Định danh các chủng vi khuẩn thuộc chi Proteus phân lập từ động vật biển bằng phương pháp hóa sinh và sinh học phân tử

Việc định danh Proteus bằng cách sử dụng các phương pháp riêng lẻ như phương pháp giải trình tự 16S rDNA hoặc sử dụng Kit API 50CHE trong một số trường hợp không thể định danh đến loài,

PHẠM THỊ SƯƠNG

ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN THUỘC CHI

PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: TS NGUYỄN VĂN DUY

NHA TRANG – THÁNG 07 NĂM 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự chỉ bảo, giúp

đỡ của nhiều thầy cô, các anh chị và bạn bè

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Phạm Thu Thủy

và TS Nguyễn Văn Duy đã tận tình hướng dẫn tận tình, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học Nha Trang nhất là các thầy cô trong Viện công nghệ sinh học và môi trường đã chỉ dạy và truyền đạt kiến thức trong suốt 4 năm học, giúp tôi có một nền tảng kiến thức để bước vào đời

Cảm ơn chị Minh Nhật, anh Nguyên, chị Xuân, chị Nhi, các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Sương

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU viii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về chi vi khuẩn Proteus 1

1.1.1 Đặc điểm phân loại học của Proteus 1

1.1.2 Đặc điểm sinh học của Proteus 1

1.1.3 Đặc tính sinh lý và sinh hóa của Proteus 3

1.1.4 Tình hình nghiên cứu về chi Proteus trên thế giới và ở Việt Nam .6

1.2 Các phương pháp định danh vi khuẩn 7

1.2.1 Tổng quan chung về các phương pháp định danh vi khuẩn 7

1.2.1.1 Định danh bằng phương pháp truyền thống 7

1.2.1.2 Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống 9

1.2.2 Các phương pháp định danh vi khuẩn Proteus 12

1.2.2.1 Định danh bằng test hóa sinh 12

1.2.2.2 Định danh bằng sinh học phân tử 13

CHƯƠNG 2 Vật liệu và phương pháp 16

2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Chủng vi khuẩn 16

2.1.2 Hóa chất, môi trường, thuốc thử 16

2.1.2.1 Hóa chất 16

2.1.2.2 Môi trường 17

2.1.2.3 Thuốc thử 18

2.2 Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn 19

2.3.2 Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn 20

2.3.3 Định danh vi khuẩn bằng thử nghiệm sinh hóa 23

2.3.3.1 Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 20E 23

2.3.3.2 Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 50CH 24

2.3.4 Kĩ thuật tách chiết DNA tổng số 26

2.3.5 Kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB 27

2.3.6 Kĩ thuật điện di gel Agarose 29

2.3.7 Giải trình tự và phân tích trình tự gen 30

2.3.8 Phân tích quan hệ phát sinh loài 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu 32

3.2 Định danh các chủng vi khuẩn Proteus bằng thử nghiệm sinh hóa 35

3.3 Kết quả tách chiết DNA tổng số 40

3.4 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA 40

3.5 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rpoB 42

3.6 Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và đoạn gen rpoB 42

3.7 Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA và đoạn gen rpoB 49

3.8 Xây dựng cây phát sinh loài 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1. DNA Deoxyribonucleic Acid

2. dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate

3. EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

4. LDC Lysine Decarboxylase

5. rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

6. rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid

7. RNA Ribonucleic Acid

8. PCR Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction)

9. TBE Tris Boric acid EDTA

10 Tm Melting temperature

11 TSA Tryptone Soya Agar

12 TSB Tryptone Soya Broth

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Proteus vulgaris dưới kính hiển vi điện tử 2

Hình 1.2: Sự lan tỏa (swarming) của Proteus mirabilis trên môi trường thạch 3

Hình 1.4: Tế bào lan của Proteus mirabilis kết thành bè và di chuyển trên một bề mặt .5

Hình 1.5: Minh họa 4 giai đoạn trong một chu kỳ lan toả của tế bào Proteus mirabilis 6

Hình 2.1: Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát của đề tài 21

Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc của 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 33

Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm Gram tế bào của 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 34

