Chất điều hịa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ cĩ bản chất hĩa học khác nhau, được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ phận nhất định của cây để điều hịa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hịa giữa các cơ quan, các bộ phận trong cơ thể thực vật.
Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hĩa mơ, phát sinh phơi, tác động lên chức năng của DNA và RNA, ảnh hưởng lớn đến các quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá trình sinh
tổng hợp enzyme, hơ hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp,… Do đĩ, chúng cĩ tác dụng điều hịa sinh trưởng, phát triển của cây và là yếu tố quan trong nhất trong mơi trường quyết định kết quả nuơi cấy.
Chất điều hịa sinh trưởng thực vật bao gồm: Nhĩm auxin, nhĩm cytokinine, gibbereline, acia abscisic, ethylene.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuơi cấy. Theo Murashige (1980), quá trình phân hĩa chồi phụ thuộc vào tỷ lệ auxin và cytokinine trong mơi trường nuơi cấy. Nếu tỷ lệ cytokinine/auxin cao sẽ kích thích sự hình thành chồi, thấp sẽ kích thích sự hình thành rễ và nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thì sẽ thuận lợi cho quá trình hình thành mơ sẹo.
1.2.2.2. Nhĩm các auxin [3], [4].
Mơi trường nuơi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: IAA: 1H- indole-3-acetic acid.
NAA: 1-naphthaleneacetic acid. IBA: 1H-indole-3-butyric acid.
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid.
IAA là auxin tự nhiên cĩ trong mơ thực vật; cịn lại NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo cĩ hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hĩa auxin khơng cĩ tác dụng.
Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormonee thuộc nhĩm này cĩ các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lĩng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hĩa mạch dẫn.
Auxin cĩ tác dụng hoạt hĩa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thơng qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất trương. Auxin cũng cĩ ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ.
Các auxin cĩ thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuơi cấy mơ và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mơ sẹo, tạo phơi vơ tính, tạo rễ,…
Auxin là nhĩm chất điều hịa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuơi cấy mơ tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của mơi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mơ sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nĩ được phối hợp sử dụng với các cytokinine.
Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuơi cấy mơ, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào tạo sẹo và phân hĩa rễ. Những auxin dùng rộng rãi trong nuơi cấy mơ là IBA, IAA, NAA, 2,4-D. Trong đĩ, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho mơi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng trong việc đẩy nhanh quá trình tạo chồi. 2,4-D rất cĩ hiệu quả đối với mơi trường tạo và phát triển mơ sẹo.
1.2.2.3. Nhĩm cytokinine [3], [4].
Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: BAP: 6-benzylaminopurine
BA: 6-benzyladenin
2-iP: 6---dimethyl-aminopurine
Kinetine: N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine
Zeatin: 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine
Trong đĩ Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, cịn BA và kinetine là các cytokinine nhân tạo.
Các cytokinine là dẫn xuất của adenine, đây là những hormonee liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hĩa chồi trong nuơi cấy mơ.
- BA là một cytokinine tổng hợp cĩ tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển chồi phổ biến và trong một số trường hợp BA là một chất khơng thể thay thế.
- Kinetine kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuơi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế ở các mơ khơng phân hĩa.
- Zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin. Trong thực tiễn nuơi cấy mơ người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetine hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đĩ là BAP.
Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetine và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao. BAP cĩ khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất.
Chức năng chủ yếu của các cytokinine được khái quát như sau: - Kích thích phân chia tế bào.
- Kích thích phát sinh chồi trong nuơi cấy mơ .
- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh.
- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào. - Cĩ thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số lồi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao). - Ức chế sự hình thành rễ.
- Ức chế quá trình già (hố vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục. 1.2.2.4. Nhĩm Gibberelline [3], [4].
Trong đời sống thực vật gibberelline đĩng vai trị quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật.
Nhưng trong nuơi cấy mơ và tế bào thực vật tác dụng của gibberelline chưa thật rõ ràng. Nhiều tác giả cĩ sử dụng và coi đĩ là thành phần khơng thể thiếu của một loại mơi trường chuyên dụng nào đĩ.
