2.2.1. Đối tượng nghiên cứu.
Thí nghiệm được tiến hành trên cây Hồng mơn Tropical (Anthurium andreanum).
Nguồn mẫu là những lá non 2 tuần tuổi trồng tại trạm thực nghiệm Sinh học Hịa Quang và bình giống tại phịng nuơi cấy mơ thuộc Trung tâm ứng dụng và chuyển giao cơng nghệ tỉnh Phú Yên.
2.2.2. Mơi trường nuơi cấy.
Áp dụng kết quả đạt được từ các nghiên cứu trước, chúng tơi chọn mơi trường nuơi cấy là : MS, ½ MS (Murashige và Skoog, 1962). Trong đĩ mơi trường ½ MS cĩ thành phần đa lượng của mơi trường MS giảm đi một nửa, ngồi ra mơi trường cĩ bổ sung các thành phần như:
- Đường 30g/l. - Agar 8 g/l.
- Nước dừa 10% thể tích.
- pH mơi trường trước khi hấp khử trùng là 5,8 (điều chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N). Mơi trường sau khi pha chế được đổ vào bình tam giác cĩ dung tích 250 ml với thể tích 60 ml/bình, sau đĩ được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm
trong 20 phút. Sau đĩ được giữ ở nhiệt độ 250C trong 3-5 ngày để kiểm tra nhiễm trước khi cấy mẫu.
Tùy vào mục đích thí nghiệm, trong mơi trường bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng: 2,4-D, NAA, BA, Ki với các nồng độ khác nhau.
2.2.4. Điều kiện nuơi cấy.
Nhiệt độ phịng nuơi: 25 ± 20C.
Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày.
Độ ẩm phịng nuơi: 60 – 70%.
2.3. Nội dung nghiên cứu.
Quy trình nghiên cứu dự kiến như sau:
Nghiên cứu quy trình khử trùng mẫu Thí nghiệm 1: Tỷ lệ javen : nước cất là 1 : 2. Thời gian: 3, 5, 7, 10 phút. Thí nghiệm 2: Tỷ lệ javen : nước cất là 1 : 1. Thời gian: 3, 5, 7, 10 phút.
Nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo
Thí nghiệm 3:
½ MS + 2,4-D: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l.
Thí nghiệm 4:
½ MS + 2,4-D tối ưu + BA: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.4.1. Bố trí thí nghiệm.
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hồn tồn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm được lập lại 3 lần, 15 mẫu/lần. Mỗi bình tam giác chứa 60 ml mơi trường.
Nghiên cứu quá trình tái sinh chồi
Thí nghiệm 5: MS + Ki: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l. Thí nghiệm 6: MS + BA: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l.
Nghiên cứu quá trình nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 7:
MS + BA tối ưu + NAA: 0,2 mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8 mg/l.
Thí nghiệm 8:
MS + BA tối ưu + Ki: 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l.
Thí nghiệm 9:
MS + BA tối ưu + Ki + NAA (dựa vào kết quả thí nghiệm 7,8)
Nghiên cứu quá trình ra rễ
Thí nghiệm 10:
MS + 0,5 g/l than hoạt tính + NAA: 0,1mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l + 0,7mg/l.
2.4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian đến hiệu quả khử mẫu. quả khử mẫu.
Chất khử trùng là javen thương mại. Mơi trường được sử dụng là ½ MS Vật liệu vơ mẫu là lá non 2 tuần tuổi.
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen : nước cất là 1:2.
Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút)
NT1 3
NT2 5
NT3 7
NT4 10
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen : nước cất là 1:1.
Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút)
NT1 3
NT2 5
NT3 7
2.4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D, BA đến khả năng cảm ứng tạo mơ sẹo.
Mơi trường nuơi cấy là ½ MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng theo bố trí thí ngiệm ở bảng 2.3 và 2.4.
Vật liệu thí nghiệm là các mẫu lá khử trùng thành cơng.
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo.
Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D (mg/l) ĐC 0 NT1 0,2 NT2 0,4 NT3 0,6 NT4 0,8
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA trong quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo.
(A là nồng độ tối ưu của 2,4-D thu được ở thí nghiệm 3)
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
2,4-D BA
NT1 A 0,5
NT2 A 1,0
NT3 A 1,5
2.4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của Ki và BA đến quá trình tái sinh chồi.
Mơi trường nuơi cấy là MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng như bố trí thí nghiệm trong bảng 2.5 và 2.6.
Vật liệu thí nghiệm là mơ sẹo thu được từ thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo.
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của Ki lên khả năng tái sinh chồi.