Hình 3.3: Kết quả điện di DNA tổng số của các chủng cần định danh 41

Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA 41

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rpoB 42

Hình 3.6: Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng thí nghiệm và các chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Proteus 56

Hình 3.7: Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng thí nghiệm và 4 chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Proteus .57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số phản ứng sinh hóa của Proteus 4

Bảng 2.1 Danh sách các chủng vi khuẩn Proteus sử dụng cho nghiên cứu 16

Bảng 2.2: Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 20E 23

Bảng 2.3: Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 50CH 24

Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn bằng bộ Kit API 50 CH và API 20E 36

Bảng 3.2: Đặc điểm sinh hóa khác biệt của 5 chủng nghiên cứu với các loài của chi Proteus 39

Bảng 3.3: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.7A (1024 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 50

Bảng 3.4: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng B3.7A (893 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 50

Bảng 3.5: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.10B (1062 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST

51

Bảng 3.6: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng B3.10B (837 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST .51

Bảng 3.7: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng CT1.1 (1409 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 52

Bảng 3.8: So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng CT1.1 (876 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 52

Bảng 3.9: So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng G1 (1388 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 53

Bảng 3.10: So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng G1 (834 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 53

Bảng 3.11: So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng N1.4 (835 nucleotide) với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 54Bảng 3.12: So sánh trình tự đoạn gen rpoB của chủng N1.4 (881nucleotide) với các

trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 54Bảng 3.13: So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng nghiên cứu với các

chủng chuẩn của các loài trong chi Proteus 55

Bảng 3.14: So sánh trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài trong chi Proteus 56

Bảng 3.15: Đánh giá chung về định danh 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu 58

LỜI NÓI ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài:

Vi khuẩn Proteus thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae hiện nay

có 4 loài chính bên cạnh đó vẫn còn 3 Proteus genomospecies (4, 5 và 6) vẫn chưa

được đặt tên loài [17] Tế bào vi khuẩn Proteus là tế bào Gram âm, có dạng hình que ngắn đến dạng hình sợi dài, kỵ khí tùy ý, di động mạnh, có lông roi xung

quanh Vi khuẩn Proteus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy trong xác

phân hủy của động vật, trong nước thải, trong phân người và động vật… Chúng được tìm thấy như là hệ vi sinh vật bình thường của đường ruột Vi khuẩn Proteus được xác định là tác nhân gây bệnh cơ hội, gây ra các bệnh lý nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng huyết, viêm màng não ở trẻ sơ sinh, viêm tủy xương [17], [20], [26] Trên thế giới, các nghiên cứu về vi khuẩn

Proteus chủ yếu tập trung vào các chủng có nguồn gốc từ các bệnh nhân nhiễm trùng đường tiết niệu ở người, ở Việt Nam các nghiên cứu về chi Proteus còn hạn

chế, đặc biệt các chủng phân lập từ động vật biển và khả năng sinh bacteriocin của

các chủng vi khuẩn Proteus này

Việc định danh Proteus bằng cách sử dụng các phương pháp riêng lẻ như

phương pháp giải trình tự 16S rDNA hoặc sử dụng Kit API 50CHE trong một số trường hợp không thể định danh đến loài, mặt khác tất cả các hệ thống được sử dụng để xác định vi khuẩn, cho dù kiểu hình hoặc kiểu gen đều có những hạn chế, bởi vì không có phương pháp thử nghiệm duy nhất nào cho kết quả chính xác 100%, nhưng yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định

danh chính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002) Do vậy đề tài “Định danh các chủng vi khuẩn thuộc chi Proteus phân lập từ động vật biển bằng phương háp hóa sinh và sinh học phân tử” là rất cần thiết, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn nhằm ứng dụng các chủng này trong thực tiễn sản xuất

Mục tiêu của đề tài:

- Định danh 5 chủng vi khuẩn thuộc chi Proteus phân lập từ động vật biển

- Xây dựng cây phát sinh loài và nghiên cứu mối quan hệ của các loài Proteus

phân lập từ động vật biển

Nội dung:

- Nuôi cấy, kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 5 chủng nghiên cứu

- Xác định khả năng trao đổi chất bằng Kit API 50CH và Kit API 20E

- Tách chiết DNA của 5 chủng nghiên cứu

- Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB bằng kĩ thuật PCR

- Giải trình tự, phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh loài

Phạm vi nghiên cứu:

- 5 chủng cần nghiên cứu (B3.7A, B3.10B, CT1.1, G1, N1.4) thuộc chi

Proteus

Ý nghĩa đề tài:

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp định danh và phát hiện thêm các loài

(thuộc chi Proteus) mới có ý nghĩa trong tiến hóa và đa dạng sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi vi khuẩn Proteus

1.1.1. Đặc điểm phân loại học của Proteus

Về phân loại học Proteus được xếp vào:

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Grammaproteobacteria

Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae

Chi: Proteus Loài: Proteus mirabilis

Proteus vulgaris Proteus hauseri Proteus penneri Chi Proteus ban đầu chỉ có 4 loài: Proteus vulgaris, Proteus rettgeri, Proteus morgani và Proteus mirailis Sau này Proteus morgani và Proteus rettgeri đã được

định danh lại, chúng lần lượt thuộc chi Morgagena và Providencia [20] Dựa trên kĩ

thuật lai DNA-DNA, các chủng thuộc loài Proteus vulgaris đã được sắp xếp vào 3

nhóm sinh học (biogroup) khác nhau Năm 1982, nhóm sinh học 1 đã được định

danh lại là Proteus penneri [9] Năm 2000 các chủng thuộc nhóm sinh học 3 lại

được phân vào 4 genomospecies (3, 4, 5 và 6) [20] Trong đó Proteus

genomospecies 3 được định danh lại là Proteus hauseri còn lại Proteus

genomospecies 4, 5, 6 vẫn chưa được đặt tên loài do thiếu những bằng chứng về đặc điểm kiểu hình khác biệt Việc hệ thống các loài của chi Proteus là phức tạp và có thể còn nhiều thay đổi

1.1.2. Đặc điểm sinh học của Proteus

Proteus thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, bao gồm các trực khuẩn Gram âm, di động mạnh, có lông roi xung quanh Tế bào vi khuẩn Proteus có

nhiều hình dạng thay đổi trên các môi trường nuôi khác nhau, từ dạng trực khuẩn đến dạng hình sợi dài

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Proteus vulgaris dưới kính hiển vi điện tử

Proteus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy trong xác phân hủy của động vật, trong nước thải, trong phân người và động vật Proteus mirabilis và Proteus vulgaris đã được phân lập từ đường ruột của động vật có vú, chim, bò sát

Chúng phân bố rộng rãi trong môi trường đất, nước, nước thải và phân Các loài

khác của Proteus phân bố ít rộng rãi hơn như Proteus penneri không tìm thấy trong

ruột gia súc mà chúng có trong vết thương, mẫu nước tiểu, sỏi bàng quan… [17], [20]

Proteus sinh trưởng tối ưu ở 37oC, chúng dễ dàng mọc trên các môi trường

nuôi cấy thông thường [17] Trên môi trường thạch dinh dưỡng, vi khuẩn Proteus

phát triển thành khuẩn lạc có dạng một vòng tròn đồng tâm, các vòng tròn lan dần ra từng đợt, mỗi đợt là một gợn sóng và có mùi hôi

Trên môi trường có Natri Deoxycholate, Proteus mọc thành khuẩn lạc trơn,

tròn, riêng biệt không gợn sóng, có một điểm đen ở trung tâm, xung quanh màu

trắng nhạt Các tế bào Proteus phát triển trên môi trường lỏng dưới dạng hình que

ngắn 1,5 – 2 µm với 6 – 10 lông roi quanh bề mặt Trên môi trường rắn, các tế bào

của Proteus kéo dài 60 - 80 µm với hàng trăm đến hàng ngàn lông roi mới [17]

