Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo Spirulina platensis (Geitler, 1925) nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S.. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của chính bản thân Các số liệu, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ nghiên cứu nào

Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Men

 Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản – Đại học Nha Trang

 Phòng thí nghiệm bệnh học thủy sản và phòng thực tập sinh lý – sinh thái đã tạo điều kiện cơ sở vật chất giúp tôi hoàn thành tốt khóa học này

Đặc biệt cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn Th.S Trần Thị

Lê Trang đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo trong Khoa Nuôi trồng Thủy sản đã cung cấp kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn quan tâm, giúp đỡ và động viên để tôi hoàn thành tốt khóa học

Xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm sinh học của Spirulina 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái 4

1.1.4 Cấu tạo 4

1.1.5 Sinh sản 5

1.1.6 Sinh trưởng 5

1.2 Thành phần hóa học của Spirulina 6

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tảo 10

1.3.1 Ánh sáng 10

1.3.2 Nhiệt độ 11

1.3.3 Độ mặn 12

1.3.4 pH 12

1.3.5 Sục khí/ xáo trộn nước 12

1.3.6 Các yếu tố dinh dưỡng 13

1.4 Một số ứng dụng của vi tảo Spirulina 16

1.4.1 Trong nuôi trồng thủy sản 16

1.4.2 Trong công nghiệp 16

1.5 Lịch sử nghiên cứu và phát triển nuôi sinh khối tảo Spirulina 17

1.5.1 Trên thế giới 17

1.5.2 Ở Việt Nam 18

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 20

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Chuẩn bị các điều kiện thí nghiệm 20

2.2.1 Nguồn nước 20

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 20

2.3 Các loại môi trường dinh dưỡng sử dụng trong thí nghiệm 20

2.3.1 Môi trường f/2 (Guillard, 1975) 20

2.3.2 Môi trường TT3 21

2.3.3 Môi trường HBM – 95 22

2.4 Bố trí thí nghiệm 22

2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 22

2.4.2 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm 23

2.4.3 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm 23

2.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu 24

2.5.1 Phương pháp xác định sinh trưởng của tảo 24

2.5.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu môi trường 25

2.6 Phương pháp xử lí số liệu 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm 26

3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm 28

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

4.1 Kết luận 32

4.2 Kiến nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần sinh hóa của tảo Spirulina 7

Bảng 1.2 Thành phần vitamin và khoáng của tảo Spirulina 8

Bảng 1.3 Thành phần tế bào của tảo Spirulina 8

Bảng 1.4 Thành phần acid amin của sinh khối tảo Spirulina 9

Bảng 2.1 Môi trường f/2 21

Bảng 2.2 Môi trường TT3 21

Bảng 2.3 Môi trường HBM – 95 22

Bảng 3.1 Khoảng biến động các yếu tố môi trường trong thí nghiệm 1 26

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis 27

Bảng 3.3 Khoảng biến động các yếu tố môi trường trong thí nghiệm 2 28

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tảo Spirulina platensis 3

Hình 1.2 Sơ đồ vòng đời của tảo Spirulina 5

Hình 1.3 Pha sinh trưởng của vi tảo 6

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí nghiệm 22

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm 1 23

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm 2 24

Hình 2.4 Phương trình tương quan giữa OD và khối lượng khô của tảo S platensis 25

Hình 3.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis 26

Hình 3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo S platensis 29

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Trong sản xuất giống các đối tượng hải sản, vi tảo là nguồn thức ăn quan trọng, quyết định đến hiệu quả nuôi Ngoài việc sử dụng làm thức ăn cho đối tượng nuôi, vi tảo còn được biết đến với vai trò là giúp ổn định và tạo môi trường nuôi tự nhiên

Tảo Spirulina là một loài tảo có giá trị dinh dưỡng rất cao với hàm lượng protein đạt 60 – 70% trọng lượng khô và chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu Ngoài

ra, kỹ thuật nuôi đơn giản và thời gian sản xuất hầu như quanh năm cũng là lợi thế khi nuôi sinh khối loài tảo này Chính vì vậy, những ứng dụng của tảo không chỉ là nguồn dinh dưỡng quý mà còn được ứng dụng nhiều trong y – dược học

Ở Việt Nam, tảo Spirulina đã được nuôi thử nghiệm vào năm 1976 và đã nuôi trồng ở nhiều tỉnh thành nhưng quy mô nhất là tại công ty Vĩnh Hảo, Bình Thuận [12] Tuy nhiên, ở nước ta Spirulina chỉ mới được nuôi trồng ở các vùng nước ngọt hoặc nước khoáng với độ mặn thấp (7 – 8‰) Trong khi đó, Spirulina nuôi trong môi trường nước mặn đã được chứng minh có những ưu điểm vượt trội hơn so với nuôi trong môi trường nước ngọt thể hiện ở số lượng chất có hoạt tính sinh học cao (polysaccharides, inostiol và phycocyanin), các nguyên tố vi lượng, hàm lượng protein, lipid, các axít béo thiết yếu (DHA, EPA, ARA, LA, LOA…) [23] Tảo Spirulina nuôi trong môi trường nước mặn còn dễ tiêu hóa và hấp thu hơn so với nuôi trong nước ngọt (trích theo [12])