Gibberelline cĩ các chức năng cơ bản sau:
- Các mơ phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phơi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều cĩ chứa nhiều gibberellic axit.
- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và địng lúa sau khi phun gibberelline, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thường bị thiếu gibberelline.
- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch. - Kiểm sốt sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đầu thân mầm nằm in, sau mùa đơng mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hố hoa.
- Ức chế sự hình thành rễ bất định.
- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hố các chất dự trữ trong nội nhũ để nuơi mầm cây.
- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ).
- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn.
- Cĩ thể gây tạo quả khơng hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho khơng hạt. - Cĩ thể làm chậm sự hố già ở lá và quả cây cĩ múi.
1.2.2.5. Abscisic acid (ABA) [3], [4].
ABA thuộc nhĩm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đĩng khí khổng.
ABA cịn cĩ tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào mơi trường nuơi cấy và mang lại hiệu quả nhất định.
Trong nuơi cấy mơ và tế bào, ABA cĩ tác dụng tạo phơi vơ tính, kích thích sự chín của phơi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều lồi thực vật.
Các tác dụng cơ bản của ABA là:
- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả.
- ABA thường được sản sinh khi cĩ các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đĩng băng.
- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt.
- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm sốt sự kéo dài thân cành. - Gây ra sự đĩng khí khổng.
1.2.2.6. Ethylene [3], [4].
Các chức năng cơ bản của ethylene:
- Gây già hố lá, kích thích sự rụng lá và quả. - Làm chín quả.
- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hố, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh.
- Điều khiển sự chín của một số loại quả.
- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xồi, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene.
- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hố của hoa và lá
1.2.3. Vật liệu nuơi cấy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo lý thuyết tất cả các mơ chưa hĩa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mơ phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phơi đang phát triển, thịt quả non..., khi đặt vào mơi trường cĩ chứa một lượng hormone thích hợp đều cĩ khả năng tạo mơ sẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mơ khác nhau cĩ khả năng tạo mơ sẹo, phân hĩa rễ, thân, cành, lá,...rất khác nhau. Do đĩ, kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuơi cấy. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuơi cấy cĩ vai trị quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ khơng thu được kết quả, hoặc thu được những cây khơng phát triển mạnh, thậm chí cây cĩ thể ngừng phát triển ở
một giai đoạn nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vơ tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến chồi bên và mơ phân sinh đỉnh.
1.2.4. Điều kiện vơ trùng.
Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ chứa đường, muối khống và vitamin, thích hợp cho các lồi nấm, vi khuẩn phát triển. Do đĩ tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu mơi trường nuơi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần tồn bộ bề mặt mơi trường nuơi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, buộc phải loại bỏ thí nghiệm vì mơ nuơi cấy sẽ khơng phát triển và chết dần trong điều kiện này.
Để đảm điều kiện vơ trùng trong quá trình nuơi cấy địi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:
- Vơ trùng mơ cấy.
- Vơ trùng dụng cụ thủy tinh, mơi trường và nút đậy.
- Trong thao tác nuơi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt mơi trường nuơi cấy.
Mơ cấy cĩ thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với mơi trường bên ngồi mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vơ trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng hĩa chất cĩ hoạt tính diệt nấm, vi khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mơ cấy. Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng khơng triệt để và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của mơ cấy. Ngồi ra, người ta cịn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol, cồn 70%...[23]
Bảng 1.1. Một số hĩa chất khử trùng thơng dụng [5] STT Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) 1 Calcium hypocholorite 9 - 10 5 - 30 2 Sodium hypocholorite 0.5 - 5 5 - 30 3 Hydrogen peroxide 3 - 12 5 - 15 4 Bromine water 1 - 2 2 - 10 5 Ethyl alcohol 70 - 95 0.1 - 5.0 6 Silver nitrate 1 5 - 30 7 Murcuric choloride 0.1 - 1.0 2 - 10 8 Benzalkonium choloride 0.01 - 0.1 5 - 20 9 Antibiotics 4 - 50 mg/l 30 - 60
Trong quá trình xử lý mơi cấy phải ngập hồn tồn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn, với các bộ phận cĩ bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch xà phịng và rửa lại dưới vịi nước chảy. Sau khi xử lý xong, mơ nuơi cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vơ trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vơ trùng trước khi đặt lên mơi trường nuơi cấy nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vơ trùng lên mơ cấy (Trần Văn Minh, 2004). Để tăng hiệu quả khử trùng người ta thường kết hợp nhiều loại hĩa chất khác nhau.