Hình 1.2: Sự lan tỏa (swarming) của Proteus mirabilis trên môi trường thạch

1.1.3. Đặc tính sinh lý và sinh hóa của Proteus

Proteus thuộc nhóm kị khí tùy tiện, chúng có khả năng lên men một số loại

đường nhất định mà dựa vào đó người ta có thể phân biệt Proteus với các loài vi

khuẩn khác Các loài thuộc chi Proteus có thể phân biệt với các chi Morganella và Providencia dựa vào các phản ứng hóa sinh sau: có khả năng sản sinh H2S và lipase,

khả năng thủy phân gelatin, không có khả năng sinh acid từ việc lên men manose Ở

cấp độ loài, có thể phân biệt Proteus mirabilis với Proteus vulgaris bằng khả năng sản xuất indol từ Tryptophan, khoảng 95,7% Proteus mirabilis cho kết quả âm tính trong khi đó Proteus vulgaris lại cho kết quả 88,9% dương tính với thử nghiệm

indol (IND) [17] [20]

Hầu hết các chủng Proteus đều có khả năng sản sinh enzyme urease mạnh,

nhanh chóng thủy phân urea thành ammoniac và carbon monoxide (CO) Các đặc điểm sinh hóa đặc trưng của Proteus được trình bày trong Bảng 1.1 [17]

Tế bào của vi khuẩn Proteus rất đăc biệt, có thể tồn tại dưới hai dạng hình

thái và sinh lý riêng biệt, được gọi là tế bào bơi (swimmer) và các tế bào lan

(swarmer) Trong môi trường lỏng P mirabilis được tìm thấy trong trạng thái tế bào

bơi (swimmer), hình que ngắn, có chiều dài từ 1,5 - 2 µm với 6 đến 10 lông roi phân

bố đều trên bề mặt tế bào Trên môi trường rắn, Proteus có khả năng chuyển đổi

sang trạng thái tế bào lan Các tế bào vi khuẩn kéo dài đáng kể để tạo thành sợi dài

hơn rất nhiều lần so với tế bào bơi ban đầu, chiều dài tế bào lan khoảng 10 µm đến

80 µm với rất nhiều lông roi xung quanh (khoảng 103 - 104 lông roi)

Bảng 1.1: Một số phản ứng sinh hóa của Proteus

Phản ứng sinh hóa Kết

quả Phản ứng sinh hóa

Kết quả

+

- + +

Sản sinh ONPG Sinh acid khi len men mannose Sinh acid khi len men inositol Sinh acid khi len men D-mannitol

Sinh acid khi len men D-arabitol Sinh acid khi len men adonjtol Sinh acid khi len men erythritol Thủy phân gelatin

bề mặt với một số lượng lớn các tế bào lan Tự tế bào lan không thể di chuyển được trên bề mặt thạch mà các tế bào lan cần kết bè với nhau (Hình 1.4) [17]

Hình 1.3: Tế bào bơi (swimmer) và tế bào lan (swarmer) của vi khuẩn Proteus

mirabilis

Khi đưa tế bào bơi từ môi trường lỏng vào môi trường rắn (chẳng hạn như môi trường thạch dinh dưỡng) tế bào bơi sẽ thay đổi về mặt hình thái và sinh lý Sau khi tiếp xúc với bề mặt môi trường, các tế bào sẽ nhanh chóng biệt hóa tạo thành các

tế bào có hình thái và sinh hóa đặc trưng gọi là tế bào lan Ngoài chiều dài và số lượng lông roi nhiều gấp bội lần so với tế bào bơi thì số lượng nhiễm sắc thể trong mỗi tế bào cũng tỉ lệ thuận với gia tăng chiểu dài Đồng thời về mặt sinh lý, có sự gia tăng đáng kể trong tổng hợp protein và enzym urease được sản xuất với số lượng cao hơn so với ở trạng thái tế bào bơi từ 30 đến 80 lần Các polysaccharid được tiết

ra với số lượng lớn từ các tế bào và điều này tạo điều kiện cho việc tăng cường độ bám dính và di chuyển của các tế bào