Ngoài giá trị dinh dưỡng cao, nuôi tảo Spirulina trong môi trường nước mặn còn góp phần tiết kiệm một lượng lớn các chất khoáng đa lượng, vi lượng bổ sung và tận dụng tốt tiềm năng diện tích nước mặn sẵn có ở nước ta Tuy nhiên, những nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái, dinh dưỡng lên sự sinh trưởng và phát triển cũng chỉ mới tập trung vào tảo Spirulina khi nuôi trong môi trường nước ngọt Các nghiên cứu về tảo Spirulina khi nuôi trong môi trường nước mặn ít được quan tâm Vì

vậy, tôi xin làm đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo Spirulina platensis (Geitler, 1925) nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm”

Mục tiêu của đề tài: Xác định cường độ ánh sáng và môi trường dinh dưỡng

thích hợp cho sinh trưởng của quần thể tảo Spirulina platensis

Nội dung:

1 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo

Spirulina platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể

tảo Spirulina platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm

Ý nghĩa của đề tài:

 Về khoa học: xây dựng cơ sở khoa học cho việc nuôi sinh khối tảo Spirulina

platensis ngoài trời trong nước mặn

 Về thực tiễn: cung cấp nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho con người cũng như phục vụ công tác sản xuất giống và nuôi các đối tượng thủy sản

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học của Spirulina

1.1.1 Vị trí phân loại

Ngành: Cyanophyta

Lớp: Cyanophyceae

Bộ: Oscillatoriales Họ: Oscillatoriaceae Giống: Spirulina

Loài: Spirulina platensis (Geitler, 1925) [34]

Tên gọi khác: Arthrospira platensis [22]

Hình 1.1 Tảo Spirulina platensis (độ phóng đại 400 lần)

1.1.2 Phân bố

Theo Cifferi & Tiboni (1985) [34], Spirulina là một loại tảo lam xuất hiện sớm nhất trên trái đất cùng với vi khuẩn Có khoảng 2500 loài, sống phổ biến trong nước ngọt, các ao hồ có nhiều chất hữu cơ, một số có thể sống trong nước mặn, nước lợ, nơi bùn lầy hay ẩm ướt, trên đá trong tuyết và cả những suối nước nóng tới 69oC Đặc biệt thích nghi ở những nơi có độ kiềm cao (pH từ 8,5 – 11)

Trên thế giới, tảo S platensis có nhiều ở miền Bắc và Nam Châu Phi, Bắc và

Nam Châu Mỹ, Nam và Trung Châu Á,… các vùng hồ tự nhiên giàu NaHCO3 Ở Việt

Nam, tảo S platensis phân bố khắp miền từ sông, ao, hồ, ruộng lúa, vũng nước [34].

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Tảo Spirulina có màu xanh lục, dạng xoắn lò xo, sợi tảo (trichome) có 5 – 7 vòng (có khi lên đến 27 vòng) đều nhau không phân nhánh, ở hai đầu sợi tảo thường hẹp, mút lại Đường kính vòng xoắn từ 35 – 50µm, bước xoắn 60µm Chiều dài thay đổi có thể đạt được 0,25mm, có khi lớn hơn [34]

Tảo Spirulina không có màng bằng cellulose, không có lục lạp, không có không bào, không có tế bào dị hình và chưa có nhân điển hình [34] Tảo có khả năng vận động theo kiểu trượt xung quanh trục của nó, vận tốc có thể đạt 5 micron/giây

Trong quá trình nuôi trồng, nhất là ngoài tự nhiên tế bào có thể duỗi thẳng ra thành hai dạng: xoắn và thẳng, tỷ lệ xoắn – thẳng khoảng 15 – 85 [7] Các nghiên cứu cho thấy rằng: trong các điều kiện dinh dưỡng khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của 2 dạng thẳng và xoắn như nhau; hàm lượng protein ở 2 dạng thẳng và xoắn gần như nhau (ở mọi điều kiện về dinh dưỡng và ánh sáng như nhau); vào mùa hè tốc độ sinh trưởng của dạng thẳng kém hơn dạng xoắn và nếu trong thành phần dinh dưỡng thiếu các nguyên tố vi lượng và hàm lượng NaHCO3 thấp sẽ dẫn tới số vòng xoắn giảm và đường kính vòng xoắn tăng [34]

1.1.4 Cấu tạo

Theo Hedenskog G và Hifsten A.V (1980) [34], tảo được cấu tạo từ một sợi đa bào, mỗi tế bào của sợi tảo rộng 5µm, dài 2mm Không có lục lạp mà chỉ có các thilacoit phân bố trong toàn bộ tế bào Không có không bào nhưng lại có không bào khí Không có lục lạp mà chỉ có thilacoid phân bố trong toàn bộ tế bào Phycobiliprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid, lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocianin và phần trong cùng có allphycoyanin Thành tế bào có cấu trúc nhiều lớp chứa mucopolymer, pectin và các loại polysaccharide khác Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm

Spirulina có khả năng tạo ra các không bào khí nhỏ (gas vesicle) có đường kính

cỡ 70nm và được cấu trúc từ các sợi protein bện lại Cũng như các tảo lam khác: chúng chưa có nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa AND [1]

1.1.5 Sinh sản

Theo Cifferri (1985) và Richmond (1966) [34], thì Spirulina có một vòng đời khá đơn giản Một trichome trưởng thành bị cắt thành nhiều mảnh thông qua sự phân lập, những tế bào chuyên biệt necridia và sẽ tiêu giảm cho đến khi tạo các đĩa tách rời

và lõm ở hai mặt Kết quả sự phân cắt trichome là sự tạo những chuỗi ngắn (2 – 4 tế bào) gọi là hormogonia, tách xa sợi mẹ Các tế bào trong hormogonia mất phần gắn chặt của tế bào necridia trở nên tròn ở hai đầu nhưng vách không dày lên thêm Trong tiến trình sinh sản, các hạt trong tế bào chất dường như ít đi, tế bào có màu xanh nhạt

