Lịch sử nghiên cứu và phát triển nuôi sinh khối tảo Spirulina

1.5.1. Trên thế giới

Spirulina được nhà khoa học người Pháp phát hiện lần đầu tiên vào năm 1827. Mãi đến năm 1960 khi Leoard và Comperé nguười Bỉ phân tích công bố giá trị dinh dưỡng của bánh Dihe, thức ăn của người Kanembu làm từ Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao, thì giới khoa học mới quan tâm nhiều hơn [35].

Năm 1963, giáo sư Clement thuộc Viện nghiên cứu dầu hỏa quốc gia Pháp là người đầu tiên nghiên cứu thành công việc nuôi tảo Spirulina qui mô công nghiệp [34].

Tại Nhật Bản, được sự hỗ trợ kỹ thuật từ Hoa Kỳ tiến sỹ Nakamura tiến hành những nghiên cứu sớm nhất vào năm 1968, với giống tảo mẹ từ Tchad. Phương pháp nuôi trồng công nghiệp Spirulina của ông được triển khai ở vài vùng Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc [36].

Tại Ấn Độ, nghiên cứu nuôi các giống tảo cũng được triển khai từ những năm 1960, đặt biệt mô hình nuôi Spirulina ở quy mô cộng đồng nhỏ (làng, xã), do Ripley D. Fox khởi xướng phát triển khá tốt ở một số vùng như Karla Schechardy [6].

Tại Pháp, Dengeard (1970) [6] đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất tảo thành công tảo S. platensis trên diện tích 12ha với sản lượng trên 1 tấn tảo khô mỗi ngày. Trong những năm 1968 – 1983, các nhà khoa học Pháp cũng đã nghiên cứu và xây dựng được một phòng thí nghiệm nghiên cứu Spirulina tại đây. Đồng thời sáng tạo được mô hình nuôi tảo Spirulina, cung cấp tại chỗ cho việc phòng chống dinh dưỡng trẻ em. Mô hình này được nhiều nước nghèo, nước đang phát triển nghiên cứu áp dụng như Peru, Togô và Việt Nam.

1.5.2. Ở Việt Nam

Từ năm 1972 các nhà khoa học bắt đầu đặt vấn đề nghiên cứu tảo do GS.TS Nguyễn Hữu Thước chủ trì [6]. Năm 1976, việc thử nghiệm nuôi trồng tảo đã được tiến hành trong thời gian 4 – 5 tháng tại Nghĩa Đô, Hà Nội đã thu được kết quả khá khả quan.

Vào năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí Minh đã tiếp nhận giống tảo đầu tiên do ông bà R.D.Fox tặng. Sau đó, tảo giống được giao cho trạm nghiên cứu dược liệu giữ giống và nuôi trồng (trích theo [14]).

Do tảo Spirulina platensis là loài tảo có giá trị dinh dưỡng cao nên được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm và đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học và triển khai ứng dụng nuôi trồng cũng như sản xuất các sản phẩm từ tảo. Điển hình là đề tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng tảo Spirulina platensis” (1981 – 1985), “Hoàn thiện công nghệ sản xuất tảo Spirulina platensis làm thuốc chế phẩm trị bệnh cho người và thức ăn gia súc” (1995 – 1997), “Ảnh hưởng của NaCl ở các nồng độ khác nhau lên hoạt tính quang hợp và hô hấp của tảo lam Spirulina platensis” do Dương