Hình 1.4: Tế bào lan của Proteus mirabilis kết thành bè và di chuyển trên một

+ Giai đoạn 2: Giai đoạn chuẩn bị trước khi chuyển động

+ Giai đoạn 3: Giai đoạn lan tỏa (các tế bào lan tương tác với nhau và phối hợp chuyển động theo hướng từ vị trí ban đầu trong khoảng vài giờ)

+ Giai đoạn 4: Là giai đoạn củng cố, các tế bào ngừng di chuyển và biệt hóa trở lại hình thái ban đầu của tế bào bơi (swimmer)

Quá trình tiếp tục lặp lại tạo nên các vòng tròn đồng tâm trên bề mặt thạch cho đến khi bao phủ kín đĩa thạch

1.1.4. Tình hình nghiên cứu về chi Proteus trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Proteus, đặc biệt là các loài Proteus mirabilis và Proteus vulgaris về khả năng gây ra bệnh lý nhiễm trùng

đường tiết niệu Proteus không phải là nguyên nhân quan trọng của bệnh lí nhiễm trùng đường tiết niệu mà chúng chỉ gây bệnh khi chức năng bình thường của đường tiết niệu bị xáo trộn hoặc có thể lây truyền giữa những người sử dụng ống thông tiểu

kéo dài Ngoài ra, Proteus còn là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng vết thương và

nhiễm trùng huyết, viêm não màng não ở trẻ sơ sinh, viêm mủ màng phổi, viêm tủy

xương… Ở bò, Proteus mirabilis và Proteus vulgaris gây viêm nội mạc tử cung, sẩy

thai, viêm dạ dày, viêm khớp… [17]

Hình 1.5: Minh họa 4 giai đoạn trong một chu kỳ lan toả của tế bào Proteus

mirabilis

Ở lợn, Proteus gây hội chứng mất sữa sau khi sinh, lây nhiễm đường tiết

niệu, tiêu chảy Ở chó, mèo, chúng gây viêm bàng quang, đôi khi Proteus được coi

như là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Ở nhiều loài cá, Proteus penneri gây bệnh

xuất huyết [17]

Trong y học, Proteus mirabilis được sử dụng làm kháng nguyên trong phản ứng

huyết thanh chẩn đoán bệnh sốt mò do cấu trúc kháng nguyên oxk của vi khuẩn

Proteus mirabilis tương tự với kháng nguyên của ấu trùng mò Rickettsia orientalis [3].

Trên thế giới đã có một vài nghiên cứu về khả năng sản sinh bacteriocin của

Proteus [5], [14] Ở Việt Nam, khả năng sản sinh bacteriocin của chúng đã được bắt

đầu nghiên cứu [24]

Người ta có thể định danh vi khuẩn Proteus bằng sử dụng các kĩ thuật như

xác định đặc điểm hình thái, sinh lý đặc trưng, sử dụng bộ Kit API 20E, sử dụng kĩ thuật lai DNA-DNA, kĩ thuật giải và phân tích trình tự gen 16S rDNA Một số

nghiên cứu mới đây sử dụng gen rpoB như chỉ thị phân tử để hổ trợ cho định danh

vi khẩn Proteus đã cho kết quả khả quan với khả năng phân tách tốt hơn nhiều so

với việc sử dụng gen 16S rDNA [8], [13], [17]

1.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn

1.2.1. Tổng quan chung về các phương pháp định danh vi khuẩn

Định danh vi khuẩn là công việc xếp loại vi khuẩn theo hệ thống đơn vị phân loại sinh vật với danh pháp theo thứ tự giới (kingdom), ngành (phylum), lớp (class),

bộ (order), họ (family), chi (genus), loài (species), dưới loài (subspecies)

Có rất nhiều phương pháp để định danh vi khuẩn trong đó có phương pháp định danh chính như sau:

- Định danh bằng phương pháp truyền thống

- Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống

1.2.1.1 Định danh bằng phương pháp truyền thống

Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987 khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dáng tế bào Mặc dù phương pháp này tỏ ra tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức… nhưng vẫn được sử dụng để định danh vi khuẩn vì các ưu điểm lớn của nó như: đây là phương pháp tiêu chuẩn vì nó được xây dựng và phát triển trong thời gian dài được nhiều nước công

nhận, quá trình phân lập trải qua nhiều bước chọn lọc, khẳng định nên kết quả có độ tin cậy cao