Sự vỡ ngẫu nhiên của trichome cùng với sự phân lập necridia bảo đảm sự tăng trưởng của sinh thể

Hình 1.2 Sơ đồ vòng đời của tảo Spirulina (Ciferri, 1985; trích theo [34])

Trong quá trình sinh sản nếu gặp điều kiện không thuận lợi tảo lam cũng hình thành bào tử bảo vệ giống như vi khuẩn Bào tử do những tế bào dinh dưỡng tạo nên, tích lũy nhiều chất dự trữ, bọc màng dày ở phía ngoài và khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử chui ra khỏi màng, nảy mầm thành tảo mới

Chu kì phát triển của tảo S platensis rất ngắn, thường xảy ra trong 24 giờ (trong

điều kiện phòng thí nghiệm), 3 – 5 ngày (trong điều kiện bán tự nhiên, tùy thuộc vào thời tiết), vì vậy có thể thu hoạch tảo quanh năm [7]

1.1.6 Sinh trưởng

Theo Coutteau (1996) [31], cho rằng sự phát triển của tảo nuôi trong điều kiện

vô trùng đặc trưng bởi 5 pha Cũng giống như những loài tảo khác, sinh trưởng của tảo

S platensis cũng đặc trưng bởi 5 pha:

 Pha thích nghi (pha chậm hay pha cảm ứng): ở pha này mật độ tế bào tăng ít

do sự thích nghi sinh lí của sự chuyển hóa tế bào để phát triển như: tăng các mức enzyme, các mức chuyển hóa liên quan đến sự phân chia tế bào và cố định cacbon

 Pha sinh trưởng theo hàm mũ: pha này mật độ tế bào tăng như hàm số của

thời gian theo hàm logarit:

C t = C 0 e mt

Trong đó:

 Ct, C0: mật độ tế bào tại t và 0 tương ứng

 m: tốc độ tăng trưởng đặc thù (phụ thuộc vào loài tảo, cường độ ánh sáng, nhiệt độ,…)

 Pha giảm tốc độ sinh trưởng: pha này sự phân chia tế bào sẽ chậm lại khi các

chất dinh dưỡng, ánh sáng, độ pH, CO2 hoặc yếu tố sinh hóa khác bắt đầu hạn chế sự sinh trưởng

 Pha ổn định: sinh khối tảo không tăng và đạt mật độ cực đại Quá trình quang

hợp và phân chia tế bào vẫn xảy ra trong suốt pha này nhưng số lượng tế bào mới sinh

ra gần ngang bằng với số lượng tế bào chết đi Do đó, ở pha này không có sự tăng trưởng về số lượng tế bào

 Pha tàn lụi: trong pha cuối cùng này, chất lượng nước xấu đi và các chất dinh

dưỡng cạn kiệt tới mức không thể duy trì được sự sinh trưởng Mật độ giảm nhanh và cuối cùng công việc nuôi bị dừng lại

Hình 1.3 Pha sinh trưởng của vi tảo [10]

1.2 Thành phần hóa học của Spirulina

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả Clenment (1975), Busson (1971), Santillan (1982) và Pirt (1984) [34] thì cho rằng: Spirulina là loài tảo giàu dinh dưỡng, đặc biệt

là protein và vitamin

Về thành phần acid amin ta thấy protein của Spirulina chứa tất cả acid amin, đặc biệt là acid amin không thay thế với hàm lượng khác cân đối, bằng hoặc vượt tiêu chuẩn của FAO quy định [34]

Bảng 1.1 Thành phần sinh hóa của tảo Spirulina (Clement, 1975; trích theo [34])

Bảng 1.2 Thành phần vitamin và khoáng của tảo Spirulina

Bảng 1.4 Thành phần acid amin của sinh khối tảo Spirulina

(Ngô Kế Sương, 1995; trích theo [34])

Chlorophyll-α là sắc tố quang hợp đầu tiên ở tất cả các loài tảo S platensis có

hàm lượng chlorophyll tổng số là 0,7% (tính theo khối lượng khô), hàm lượng caroten

là 0,23% (Clement, 1975; trích theo [5])

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tảo

1.3.1 Ánh sáng

Ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho sự phát triển và sinh trưởng của tảo Theo Coutteau (1996) [31] các vi tảo cũng quang hợp giống như tất cả các loài thực vật khác, nghĩa là chúng đồng hóa carbon vô cơ để chuyển hóa thành chất hữu cơ Quá trình tổng quang hợp quang hóa diễn ra theo phản ứng sau [16]:

Ánh sáng mặt trời 6CO2 + 6H2O C6H12O5 + 6O2

Chất diệp lục Ánh sáng chính là nguồn năng lượng điều khiển phản ứng này, vì vậy cường độ ánh sáng, chất lượng quang phổ và chu kỳ sáng cần phải được xem xét [31] Cường độ ánh sáng đóng một vai trò quan trọng, nhưng yêu cầu về cường độ ánh sáng thay đổi rất lớn theo độ sâu của môi trường nuôi và mật độ tảo: ở độ sâu lớn và mật độ tảo cao thì cường độ ánh sáng phải tăng để có thể xuyên qua được môi trường nuôi (1000 lux thích hợp với các bình tam giác, 5000 – 10000 lux cho các dung tích lớn hơn) Cường

độ ánh sáng quá lớn có thể làm ức chế quá trình quang hợp Tuy nhiên dù là chiếu sáng tự nhiên hay nhân tạo cũng cần tránh nóng quá mức