Nghiệm thức Nồng độ Ki (mg/l) ĐC 0 NT1 0,5 NT2 1,0 NT3 1,5 NT4 2,0
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi.
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) ĐC 0 NT1 0,5 NT2 1,0 NT3 1,5 NT4 2,0
2.4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Ki, NAA đến khả năng nhân nhanh chồi.
Mơi trường nuơi cấy là MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng như bố trí thí nghiệm trong bảng 2.7, 2.8 và 2.9.
Vật liệu thí nghiệm là các cụm chồi thu được từ thí nghiệm tái sinh chồi.
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng nhân nhanh chồi
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
BA NAA ĐC B 0 NT1 B 0,2 NT2 B 0,4 NT3 B 0,6 NT4 B 0,8
(B là nồng độ BA tối ưu cho quá trình tái sinh chồi)
Bảng 2.8. Ảnh hưởng của BA và Ki lên khả năng nhân nhanh chồi
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
BA Ki ĐC B 0 NT1 B 0,2 NT2 B 0,4 NT3 B 0,6 NT4 B 0,8
Bảng 2.9. Ảnh hưởng của BA, Ki và NAA lên khả năng nhân nhanh chồi
Nghiệm thức
Nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng (mg/l)
BA Ki NAA ĐC B C 0 NT1 B C 0,1 NT2 B C 0,2 NT3 B C 0,3 NT4 B C 0,4
Trong đĩ: B là nồng độ BA tối ưu cho quá trình tái sinh chồi. C là nồng độ Ki tối ưu ở thí nghiệm 8.
2.4.1.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ.
Mơi trường nuơi cấy là MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng như bố trí thí nghiệm trong bảng 2.10.
Vật liệu thí nghiệm là các chồi cây thu được từ thí nghiệm nhân nhanh chồi.
Bảng 2.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ.
Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) Nồng độ NAA (mg/l)
ĐC 0,5 0
NT1 0,5 0,1
NT2 0,5 0,3
NT3 0,5 0,5
2.4.2. Phƣơng pháp tiến hành.
2.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu.
Cây được chọn để lấy mẫu là những cây sinh trưởng khỏe, khơng bị sâu bệnh thường được lấy vào buổi sáng của ngày khơ ráo và cĩ nắng, trên mỗi cây lựa chọn những lá non từ 2 tuần tuổi, vừa xịe ra, tương đối đồng đều.
Hình 2.1.Mẫu lá 2 tuần tuổi. 2.4.2.2. Phương pháp xử lý khử trùng mẫu.
Bước 1:
- Mẫu lá được rửa sơ bằng nước sạch vài lần, tránh làm dập mẫu. - Ngâm trong nước xà phịng lỗng từ 10-15 phút.
Bước 2:
- Rửa sạch xà phịng dưới vịi nước chảy từ 15-20 phút. - Tráng lại bằng nước cất, chuyển vào tủ cấy.
Bước 3:
- Tráng lại bằng nước cất từ 3-5 lần.
- Ngâm trong dung dịch javen trong thời gian từ 3-10 phút tùy theo từng cơng thức khử trùng.
- Tráng lại bằng nước cất từ 3-5 lần.
Trong quá trình khử trùng, mẫu cấy được ngâm ngập hồn tồn trong mơi trường xử lý. Những phần mơ bị tác nhân vơ trùng làm dập cũng được loại bỏ trước khi cấy vào mơi trường.
2.4.2.1. Phương pháp cấy mẫu.
Mẫu lá sau khi được khử trùng được cắt thành những phần nhỏ kích thước là 1cm2, đưa vào ống nghiệm chứa mơi trường khơng cĩ chất điều hịa sinh trưởng.
Mơ sẹo được chọn với trạng thái, kích thước đồng nhất 0,5 cm2 để cấy vào các bình tam giác chứa mơi trường MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau.
Cụm chồi được lựa chọn để bố trí thí nghiệm nhân nhanh cĩ đường kính cụm chồi 0,5 cm cĩ 3 chồi được cấy vào các bình tam giác chứa mơi trường MS cĩ bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau.
2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi và phƣơng pháp xác định.
2.4.3.1. Giai đoạn khử trùng mẫu.
Thời gian theo dõi: 2, 4 tuần sau khi nuơi cấy. Tỷ lệ nhiễm (%) =
∑ số mẫu nhiễm ∑ số mẫu đưa vào
× 100
Tỷ lệ thành cơng (%) =
∑ số mẫu đưa vào × 100 ∑ số thành cơng
2.4.3.2. Giai đoạn cảm ứng tạo mơ sẹo.
Quan sát sự thay đổi hình thái mẫu cấy theo thời gian Thời gian theo dõi: 4, 7, 10 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.3. Giai đoạn tái sinh chồi.