1.2.5. Điều kiện nuơi cấy. 1.2.5.1. Nhiệt độ. 1.2.5.1. Nhiệt độ.
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mơ. Ảnh hưởng của nhiệt độ bên trong và bên ngồi. Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nĩi chung, ngồi ra nĩ cịn ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của từng tế bào riêng rẻ và khả năng tạo các cơ quan của mơ nuơi cấy.
Trong nuơi cấy mơ in vitro, mỗi một lồi cĩ biên nhiệt độ thích nghi khác nhau. Nhiệt độ được hạn chế trong hệ thống nuơi cấy nên mơ nuơi cấy sẽ dễ thích nghi hơn với mơi trường. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nuơi cấy in vitro chưa được xác đinh chính xác, nhưng nhiệt độ phịng nuơi cấy khoảng từ 20 – 270C là được sử dụng nhiều nhất.
1.2.5.2. Ánh sáng.
Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phân hĩa của mơ và hình thái của cây. Các chỉ tiêu cần chú ý là: cường độ ánh sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng.
Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh trưởng và sự hình thành các cơ quan của mơ cấy. Cường độ ánh sáng trong phịng thí nghiệm thường ở mức 2000-3000 lux.
Chu kỳ chiếu sáng cũng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình phát triển cây. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các lồi cây là 12 – 16 giờ/ngày.
Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khơng nhỏ đến quá trình sinh trưởng của mơ cấy và cĩ liên quan đến sự thay đổi nồng độ hormone nội sinh. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, cịn ánh sáng xanh sẽ ức chế sinh trưởng chiều cao nhưng tốt đối với sự sinh trưởng của mơ sẹo.
1.3. Giới thiệu về cây hồng mơn (Anthurim andreanum).
1.3.1. Nguồn gốc và phân loại thực vật.
Giới: Plantae Bộ: Alismatales Họ: Araceae Chi: Anthurium
Họ Ráy hoặc họ Mơn, họ Chân bê là một họ thực vật một lá mầm, trong đĩ hoa của chúng được sinh ra theo một kiểu cụm hoa được gọi là bơng mo. Họ này cĩ 107 chi và trên 3.700 lồi. Hồng mơn, được nhập nội vào Việt Nam cĩ khoảng 30 chi và 130-140 lồi thuộc họ Ráy.
1.3.2. Đặc điểm thực vật học.
Đặc điểm hình thái:
Hình 1.1. Cây Hồng mơn Anthurium andraeanum.
- Cây Hồng Mơn mọc thành bụi, sống lâu năm, thân ngắn. Lá mọc tập trung trên mặt đất, dạng bầu dục thuơn nhọn đầu rộng từ 5 – 7 cm, dài 7 -12 cm, gốc tim, cuống dài cong, kích thước trung bình của cuống lá dài từ 20 – 30 cm, rũ xuống. Lá màu xanh bĩng dài, nổi bật gân chân vịt màu xanh nhạt.
- Hoa mọc ra từ nách lá, hoa cĩ cấu tạo đặc trưng gồm một cuống hoa dài, trên cĩ một bản to hình trái tim, cĩ thể cĩ màu đỏ, hồng, cam, trắng…,quả mọng,sự biến thái sắc màu của hoa Tiểu Hồng Mơn rất kì diệu. Khi hoa cịn non thì màu rực