Trong phòng thí nghiệm, nguồn ánh sáng phổ biến được dùng để nuôi tảo là

“ánh sáng lạnh” của đèn huỳnh quang (40 – 80 watts) Từ những thí nghiệm, Kowallik (1987) (Harrison và cộng sự 1990; trích theo [12]) cho rằng ánh sáng màu xanh làm tăng hàm lượng protein của tảo, trong khi đó ánh sáng đỏ làm tăng hàm lượng hydratecarbon

Theo Hoàng Thị Bích Mai (1995) [9], nếu nuôi tảo trong điều kiện chiếu sáng liên tục thì không những không làm tăng năng suất của tảo mà còn làm giảm hàm lượng protein, cacbonhydrat và các acid béo không no HUFA Và Lê Viễn Chí (1996) [3], cũng cho rằng nên chiếu sáng cho tảo theo chu kỳ ngày đêm để các sản phẩm quang hợp được tạo ra trong thời gian chiếu sáng có thể được đồng hóa hoàn toàn trong thời gian tối

Brand và Guillard (1981) (trích theo [18]) khi nghiên cứu trên 22 loài tảo cho thấy có một số loài tảo không tăng trưởng trong điều kiện chiếu sáng liên tục Một số tăng trưởng tốt nhất ở chế độ 14 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối trong ngày đêm Còn một

số tăng trưởng rất tốt trong điều kiện chiếu sáng liên tục Nhưng theo Guillard (1975)

[26], chỉ những loài vi tảo được nuôi làm thức ăn mới thích ứng trong điều kiện chiếu sáng liên tục và ánh sáng khuếch tán chứ không phải ánh sáng mặt trời trực tiếp

Cường độ chiếu sáng tối ưu cho hầu hết các loài vi tảo từ 2500 – 5000 lux [33] Spirulina quang hợp mạnh nhất khi nuôi ở ánh sáng có cường độ là 24000 – 30000 lux

[34] Đối với S maxima tốc độ tăng trưởng cao nhất ở 30000 lux nhưng không chịu

được lâu Từ cường độ ánh sáng 24000 – 60000 lux, tảo bị vàng ở ngày thứ 3 và cấu trúc bị phá hủy [34] Còn theo Fine Vitch (1979) và Charenkova C.A (1997) [34] tốc

độ sinh trưởng và tích lũy chất khô tăng cường độ ánh sáng từ 5400 – 90500 lux Cường độ ánh sáng quá cao làm ức chế quá trình quang hợp

Đối với Spirulina, thời gian chiếu sáng càng dài thì năng suất càng cao Nếu chiếu sáng liên tục 24/24 giờ năng suất đạt cao nhất vì Spirulina không có chu kỳ quang [34] Cũng giống như vi khuẩn lam, tảo Spirulina không thể phát triển trong bóng tối [29]

Cường độ ánh sáng của mỗi loài vi tảo khác nhau thì khác nhau Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định cường độ ánh sáng thích hợp cho sinh trưởng của quẩn thể tảo

S platensis (Geitler, 1925) khi nuôi trong nước mặn là rất cần thiết

1.3.2 Nhiệt độ

Mỗi loài vi tảo có một khoảng nhiệt độ thích ứng nhất định Nhìn chung, các loài vi tảo có thể sống trong khoảng nhiệt độ từ 16 – 300C Nếu nhiệt độ cao hơn 350C, tảo có thể chết (kể cả những loài tảo nhiệt đới) và nếu thấp hơn 160C, tảo sẽ phát triển rất chậm Nhiệt độ thích hợp cho hầu hết các loại tảo phát triển tốt là 20 – 250C [31]

Tảo lam phát triển ở nhiệt độ khá cao, chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ

32 – 400C Nhiệt độ phát triển tốt nhất của chúng thường là 350C [34] Ở nhiệt độ thấp hơn 250C tảo lam phát triển chậm còn ở nhiệt độ lớn hơn 400C tảo bị chết sau 6 ngày Nhiệt độ tối thiểu cho chúng tồn tại là 180C (Orio Ciferi, 1985; trích theo [8])

Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến tăng trưởng của tảo mà còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của chúng Theo Sato và Murata (1995) [34], nhiệt độ là yếu

tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới thành phần acid béo Tương tự Golmen (1979) (trích theo [12]) cũng nhấn mạnh nhiệt độ ảnh hưởng lên thành phần hóa học của tế bào không chỉ ở nhiệt độ thấp mà cả ở nhiệt độ cao Theo kết quả nghiên cứu của U.K

Chauhan và Neeraj Pathak (2010) [33], khi nuôi S platensis trong môi trường Zarrouk

thì ở nhiệt độ 280C cho hàm lượng chlorophyll cao hơn khi nuôi ở 320C

1.3.3 Độ mặn

Độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi tảo Khi độ mặn biến đổi đột ngột (do mưa nhiều hay nắng hạn kéo dài) thì dẫn đến sự thay đổi thành phần cũng như số lượng các loài vi tảo trong thủy vực Theo Jeffrey và cộng tác

viên (1994) [27], các loài thích ứng độ mặn rộng (từ 7 – 35‰) như Ch calcitrans,

Pavlova lutheri,… Một số loài vi tảo không thích độ mặn thấp như Sketolema costatum (khoảng chịu đựng từ 14‰ đến 35‰) Độ mặn thay đổi làm thay đổi áp suất

thẩm thấu của tế bào, ảnh hưởng đến quá trình quang hợp, hô hấp, tốc độ tăng trưởng

và sự tích lũy glucose (khi độ mặn giảm đột ngột 4,8‰) [2] Ngoài ra, độ mặn còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa và thành phần acid béo của tảo [32] Sự biến đổi của