X: số chồi cây.
N: số mẫu cĩ chồi tái sinh.
Chất lượng chồi cây: số lá, chiều cao chồi, tình trạng chồi Thời gian theo dõi: 6 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.4. Giai đoạn nhân nhanh chồi.
∑ số mẫu tạo sẹo ∑ số mẫu nuơi cấy
Tỷ lệ tạo calus (%) = × 100 n i i Xi 1 N
Số chồi trung bình / mẫu = × 100
∑ số chồi tạo thành ∑ số chồi ban đầu nuơi cấy Hệ số nhân (lần) =
∑ chiều cao các chồi theo dõi ∑ số chồi theo dõi
Chiều cao TB của chồi (cm) =
∑ số mẫu nuơi cấy
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) = × 100 ∑ Số mẫu tái sinh chồi
Tỷ lệ cảm ứng với mơi trường nuơi cấy (%) =
∑ số mẫu phản ứng
∑ số mẫu nuơi cấy
Chất lượng chồi cây:thể hiện số lá/chồi, chiều cao trung bình/chồi. Tình trạng chồi:
+++ : Tốt (chồi phát triển mạnh, thân to, lá to xanh đậm) ++ : Trung bình (chồi nhỏ, thân nhỏ, lá nhỏ xanh)
+ : Yếu (chồi nhỏ, lá rất nhỏ hoặc chưa hồn chỉnh hình thái, xanh nhạt) Thời gian theo dõi: 6 tuần sau khi nuơi cấy.
2.4.3.5. Giai đoạn ra rễ.
Thời gian theo dõi sau 6 tuần nuơi cấy.
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý thơng kê mơ tả bằng phần mềm SPSS 18 và Microsoft Excel. Các nghiệm thức được so sánh dựa trên kết quả phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA single factor) với kiểm định Duncan.
∑ lá của các chồi theo dõi
∑ số chồi theo dõi Số lá TB/chồi (lá/chồi) =
∑ số chồi nuơi cấy
Tỷ lệ ra rễ (%) = × 100
∑ chồi ra rễ
∑ chiều dài rễ các chồi theo dõi ∑ số chồi theo dõi
Chiều dài TB của rễ (cm) =
∑ rễ của các chồi theo dõi ∑ số chồi theo dõi Số rễ TB/chồi (rễ/chồi) =
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 3.1. Nghiên cứu quy trình khử trùng mẫu.
Mẫu cây ngồi tự nhiên thường bị nhiễm một số loại nấm, vi khuẩn, virus,…nên khi đưa mẫu vào nuơi cấy in vitro cần tiến hành khử trùng mẫu để loại bỏ nguồn nhiễm bệnh này. Đây là yếu tố quan trọng để tạo nguồn vật liệu ban đầu để phục vụ các giai đoạn nghiên cứu khác của quy trình nhân giống in vitro. Phương pháp khử trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là sử dụng các hĩa chất cĩ hoạt tính diệt khuẩn cao như hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già,….Mỗi loại hố chất hiệu quả xử lý mẫu khác nhau. Tùy thuộc đặc điểm, tình trạng mẫu sẽ khử trùng mẫu với nồng độ cao hay thấp và thời gian khử trùng dài hay ngắn. Việc khử trùng thành cơng khi tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất, khả năng mẫu sống và tái sinh mẫu đạt cao nhất.
Với nguồn vật liệu ban đầu là mẫu lá non 2 tuần tuổi được trồng trong nhà lưới nên trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng dịch javen thương mại làm chất khử trùng. Đây là loại hĩa chất dễ tìm, rẻ tiền, dễ sử dụng, ít gây độc người thao tác. Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ javen:nước là 1:3 phù hợp cho các mẫu dễ khử trùng như hạt phấn, lá,...; tỷ lệ 1:2 đối với những mẫu tương đối khĩ khử trùng như chồi đỉnh, chồi bên,…và tỷ lệ 1:1 dùng cho các mẫu khĩ khử trùng như hạt, củ, rễ,…với thời gian khử trùng từ 15 – 30 phút [14]. Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng tỷ lệ javen:nước cất tương ứng 1:2 và 1:1 để khảo sát hiệu quả khử trùng với thời gian khử trùng là 3, 5, 7, 10 phút. Kết quả được ghi nhận tại bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen:nước là 1:2. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) (sau 2 tuần) Tỷ lệ mẫu sống (%) (sau 4 tuần) NT1 3 63,33 ± 3,33b 20,00 ± 5,77 bc NT2 5 35,55 ± 6,94b 41,11 ± 10,18d NT3 7 30,00 ± 3,33b 31,11 ± 5,09cd NT4 10 13,33 ± 0a 6,67 ± 5,77ab
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Qua bảng 3.1 và kết quả phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA single factor) với kiểm định Duncan thì:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất là 13,33% (NT4), nhưng tỷ lệ mẫu sống khơng cao chỉ đạt 6,67 ± 5,77%.