Phương pháp truyền thống định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như đặc điểm hình thái, sinh lý, nhuộm, hình thái tế bào khuẩn lạc, khả năng di động

Định danh bằng phương pháp Bacteriophage: dựa trên cơ sở khoa học là mỗi loại vi khuẩn là vật chủ của một loại virus gọi là Bacteriophage, mỗi phage có thể nhân lên đặc hiệu ở mỗi loài vi khuẩn nhất định và gây bệnh cho vi khuẩn đó Bằng phương pháp dùng phage đã biết trước cho tiếp xúc với vi khuẩn đang cần xác định, nếu đặc hiệu thì tế bào vi khuẩn sẽ bị phage gây bệnh và phá hủy Tuy nhiên phương pháp này thực tế không được sử dụng để định danh vi khuẩn vì nó bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết như các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với phage bị ảnh hưởng bởi ngoại cảnh hoặc các vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các bacteriophage khác nhau Điều quan trọng nữa là bacteriophage rất

dễ biến đổi đặc tính nên dẫn đến làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ

Phân loại vi khuẩn theo kiểu huyết thanh: Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật Ưu điểm của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để phân biệt nhiều chi vi khuẩn khác nhau thậm chí nhiều trường hợp có thể đặc trưng cho loài Hạn chế của phương pháp này là yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa các phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính

ổn định giữa các lần lặp lại

Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn: nguyên tắc phân loại dựa vào các kiểu bacteriocin Bản chất của bacteriocin là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại các vi khuẩn khác Vì vậy loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó

Như vậy ta có nhiều phương pháp truyền thống khác nhau để phân loại và định danh vi khuẩn Tuy nhiên, mỗi cách lại có nhược điểm nhất định và không có

tính vạn năng để áp dụng cho tất cả các vi khuẩn Vì vậy để có kết quả chính xác hơn cần phải kết hợp các phương pháp để định danh

1.2.1.2 Định danh bằng các phương pháp phi truyền thống

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp truyền thống, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa như phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot) và các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, multiplex – PCR, Realtime PCR… Các phương pháp này gọi chung là các phương pháp hiện đại Đặc điểm chung của các phương pháp này là cho kết quả nhanh hơn phương pháp truyền thống và có thể áp dụng cho tất cả các

vi sinh vật kể cả các vi sinh vật khó có khả năng nuôi cấy như các xoắn khuẩn (tác nhân gây bệnh giang mai), các tác nhân gây bệnh đường sinh dục, vi khuẩn lao, Helicobacter (Hp)…

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Hiện nay

kĩ thuật này đã được cải tiến rất nhiều so với bản gốc của chúng và được sử dụng rộng rãi nhất trong việc định danh phát hiện các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh

PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA từ mạch khuôn từ một trình tự

đích ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của trình tự khuôn thành hàng triệu bản sao khác nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

Nguyên tắc chung của phương pháp PCR: phản ứng PCR là một chuỗi các quy trình kế tiếp nhau dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ tăng theo mỗi chu kỳ của phản ứng

Một chu kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn chính:

• Giai đọan biến tính: phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thường là 94-95oC làm phá vỡ các liên kết hydrogen để tách hai sợi DNA ra

• Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ được hạ thấp xuống khoảng 40-70oC (thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn DNA sợi đơn

• Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được tăng lên 72oC, enzyme DNA polymerase hoạt động, nối dài mồi để hình thành mạch mới

Các thành phần của phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR

+ Khuôn DNA

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1 µg xuống còn 100 ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao.Một ưu điểm lớn của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết…

+ Enzyme

Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng là từ 1 – 2,5 đơn vị (u) cho

100 µl dung dịch phản ứng Thông thường có thể sử dụng 0,5 u/25 µl Nếu nồng độ Taq polymerase quá cao, có thể dẫn tới các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme

để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn

+ Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA ngắn cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Mồi là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR.Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:

• Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược cũng như không có cấu trúc kẹp tóc do có

sự bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một mồi

• Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

• Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

• Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên trình tự nhỏ hơn 1 kb

+ Nồng độ các dNTP

Nồng độ dNTP (deoxynucleotide triphotphate) thường được sử dụng là 20 –

200 µM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh’’ Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Mất cân bằng trong thành phần các dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Số lượng chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu Ví dụ nếu số lượng bản mẫu là 105 bản sao thì cần 25-30 chu kỳ, nếu

số lượng bản mẫu là 102-103 thì số chu kỳ thường cần khoảng 35-40 chu kỳ… Trong thực tế, không vượt quá mức 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì các nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau

1.2.2. Các phương pháp định danh vi khuẩn Proteus

1.2.2.1 Định danh bằng test hóa sinh

Yêu cầu đầu tiên cũng là quan trọng đối với test sinh hóa là phải thu được các khuẩn lạc đơn, thuần khiết để việc định danh được chính xác hơn Việc định danh này được thực hiện dựa vào các đặc điểm kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật Các cách để tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh là cách truyền thống, sử dụng bộ Kit và dùng các thiết

bị tự động

Các thử nghiệm sinh hóa của hàng trăm loài vi sinh vật tại nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới được tổng hợp thành những bản định danh vi sinh vật Bảng sinh hóa bao gồm các đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhất để phân loài vi sinh vật được biểu thị bằng một trị số là tỉ lệ phần trăm thử nghiệm sinh hóa cho kết quả dương tính theo thống kê ở một loài sinh vật.như vậy, trị số 100 có nghĩa là 100% trường hợp của loài này đã thử đều cho các thử nghiệm dương tính, ngược lại

số 0 có nghĩa là có 0% trường hợp thử nghiệm cho kết quả dương tính Trong thực

tế kiểm nghiệm, các kết quả thử nghiệm sinh hóa biểu thị quy ước bằng các ký hiệu như (+): dương tính, (-): âm tính; (+/-) khoảng trên 70% là dương tính và (-/+) khoảng 70% là âm tính

Hiện nay đối với việc test sinh hóa bằng Kit thì việc kiểm tra kết quả sau khi test sẽ đơn giản hơn vì sẽ không cần phải dò bảng kết quả mà ta chỉ việc nhập các kết quả vào máy và máy sẽ tự động phân tích các dữ liệu có sẵn trong máy và xuất

ra cho chúng ta kết quả chính xác của loài đó dựa trên kết quả thí nghiệm và dữ liệu

từ máy đó Muốn kết quả chính xác hơn và mang tính cập nhật thì tốt nhất là tra trên

dữ liệu online như trên trang web https://apiweb.biomerieux.com/ hoặc trên ABIS online www.tgw1916.net/intro.html

Ngày nay các thử nghiệm sinh hóa truyền thống để định danh vi sinh vật đã

có thực hiện ở dạng đĩa giấy, que giấy, ngoài ra còn có các bộ Kit cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hóa để đinh danh vi sinh vật một cách dễ dàng và thuận tiện Các bộ Kit này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu điểm là tiết

kiệm thời gian, công sức, tuy nhiên cũng có nhược điểm như mỗi bộ Kit chỉ định danh được một số loại vi sinh vật nhất định, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn

Trong đề tài này chúng tôi chọn bộ Kit API 50CH và bộ Kit API 20E để định

danh các chủng thuộc chi Proteus Bộ Kit API 50CH là bộ Kit bao gồm 49 các phản

ứng sinh hóa dùng để test nhanh khả năng lên men chuyển hóa cacbohydrate của các

vi sinh vật với cơ chất là các loại cacbohydrate và dẫn xuất của chúng như heterosides, polyalcohols, uronic acids Chúng tôi sử dụng bộ Kit 50CHB/E vì đây

là bộ Kit thiết kế riêng để định danh cho Bacillus và các chi liên quan, các chủng