độ mặn chỉ ảnh hưởng nhẹ nhàng đến hàm lượng protein tổng số, hydratecarbon, chlorophyll α

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, các tế bào tảo S platensis có thể thích nghi

và phát triển khi nồng độ muối trong môi trường đạt tới 0,8M NaCl (tương đương 47g/l) Ở nồng độ muối cao hơn 1M NaCl, tảo bị vàng đầu và chết dần.Tuy nhiên khả

năng sống sót của S platensis ở nồng độ muối cao còn phụ thuộc vào những yếu tố

ngoại cảnh khác, ở nhiệt độ tương đối thấp 200C và ánh sáng yếu 3000 lux, khả năng

sống sót của S platensis lớn hơn [34]

1.3.4 pH

pH của môi trường quá cao hay quá thấp đều làm chậm tốc độ tăng trưởng của tảo nuôi Mức dao động pH thuận lợi cho sự phát triển của hầu hết các loài tảo vào khoảng 7 – 9; tốt nhất từ 8,2 – 8,7 (Ukeles, 1971; trích theo [24]) Trong khi đó khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển tảo lam nằm trong khoảng pH từ 8,5 – 9 Ở pH này, các nguồn carbon vô cơ được đồng hóa nhiều nhất Tuy nhiên, ở

pH từ 10 – 11 tảo vẫn có khả năng phát triển nhưng rất chậm [8]

Sự biến đổi pH trong môi trường nuôi tảo phụ thuộc vào sự cân bằng sau:

HCO3-  CO2 + OH Trong quá trình quang hợp, tảo hấp thụ CO2 mạnh nên thường làm pH tăng lên rất cao Có thể khắc phục tình trạng này bằng phương pháp sục khí có bổ sung khí CO2 hoặc bổ sung NaHCO3 vào môi trường nuôi [18]

1.3.5 Sục khí/ xáo trộn nước

Năng suất của tảo phụ thuộc nhiều vào xáo trộn nước trong bể nuôi Theo Countteau (1996) [31], xáo trộn nước là việc làm cần thiết để ngăn ngừa tảo không bị lắng nhằm đảm bảo tất cả các tế bào của quần thể tảo được tiếp xúc với ánh sáng và các chất dinh dưỡng như nhau nhằm tránh sự phân tầng nhiệt (ví dụ nuôi ngoài trời) và

để cải thiện sự trao đổi khí giữa môi trường và không khí (nuôi ngoài trời) Trong trường hợp nuôi mật độ cao, CO2 từ không khí (0,03%) không đủ phải bổ sung CO2tinh khiết vào nguồn khí cấp (với tỷ lệ bằng 1% thể tích không khí) Việc bổ sung CO2

có tác dụng làm đệm nước chống lại sự thay đổi về độ pH do sự cân bằng giữa CO2 và HCO3 - Tuy nhiên, không phải bất cứ loài tảo nào cũng có thể chịu đựng được sự xáo trộn nước mạnh

Đối với tảo Spirulina, điều kiện tối ưu nên khuấy sục khí liên tục trong khi nuôi tảo Một số nghiên cứu của Hoàng Nghĩa Sơn và Ngô Kế Sương (1998) [34] cho thấy chế độ khuấy trộn 5 – 10 lần/ngày, mỗi lần cách nhau 3 – 5 giờ, khuấy trộn trong 10 phút, cũng cho kết quả gần tối ưu

1.3.6 Các yếu tố dinh dưỡng

Dinh dưỡng là một yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo Dinh dưỡng ảnh hưởng rất lớn đến số lượng và chất lượng của vi

tảo [18]

 Môi trường nuôi/các chất dinh dưỡng:

Hiện nay trên thế giới có nhiều môi trường dinh dưỡng được sử dụng để nuôi trồng tảo Tuy nhiên, việc lựa chọn môi trường nuôi tối ưu nhằm đạt được sinh khối cao, chất lượng tốt và giá thành rẻ nhất là vấn đề mọi người đều hướng tới

Môi trường bổ sung dinh dưỡng đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới và phù hợp cho hầu hết các loài vi tảo nuôi hiện nay là môi trường Guillard f/2 và môi trường Walne [25, 31]

Ở Việt Nam môi trường bổ sung dinh dưỡng của Hoàng Thị Bích Mai rất phù hợp cho ngành tảo trần, đang được sử dụng phổ biến tại các cơ quan nghiên cứu và các trại nuôi tôm sú [10]

Môi trường TT3 (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III Nha Trang, 2001) là môi trường đang được các cơ sở sản xuất giống thủy sản ứng dụng trong nuôi sinh khối thể tích lớn, do thành phần công thức đơn giản, tiết kiệm được chi phí sản xuất [17]

Tảo S platensis được thuần hóa mặn đã từng được nuôi bằng môi trường f/2

Tuy nhiên, đây cũng chỉ là môi trường chung cho các loài tảo Việc sử dụng môi

trường nào là thích hợp cho tảo S platensis khi nuôi trong nước mặn cũng chưa được

nghiên cứu Vì vậy, việc nghiên cứu để lựa chọn môi trường nuôi phù hợp cho nuôi sinh khối loài tảo này là rất cần thiết

 Carbon:

Carbon là thành phần cơ bản cấu tạo nên cấu trúc tế bào Sinh khối của tảo Spirulina chứa 65 – 70% protein và về thành phần nguyên tố thì carbon chiếm 50% trong khi đó nitơ chỉ có 10 – 11% Nhưng trái với thực vật đất, CO2 trong không khí không đủ để thỏa mãn nhu cầu C của các hệ thống sản xuất tảo tự dưỡng sản lượng cao [10] Chính vì vậy việc cung cấp C vào môi trường nuôi là việc hết sức cần thiết Nguồn C cho tảo sử dụng được cung cấp ở dạng HCO3

, CO3 2-

và CO2 Môi trường có HCO3

-có hiệu quả tốt khi được bổ sung vào môi trường kiềm [34]

 Nitơ:

Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng nhất đóng góp đến việc sản xuất sinh khối tảo, chỉ sau carbon Nitơ là thành phần cần thiết của tất cả các loại protein chức năng và protein cấu trúc trong tế bào tảo, tham gia cấu tạo nên các loại vitamin như B1,

B2, B6, PB rất cần thiết cho quá trình tổng hợp và phát triển của tảo

Hàm lượng nitơ có thể dao động từ 1% đến hơn 10% Nhu cầu nitơ của tảo lục

là cao nhất, sau đó đến tảo lam Tảo khuê không phù hợp với hàm lượng nitơ cao (De Pauw và công sự, 1983; trích theo [18]) Theo Mzapharov và cộng sự (1974; trích theo [5]) thì tảo có khả năng sử dụng đạm dưới cả ba dạng hợp chất: amon, nitrat và nitrit nhưng đạm amon dễ hấp thụ hơn đạm nitrat

Theo ý kiến của Fogg (1959) (trích theo [14]) muốn tảo hấp thụ một cách dễ dàng thì phải chuyển hóa thành đạm amon theo sơ đồ sau:

NO3- NO2- + H2O  NH4OH  NH4+

NO3 là dạng N được Spirulina ưa thích nhất Trong môi trường Zarrouk, NO3được cung cấp dưới dạng NaNO3 2,3g/l với lượng N tương ứng là 412mg/l môi trường Nguyễn Hữu Thước và cộng sự (1990) [34], cho rằng ngưỡng N không được

-thấp hơn 30mg/l và hàm lượng N có thể lên tới 710mg/l mà vẫn không làm ảnh hưởng đến phẩm chất, năng suất tảo Nhưng nếu thiếu N cấu trúc tế bào sẽ bị phá vỡ, sắc tố quang hợp giảm đi xuất hiện hiện tượng tảo úa vàng [12] Ngoài ra, urea cũng là nguồn N thông dụng Nồng độ urea được sử dụng khi đưa vào môi trường nuôi là 1,5 g/l [14]

 Photpho (P):

Photpho là chất không thể thiếu đối với vi tảo vì P có vai trò quan trọng trong

đa số các quá trình xảy ra trong tế bào, đặc biệt là quá trình chuyển hóa năng lượng và tổng hợp acid nucleic Được tế bào sử dụng để tổng hợp ATP, acid nucleic, các hợp chất cấu tạo khác P tham gia vào cấu trúc tế bào, có vai trò quan trọng trong những khâu chuyển hóa trung gian và có ý nghĩa then chốt trong trao đổi năng lượng

Hàm lượng P không cần cao, nhưng nếu thiếu tảo sẽ không phát triển được vì P tác dụng lên hệ keo dưới dạng các ion P ở dạng vô cơ liên kết với các kim loại tạo nên

hệ đệm đảm bảo pH của tế bào ổn định trong phạm vi từ 6 – 8 là điều kiện tốt nhất cho các hệ men hoạt động (Huckison, 1975; trích theo [15])

Theo Zarrouk C (1966) [34], khi bị thiếu P vòng xoắn của Spirulina giảm đi Tuy nhiên chỉ cần 10mgP/l môi trường nuôi, tảo sẽ phát triển bình thường Theo Zareouski J (1978) [34], năng suất tảo đạt tối đa nếu P có từ 90 – 100mg/l sau 14 ngày,

với lượng P bằng 300mg/l thì hàm lượng protein cao nhất Nếu thiếu P tảo S platensis

cũng bị úa vàng [34]

 Các yếu tố dinh dưỡng khác

Bên cạnh các yếu tố đa lượng thì các yếu tố vi lượng được coi là không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của tảo Các nguyên tố vi lượng gồm một số muối kim loại với nồng độ thấp như CuSO4, ZnSO4, CoCl2, FeCl3, MgSO4, MnCl2,

Na2MoO4 các nguyên tố vi lượng này đóng vai trò tác động đến quá trình trao đổi chất của tảo Sắt là thành phần lượng được bổ sung nhiều nhất so với các muối kim loại khác Nó không có chức năng tham gia cấu tạo diệp lục nhưng là tác nhân bổ trợ hoặc là thành phần tham gia cấu trúc của các hệ men và chủ yếu là các men oxy hóa khử, tham gia tích cực vào dây chuyền sinh tổng hợp của các chất quan trọng Co cần thiết cho sản xuất vitamin B12, cũng giống như P, Co dễ kết hợp với các thành phần khác của môi trường sinh trưởng tạo các chất kết tủa làm cho chúng không còn Việc

bổ sung EDTA (acid ethylen diamin tetra acetic) và đặc biệt là muối dinatri dễ tan

trong nước đã làm giảm bớt vấn đề này [12] EDTA tạo phức tan với các ion kim loại như vậy P sẽ không thể tác dụng với các ion kim loại sẽ phát huy vai trò quan trọng trong phosphoril hóa Natri cần cho sinh trưởng của tảo Spirulina, Na không gây độc cho dù nồng độ có lên đến 18g/l Theo Zarrouk (1966) [34], thì tỉ lệ K/Na có vai trò quan trọng, trị số tối thích phải bằng hoặc nhỏ hơn 5, nếu lớn hơn 5 sẽ phá vỡ cấu trúc tảo