- Ở các nghiệm thức cịn lại thì tỉ lệ mẫu nhiễm khơng cĩ sự sai khác về mặt thống kê (P>0,05), dao động từ 30,00% đến 63,33% và tỷ lệ mẫu thành cơng nằm trong khoảng 31,11% đến 41,11% .
- Hiệu quả khử trùng cao nhất khi sử dụng tỷ lệ javen:nước tương ứng 1:2 với thời gian khử trùng 5 phút. Kết quả tỷ lệ mẫu sống đạt 41,11 ± 10,18% sau 4 tuần vơ mẫu.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tại tỷ lệ javen:nước là 1:1. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) (sau 2 tuần) Tỷ lệ mẫu sống (%) (sau 4 tuần) NT1 3 50,00 ± 13,33c 26,67 ± 20cd NT2 5 11,11 ± 5,09b 62,22 ± 10,18e NT3 7 9,44 ± 5,09b 15,56 ± 9,62abc NT4 10 0,00a 0,00a
Ghi chú: Giá trị biểu thị là TB ± SD, n = 3. Trong cùng một cột, giá trị trung bình kèm theo chữ cái thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Qua bảng 3.2 cho thấy:
- Tỷ lệ nhiễm cĩ sự khác biệt rõ theo 3 nhĩm: nhĩm 1 (NT1) tỷ lệ nhiễm vẫn cịn cao là 50,00 ± 13,33%; nhĩm 2 (NT2, NT3) tỷ lệ nhiễm giảm đáng kể, dao động từ 9,44 – 11,11%; nhĩm 3 (NT4) khơng cĩ mẫu nào nhiễm.
- Hiệu quả khử trùng cao nhất với thời gian khử trùng là 5 phút, khi đĩ tỷ lệ nhiễm cịn 11,11 ± 5,09% và tỷ lệ mẫu sống là 62,22 ± 10,18% (NT2).
Qua biểu đồ 3.1, chúng tơi nhận thấy:
- Ở cùng một tỷ lệ chất khử trùng, khi thời gian khử trùng tăng thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm. Ở tỷ lệ javen : nước cất là 1:2 khi thời gian khử trùng là 3 – 5 – 7 – 10 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm tương ứng là 63,33 ± 3,33% - 35,55 ± 6,94% - 30,00 ± 3,33% - 9,44 ± 5,09% - 0,00%.
- Ở cùng một khoảng thời gian khử trùng, khi tăng tỷ lệ javen:nước lên thì tỷ lệ nhiễm giảm. Với thời gian khử trùng mẫu cùng là 5 phút, tại tỷ lệ javen : nước là 1:2 thì tỷ lệ nhiễm là 35,55 ± 6,94% và khi tăng tỷ lệ này lên 1:1 thì tỷ lệ nhiễm giảm cịn 11,11 ± 5,09%.
- Đối với tỷ lệ mẫu sống thì chỉ tiêu này phụ thuộc vào lượng mẫu nhiễm và mẫu chết của các nghiệm thức. Sự tương quan này được thể hiện theo cơng thức sau:
Trong đĩ: Số mẫu nuơi cấy ban đầu là 100%.
Theo cơng thức trên và các bảng 3.1, 3.2 ta thấy, khi tiến hành khử trùng mẫu trong thời gian 7, 10 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhưng tỷ lệ mẫu thành cơng khơng cao, như vậy tỷ lệ mẫu chết ở các nghiệm thức này cao hơn các nghiệm thức khác. Điều này cho thấy, khi nồng chất khử trùng càng cao và thời gian khử trùng càng kéo dài đã làm tổn thương và dẫn đến tình trạng chết mẫu.
Như vậy, hiệu quả cao nhất khi khử trùng mẫu lá Hồng mơn trong nghiên cứu này, sử dụng tỷ lệ javen:nước là 1:1 với thời gian khử trùng 05 phút cho tỷ lệ mẫu thành cơng cao nhất là 62,22 ± 10,18%.