Trọng Hiền & ctv (trích theo [14]) thực hiện đã đưa ra kết luện rằng: Cường độ quang hợp và hô hấp của tảo sau khi giảm ở giai đoạn sốc muối đều phục hồi trở lại sau khoảng 72 giờ, nhưng cường độ hô hấp phục hồi nhanh hơn và thậm chí đạt giá trị còn cao hơn so với lúc chưa sốc muối. Với đề tài “Đặc trưng sinh trưởng và năng suất của tảo lam Spirulina platensis trong nuôi trồng tăng tốc” do Trần Văn Tựa (trích theo [11]) thực hiện đã đưa ra ý kiến rằng: Năng suất của tảo lam Spirulina platensis còn rất lớn nhưng trong sản xuất người ta chỉ mới khai thác được một phần. Và gần đây hơn, Dương Thị Hoàng Anh và Nguyễn Thị Kim Liên [1] đã nghiên cứu tỷ lệ thu hoạch hằng ngày đến việc nuôi sinh khối tảo Spirulina platensis. Kết quả cho thấy, nuôi sinh khối tảo Spirulina platensis trong thể tích 500 lít thu hoạch với tỉ lệ 20/ngày cho kết quả tốt nhất.

Có thể nói, Vĩnh Hảo là đơn vị tiên phong trong việc nuôi trồng và sản xuất tảo lớn nhất nước ta. Sản lượng hiện nay từ 8 – 12 tấn/năm. Dự kiến tăng sản lượng lên 15 tấn/năm. Ngoài ra, năm 2003, mô hình nuôi loài tảo này trong nhà kính ở Long An theo quy trình nuôi tảo sạch của Th.S Lê Văn Lăng đã được sản xuất ổn định và có hiệu quả kinh tế. Và mô hình nuôi trồng này đã được nhiều cơ sở đưa vào ứng dụng với quy mô sản xuất 23 tấn/năm như Châu Cát, Lòng Sông (Thuận Hải), Suối Nghệ (Đồng Nai), Đắc Min (Đắc Lắc) (trích theo [12]).

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là loài tảo Spirulina platensis (Geitler, 1925) đã được thuần hóa trong nước mặn, do Th.S Trần Thị Lê Trang – Giảng viên Bộ môn Sinh học nghề cá, Khoa Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nha Trang cung cấp. Hiện loài tảo này đang được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm thực hành Sinh lý – Sinh thái, Đại học Nha Trang.

2.1.2. Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 25/2/2013 đến ngày 8/6/2013.

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí tại Phòng thí nghiệm thực hành Sinh lý – Sinh thái, Đại học Nha Trang.

2.2. Chuẩn bị các điều kiện thí nghiệm 2.2.1. Nguồn nước 2.2.1. Nguồn nước

Nước được lấy từ Trung tâm giống và dịch bệnh thủy sản, Trường Đại học Nha Trang đã được xử lý. Nguồn nước biển được xử lý bằng Chlorine 25 ppm trong 2 ngày, sau đó phơi nắng và trung hòa bằng Natrithiosulfate với tỉ lệ 1:1. Trước khi bắt đầu thí nghiệm, nước đã qua xử lý được đem hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121⁰C ở áp suất 1atm trong thời gian 15 phút.

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị được sử dụng trong phòng thí nghiệm: tủ lạnh, bếp từ, cân điện tử, máy hấp tiệt trùng (Phụ lục: Hình 13), kính hiển vi quang học.

Các dụng cụ: bình thủy tinh (1 lít), cốc thủy tinh, bông gòn không thấm nước, dây sục khí, môi trường dinh dưỡng được hấp tiệt trùng ở 121⁰C ở áp suất 1 atm trong thời gian 15 phút.

2.3. Các loại môi trường dinh dưỡng sử dụng trong thí nghiệm 2.3.1. Môi trường f/2 (Guillard, 1975) 2.3.1. Môi trường f/2 (Guillard, 1975)

Bảng 2.1. Môi trường f/2 [26]

Các chất dinh dưỡng Nồng độ cuối cùng (mg/l)

Dung dịch 1: KNO3 89,6 KH₂PO₄ 5,6 Dung dịch 2: Na2EDTA 4,36 FeCl3.6H2O 3,15 CuSO4.5H2O 0,01 ZnSO₄.6H₂O 0,022 CoCl₂.6H₂O 0,01 MnCl₂.6H₂O 0,18 NaMoO4.6H2O 0,006 Thiamin (B1) 0,1 Biotin (B6) 0,0005 Riboflavin (B12) 0,0005 2.3.2. Môi trường TT3 Bảng 2.2. Môi trường TT3