Các vitamin bổ sung vào môi trường chủ yếu là thiamin, cyanocobalamin và đôi khi thêm cả biotin Đối với biotin, chỉ một số loài tảo có roi sử dụng có hiệu quả

1.4 Một số ứng dụng của vi tảo Spirulina

1.4.1 Trong nuôi trồng thủy sản

Quá trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm các đối tượng thủy sản đều cần đến vi tảo ở những mức độ khác nhau Vi tảo là nguồn thức ăn thiết yếu cho giai đoạn

ấu trùng của động vật thân mềm hai mảnh vỏ (điệp, sò, vẹm), chân bụng (bào ngư, ốc hương,…), giai đoạn ấu trùng của một số loài cá biển và tôm he cũng như làm thức ăn

nuôi động vật nổi (luân trùng, giáp xác chân chèo, Artemia)

Năm 1999, sản lượng vi tảo cho NTTS thế giới khoảng 1000 tấn, được phân chia không đồng đều giữa các loài tiêu thụ: 62% cho thân mềm, 21% cho tôm và 16% cho cá

[10] Spirulina là loài có giá trị dinh dưỡng cao nên được dùng làm thức ăn tươi sống

trong NTTS Ngoài ra chúng còn được sử dụng dưới dạng bột tảo pha trộn với các thành phần dinh dưỡng khác làm thức ăn khô cho ấu trùng giáp xác, nhuyễn thể [5]

1.4.2 Trong công nghiệp

 Thực phẩm:

Vi tảo là nguồn protein đơn bào giá trị, chúng chứa hàm lượng protein trung bình từ 50 – 60 % khối lượng khô [5] Các loại vi tảo được nuôi đại trà làm thực phẩm cho con người nhiều nhất đó là Spirulina và Chlorella (Yuan và Kun Lee, 1997; trích theo [12]) Tảo Spirulina được nghiên cứu bổ sung vào rất nhiều sản phẩm thực phẩm như: mì sợi, yaourt, kẹo, trà xanh, bánh quy, bánh mì, bia,… các sản phẩm này được bày bán ở siêu thị lớn ở các nước như: Chi Lê, Pháp, Cu Ba, Đức, Thụy Sỹ, Nhật, Tây Ban Nha, Mehico, Đan Mạch, Hà Lan, Mỹ, Úc, New Zealand,…

 Mỹ phẩm:

Tảo Spirulina còn sử dụng để sản xuất các loại mỹ phẩm Do trong tảo Spirulina có chứa các chất chống lão hóa như vitamin E, β-caroten, acid γ-linoleic, các sắc tố carotenoid, chlorophyll và phycocyanin Những khoáng chất chống oxy hóa là

selenium, magan, kẽm, đồng, sắt và crom hình thành các men chống oxy hóa trong cơ thể Các chất này được bổ sung vào các sản phẩm có tác dụng làm đẹp và bảo vệ da như: dầu gội, mỹ phẩm làm lành sẹo mau chóng, chống mụn nhọt và làm trắng da,…

 Y dược:

Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu và báo cáo thành công về công dụng của tảo Spirulina trong y dược Tảo Spirulina phòng bệnh suy dinh dưỡng, đặc biệt là trẻ thiếu sữa mẹ, là nguồn bổ sung dinh dưỡng rất tốt cho trẻ lười ăn, điều trị táo bón Ở Ấn Độ, tảo được ứng dụng trong trị bệnh suy dinh dưỡng trẻ em với khẩu phần 3g/1 cháu/ ngày [34] Trong tảo Spirulina chứa Protaslangin E giúp quá trình điều hòa huyết áp, điều hòa quá trình tổng hợp cholesterol, quá trình viêm nhiễm và phân chia tế bào [34] Phycotene chiết từ Spirulina có tác dụng rất tốt với hệ thống miễn dịch cơ thể người trong chống bệnh ung thư [34] Nhóm acyllipid trong tảo Spirulina có tác dụng kìm hãm mạnh mẽ sự phát triển của HIV-1 [34]

 Xử lý môi trường:

Khả năng quang hợp của vi tảo để tổng hợp vật chất từ các chất vô cơ và hữu cơ

đã được nghiên cứu và sử dụng vi tảo trong việc xử lý nước thải và khí CO2 của các nhà máy xí nghiệp Từ năm 1975, Osawald và cộng sự tại trường Đại Học Tổng Hợp Califonia đã thử nghiệm dùng tảo Spirulina trong xử lý nước thải công nghiệp và đi đến kết luận rằng: trong hệ xử lý nước thải tảo Spirulina có vai trò tạo O2, tăng độ kết lắng, loại trừ kim loại và các chất hữu cơ độc hại

Ở nước ta, Nguyễn Hữu Thước và Phan Phương Lan (1988) [34] đã nuôi cấy S

platensis trên môi trường nước thải ươm tơ, đã cho kết quả khả quan: tảo S platensis

sinh trưởng tốt trên môi trường nước thải ươm tơ bổ sung từ 4 – 20g/lít NaHCO3 và đạt hàm lượng protein cao từ 57 – 58% Dương Đức Tiến (1989) [34], nuôi trồng tảo Spirulina có hàm lượng protein cao từ nước thải của nhà máy ure, xí nghiệp liên hiệp phân đạm hóa chất Hà Bắc

