. Ngồi ra, người ta cịn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol, cồn 70%...[23]
Bảng 1.1. Một số hĩa chất khử trùng thơng dụng [5] STT Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) 1 Calcium hypocholorite 9 - 10 5 - 30 2 Sodium hypocholorite 0.5 - 5 5 - 30 3 Hydrogen peroxide 3 - 12 5 - 15 4 Bromine water 1 - 2 2 - 10 5 Ethyl alcohol 70 - 95 0.1 - 5.0 6 Silver nitrate 1 5 - 30 7 Murcuric choloride 0.1 - 1.0 2 - 10 8 Benzalkonium choloride 0.01 - 0.1 5 - 20 9 Antibiotics 4 - 50 mg/l 30 - 60
Trong quá trình xử lý mơi cấy phải ngập hồn tồn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn, với các bộ phận cĩ bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch xà phịng và rửa lại dưới vịi nước chảy. Sau khi xử lý xong, mơ nuơi cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vơ trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vơ trùng trước khi đặt lên mơi trường nuơi cấy nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vơ trùng lên mơ cấy (Trần Văn Minh, 2004). Để tăng hiệu quả khử trùng người ta thường kết hợp nhiều loại hĩa chất khác nhau.