Các chất dinh dưỡng Nồng độ cuối cùng (mg/l)

KNO₃ 70

KH2PO4 6

EDTA 5

C6H8O7.H2O 7

2.3.3. Môi trường HBM – 95

Bảng 2.3. Môi trường HBM – 95 [9]

Các chất dinh dưỡng Nồng độ cuối cùng (mg/l)

Dung dịch 1: KNO3 30

KH2PO4 10

Na2EDTA 10

Dung dịch 2: FeCl3.6H2O 5

Cách cân và pha hóa chất: để có được thành phần, hàm lượng các yếu tố đa lượng, vi lượng trong các môi trường trên, chúng tôi đã cân và pha hóa chất như sau: cân hóa chất bằng cân điện tử, cân hàm lượng mỗi chất tăng gấp 1000 lần. Mỗi loại dung dịch pha trong 1 lít nước cất và dùng máy khuấy từ để khuấy tan hóa chất. Sau đó cho vào bình thủy tinh đem hấp tiệt trùng ở 121⁰C, 1 atm trong 15 phút.

2.4. Bố trí thí nghiệm

2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiệm.

Tảo giống S. platensis

Nhân sinh khối tảo trong bình 1 lít

Thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng: 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 (lux)

Cường độ ánh sáng thích hợp Thí nghiệm về môi trường dinh dưỡng:

f/2, TT3, HBM – 95

Môi trường dinh dưỡng thích hợp Kết luận và đề xuất ý kiến

2.4.2. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S. platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí trưởng của quần thể tảo S. platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với 5 lô tương ứng với các mức cường độ ánh sáng khác nhau: 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 lux. Số lần lặp lại: 3 lần. Tổng số bình thí nghiệm: 15 bình.

Điều kiện thí nghiệm:

 Mật độ ban đầu: 1,15g/l tương ứng OD = 0,33.

 Môi trường dinh dưỡng: f/2.

 Chế độ chiếu sáng (sáng/tối): 16/8.

 Độ mặn: 30‰.

 Sục khí liên tục: 24/24.

Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm 1.

2.4.3. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của quần thể tảo S. platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí trưởng của quần thể tảo S. platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với 3 lô tương ứng với các môi trường dinh dưỡng khác nhau: f/2, TT3, HBM – 95. Số lần lặp lại: 3 lần. Tổng số bình thí nghiệm: 9 bình.

Điều kiện thí nghiệm:

 Mật độ ban đầu: 1,15g/l tương ứng OD = 0,33.

 Chế độ chiếu sáng (sáng/tối): 16/8.

 Độ mặn: 30‰.

 Sục khí liên tục: 24/24.

Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm 2. 2.5. Phương pháp xác định các chỉ tiêu

2.5.1. Phương pháp xác định sinh trưởng của tảo

 Phương pháp thiết lập đường chuẩn mối quan hệ giữa mật độ quang (Optical density: OD) và khối lượng khô của tảo:

OD của tảo được xác định bằng cách lấy 5ml dung dịch tảo đưa vào máy đo quang phổ kế (Spectrophotometer CECIL/CE 1011, 101S, 120554) (Phụ lục: Hình 12) của Nhật ở bước sóng 560nm. Đồng thời tiến hành xác định khối lượng khô của tảo.

Khối lượng khô của tảo được xác định bằng cách lọc mẫu dịch tảo bằng giấy lọc định tính (Phụ lục: Hình 10). Sau đó, tiến hành sấy khô ở nhiệt độ 80⁰C trong 4 giờ. Khối lượng khô của tảo được cân bằng cân điện tử Precisa XT 220A với độ chính xác 0,001g.

Mối quan hệ hồi quy tuyến tính giữa OD và khối lượng khô của tảo được xác định theo phương pháp của Lavens và Sorgeloos (1996) [28] với phương trình y = 3,453x + 0,01 (trong đó x là OD, y là khối lượng khô) và R² = 0,992.