1.5 Lịch sử nghiên cứu và phát triển nuôi sinh khối tảo Spirulina

1.5.1 Trên thế giới

Spirulina được nhà khoa học người Pháp phát hiện lần đầu tiên vào năm 1827 Mãi đến năm 1960 khi Leoard và Comperé nguười Bỉ phân tích công bố giá trị dinh dưỡng của bánh Dihe, thức ăn của người Kanembu làm từ Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao, thì giới khoa học mới quan tâm nhiều hơn [35]

Năm 1963, giáo sư Clement thuộc Viện nghiên cứu dầu hỏa quốc gia Pháp là người đầu tiên nghiên cứu thành công việc nuôi tảo Spirulina qui mô công nghiệp [34]

Tại Nhật Bản, được sự hỗ trợ kỹ thuật từ Hoa Kỳ tiến sỹ Nakamura tiến hành những nghiên cứu sớm nhất vào năm 1968, với giống tảo mẹ từ Tchad Phương pháp nuôi trồng công nghiệp Spirulina của ông được triển khai ở vài vùng Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc [36]

Tại Ấn Độ, nghiên cứu nuôi các giống tảo cũng được triển khai từ những năm

1960, đặt biệt mô hình nuôi Spirulina ở quy mô cộng đồng nhỏ (làng, xã), do Ripley

D Fox khởi xướng phát triển khá tốt ở một số vùng như Karla Schechardy [6]

Tại Pháp, Dengeard (1970) [6] đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất tảo thành

công tảo S platensis trên diện tích 12ha với sản lượng trên 1 tấn tảo khô mỗi ngày

Trong những năm 1968 – 1983, các nhà khoa học Pháp cũng đã nghiên cứu và xây dựng được một phòng thí nghiệm nghiên cứu Spirulina tại đây Đồng thời sáng tạo được mô hình nuôi tảo Spirulina, cung cấp tại chỗ cho việc phòng chống dinh dưỡng trẻ em Mô hình này được nhiều nước nghèo, nước đang phát triển nghiên cứu áp dụng như Peru, Togô và Việt Nam

1.5.2 Ở Việt Nam

Từ năm 1972 các nhà khoa học bắt đầu đặt vấn đề nghiên cứu tảo do GS.TS Nguyễn Hữu Thước chủ trì [6] Năm 1976, việc thử nghiệm nuôi trồng tảo đã được tiến hành trong thời gian 4 – 5 tháng tại Nghĩa Đô, Hà Nội đã thu được kết quả khá khả quan

Vào năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí Minh đã tiếp nhận giống tảo đầu tiên

do ông bà R.D.Fox tặng Sau đó, tảo giống được giao cho trạm nghiên cứu dược liệu giữ giống và nuôi trồng (trích theo [14])

Do tảo Spirulina platensis là loài tảo có giá trị dinh dưỡng cao nên được các

nhà khoa học đặc biệt quan tâm và đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học và triển khai ứng dụng nuôi trồng cũng như sản xuất các sản phẩm từ tảo Điển hình là đề

tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng tảo Spirulina platensis” (1981 – 1985), “Hoàn thiện công nghệ sản xuất tảo Spirulina platensis làm thuốc chế phẩm trị bệnh cho

người và thức ăn gia súc” (1995 – 1997), “Ảnh hưởng của NaCl ở các nồng độ khác

nhau lên hoạt tính quang hợp và hô hấp của tảo lam Spirulina platensis” do Dương

Trọng Hiền & ctv (trích theo [14]) thực hiện đã đưa ra kết luện rằng: Cường độ quang hợp và hô hấp của tảo sau khi giảm ở giai đoạn sốc muối đều phục hồi trở lại sau khoảng 72 giờ, nhưng cường độ hô hấp phục hồi nhanh hơn và thậm chí đạt giá trị còn cao hơn so với lúc chưa sốc muối Với đề tài “Đặc trưng sinh trưởng và năng suất của

tảo lam Spirulina platensis trong nuôi trồng tăng tốc” do Trần Văn Tựa (trích theo [11]) thực hiện đã đưa ra ý kiến rằng: Năng suất của tảo lam Spirulina platensis còn rất

lớn nhưng trong sản xuất người ta chỉ mới khai thác được một phần Và gần đây hơn, Dương Thị Hoàng Anh và Nguyễn Thị Kim Liên [1] đã nghiên cứu tỷ lệ thu hoạch

hằng ngày đến việc nuôi sinh khối tảo Spirulina platensis Kết quả cho thấy, nuôi sinh khối tảo Spirulina platensis trong thể tích 500 lít thu hoạch với tỉ lệ 20/ngày cho kết

quả tốt nhất

Có thể nói, Vĩnh Hảo là đơn vị tiên phong trong việc nuôi trồng và sản xuất tảo lớn nhất nước ta Sản lượng hiện nay từ 8 – 12 tấn/năm Dự kiến tăng sản lượng lên 15 tấn/năm Ngoài ra, năm 2003, mô hình nuôi loài tảo này trong nhà kính ở Long An theo quy trình nuôi tảo sạch của Th.S Lê Văn Lăng đã được sản xuất ổn định và có hiệu quả kinh tế Và mô hình nuôi trồng này đã được nhiều cơ sở đưa vào ứng dụng với quy mô sản xuất 23 tấn/năm như Châu Cát, Lòng Sông (Thuận Hải), Suối Nghệ (Đồng Nai), Đắc Min (Đắc Lắc) (trích theo [12])