Hình 2.4. Phương trình tương quan giữa OD và khối lượng khô của tảo S. platensis.

 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng: sinh trưởng của tảo được xác định thông qua OD. Lấy mẫu tảo để đo OD 2 ngày/lần. Khối lượng khô của tảo sau đó được tính toán dựa vào công thức y = 3,453x + 0,01.

2.5.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu môi trường

Các yếu tố môi trường được xác định hằng ngày.

 Nhiệt độ: được điều khiển bằng máy điều hòa.

 Độ mặn: được đo bằng khúc xạ kế (refractometer) của Nhật.

 Cường độ ánh sáng: sử dụng máy đo cường độ ánh sáng cầm tay.

 pH: pH của dung dịch tảo được đo bằng text pH.

2.6. Phương pháp xử lí số liệu

Số liệu được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) trên phần mềm SPSS 13.0. Khi có sự khác biệt giữa các giá trị trung bình, phép kiểm định Duncan’ Text được sử dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p<0,05.

y = 3.453x + 0.010 R² = 0.992 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Sin h k h ố i (g/l) Optical Density

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S.

platensis nuôi trong nước mặn ở điều kiện phòng thí nghiệm

Các yếu tố môi trường được duy trì trong phạm vi thích hợp với sinh trưởng của tảo S. platensis: nhiệt độ 26 – 28⁰C, pH 7 – 7,5, chế độ chiếu sáng: 16 giờ sáng, 8 giờ tối, sục khí liên tục 24/24, độ mặn 30 – 32‰.

Bảng 3.1. Khoảng biến động các yếu tố môi trường trong thí nghiệm 1.

Yếu tố môi trường Nhiệt độ (⁰C) pH Độ mặn (‰) Khoảng biến động 26 – 28 7,0 – 7,5 30 – 32

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S. platensis khi nuôi ở độ mặn 30‰ được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.2.

Hình 3.1. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S. platensis. 0 1 2 3 4 5 6 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 Sin h k h ố i (g/l)

Thời gian (ngày)

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sinh trưởng của quần thể tảo S. platensis

Số liệu trình bày trên bảng 3.2 là giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SE). Chữ cái viết kèm bên trên minh họa cho sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).

Hình 3.1 và bảng 3.2 cho thấy, các mức cường độ ánh sáng khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng của quần thể tảo S. platensis. Cường độ ánh sáng càng cao thì thời gian tảo đạt sinh khối cực đại càng nhanh. Cụ thể tảo S. platensis được nuôi ở CĐAS 3000 lux đạt sinh khối cực đại lớn nhất (5,66 ± 0,03g/l) vào ngày nuôi thứ 13 và khác biệt có ý nghĩa so với các lô còn lại (p<0,05). Ở 2 lô có CĐAS cao hơn 4000 và 5000 lux tảo đạt sinh khối cực đại nhanh hơn (ngày thứ 11) nhưng sinh khối cực đại lại đạt được thấp nhất (3,65 ± 0,08 và 2,92 ± 0,08g/l) (p<0,05). Trong khi đó ở CĐAS thấp 1000 và 2000 lux thì tảo đạt sinh khối cực đại chậm (ngày nuôi thứ 19) với sinh khối cực đại đạt được là 4,25 ± 0,04 và 4,69 ± 0,08g/l. Không có sự khác biệt thống kê về sinh khối cực đại giữa 2 lô CĐAS 1000 và 4000 lux (p>0,05).

Ngoài ra, các mức CĐAS khác nhau cũng ảnh hưởng đến thời gian duy trì sinh khối quần thể tảo S. platensis. Trong đó, các lô tảo được nuôi ở mức CĐAS thấp cho

Ngày nuôi

Cường độ ánh sáng

1000 lux 2000 lux 3000 lux 4000 lux 5000 lux 1 1,15 ± 0,00 1,15 ± 0,00 1,15 ± 0,00 1,15 ± 0,00 1,15 ± 0,00 3 1,57 ± 0,03^c 1,75 ± 0,01^d 2,07 ± 0,03^e 0,87 ± 0,05^b 0,59 ± 0,03^a 5 1,86 ± 0,03^b 2,29 ± 0,04^d 2,96 ± 0,05^e 2,09 ± 0,04^c 1,55 ± 0,07^a 7 2,27 ± 0,05^a 2,87 ± 0,04^b 3,65 ± 0,06^c 2,83 ± 0,05^b 2,33 ± 0,05^a 9 2,58 ±0,04^a 3,18 ± 0,04^b 4,33 ± 0,05^c 3,22 ± 0,07^b 2,73 ± 0,05^a 11 2,84 ± 0,06^a 3,60 ± 0,07^b 4,66 ± 0,06^c 3,65 ± 0,08^b 2,92 ± 0,08^a 13 3,23 ± 0,06^b 3,96 ± 0,1^c 5,66 ± 0,03^d 3,43 ± 0,02^b 1,36 ± 0,02^a 15 3,51 ± 0,05^c 4,12 ± 0,02^d 5,10 ± 0,04^e 0,64 ± 0,03^b 0,37 ± 0,02^a 17 3,89 ± 0,05^b 4,44 ± 0,03^c 3,76 ± 0,03^a 19 4,25 ± 0,04^b 4,69 ± 0,08^c 2,77± 0,04^a 21 3,4 ± 0,07^a 3,65 ± 0,03^b 0,85 ± 0,04^a 23 2,28 ± 0,04^a 2,59 ± 0,03^b 25 0,95 ± 0,05^a 1,19 ± 0,04^b

thời gian duy trì sinh khối quần thể lâu hơn (1000 và 2000 lux: 25 ngày, 3000 lux: 21 ngày) so với lô tảo có mức CĐAS cao (4000 và 5000 lux: 15 ngày).

Theo Brown (1991) và Guillard (1975) (trích theo [18]), khi cường độ ánh sáng tăng tảo quang hợp mạnh thúc đẩy sự phân chia tế bào, vì vậy sinh khối tảo tăng lên nhanh chóng. Cụ thể trong thí nghiệm này, khi CĐAS tăng trong khoảng từ 1000 đến 3000 lux thì sinh khối cực đại của tảo tăng dần (từ 4,25 lên 5,66g/l). Ở ngưỡng chiếu sáng thích hợp 3000 lux tảo sinh trưởng tốt nhất. Nhưng khi CĐAS tăng vượt quá ngưỡng thích hợp thì quá trình sinh lý hóa sinh trong tế bào bị ức chế và có thể làm chết tế bào tảo [18]. Có lẽ chính điều này đã làm cho tảo ở CĐAS 4000 và 5000 lux đạt sinh khối cực đại thấp, tảo có màu xanh nhạt (Phụ lục: Hình 2) và còn gây ra hiện tượng tảo chết đóng như rêu bám vào thành bình từ ngày nuôi thứ 2 (Phụ lục: Hình 1). Ngược lại, ở CĐAS thấp (1000 và 2000 lux) quá trình quang hợp diễn ra nhưng với cường độ quang hợp thấp, do đó sinh khối tảo gia tăng chậm và thời gian đạt sinh khối cực đại đến muộn (ngày thứ 19).

Nhu cầu về CĐAS cũng thay đổi theo độ sâu của môi trường nuôi (dung tích) và mật độ tảo. Ở độ sâu lớn (dung tích lớn) và mật độ tế bào cao thì CĐAS phải tăng để có thể xuyên qua được môi trường nuôi [31]. Theo kết quả nghiên cứu của Tôn Nữ Mỹ Nga (2006) [10], khoảng cường độ ánh sáng từ 2160 lux đến 3390 lux là khoảng thích hợp cho tảo Chaetoceros gracilis trong bình 1 lít phát triển sinh khối, trong đó tối ưu là 3390 lux. Như vậy, CĐAS tối ưu (3000 lux) cho sinh trưởng của tảo S. platensis trong thí nghiệm này phù hợp với xu hướng trên.