Gram âm thuộc Enterobacteriaceae và họ Virionaceae Trong khi ủ, cacbonhydrate được lên men tạo thành các sản phẩm acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường, và phàn ứng được phát hiện bởi sự thay đổi màu của chỉ thị Phenol red (được cho sẵn vào các giếng) Kit API 50CH được khuyến cáo nên sử dụng kèm theo với Kit API 20E để định danh các Enterobacteriaceae và họ Virionaceae vì đây là bộ Kit được thiết kế riêng để định danh cho các chủng này Trong bộ Kit API 20E có một số các

phản ứng quan trọng đặt trưng để phát hiện các loài thuộc chi Proteus (chi Proteus

mà chúng ta cần định danh thuộc họ Enterobacteriaceae)

1.2.2.2 Định danh bằng sinh học phân tử

Ngày nay sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn Phân tử 16S rRNA ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì tình tự D1/D2 26S rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến

để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử 16S rRNA còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào,

có tính bảo thủ cao nhưng vẫn có sự khác biệt giữa các loài và đặc trưng cho từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự Các trình tự

rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn so với RNA

Việc định danh bằng chỉ thị phân tử 16S rRNA là một công cụ mạnh mẽ và đến nay đã trở thành kỹ thuật phân tử phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để xác định sự khác biệt các loài vi khuẩn bằng sinh học phân tử [15] tuy nhiên kĩ thuật này cho khả năng phân tách loài chưa tốt và không có hướng dẫn thống nhất để xác định thế nào là một loài dựa trên chỉ thị phân tử 16S rDNA, một chủng với mức độ tương đồng lớn hơn 97% có thể hoặc không thể thuộc cùng một loài vì thế cần có những kĩ thuật bổ trợ để xác định chính xác được đến mức loài cho vi khuẩn [17] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra những vấn đề còn hạn chế của việc sử dụng chỉ thị phân tử 16S

rRNA và chứngng minh khả năng phân tách loài khi sử dụng chỉ thị phân tử rpoB để

bổ trợ cho việc định danh đến loài nhất họ Enterrobacteriace [5], [15], [16] Đặc biệt

là các mối quan hệ di truyền chặc chẽ giữa 2 loài P vulgaris và P penneri không

thể phân biệt rõ ràng bằng phương pháp giải trình tự 16S rDNA [16]

Trong số các gen chính của vi khuẩn, gen rpoB đã được xác định là một

trong số ít các gen có tiềm năng thích hợp cho phân tích phát sinh loài vi khuẩn và

đã được đề xuất như một công cụ phổ biến mạnh mẽ để xác định về di truyền của vi

khuẩn [16] Gen rpoB là gen mã hóa cho tiểu đơn vị β-RNA polymerase trong hệ

gen của chúng, như chúng ta đã biết RNA polymerase là một nhân tố quan trọng trong quá trình phiên mã nên có tính bảo thủ và đặc trưng rất cao, mặc khác gen

rpoB lại có mặt trong tất cả các vi khuẩn Việc sử dụng gen rpoB như chỉ thị phân tử

để phân tích phát sinh loài là đặc biệt quan trọng cho các nghiên cứu tập trung trên

mức chi hoặc thấp hơn vì trình tự rpoB đã được chứng minh có thể mô tả những loài khác nhau thuộc chi Proteus trên cơ sở phân tử [7], [8], [16], [20] Gen rpoB là gen

mã hóa protein nên có nhiều lợi thế hơn các gen chỉ thị phân tử mã hóa cho phân tử

RNA (gen rpoB có thể được sử dụng ở cả hai axit amin và nucleotide) Mồi và mẫu

dò cho gen rpoB để phát hiện và phân tích phát sinh loài của một số nhóm vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae đặc biệt là chi Proteus đã được thiết kế riêng ([6], [13],

[16], [26]

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kết hợp cả quan sát hình thái,

nhuộm Gram, test sinh hóa, giải trình tự gen 16S rDNA và gen rpoB với các đoạn

mồi đặc hiệu nhờ phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để định danh 5

chủng vi khuẩn Proteus

CHƯƠNG 2. Vật liệu và phương pháp

2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn Proteus sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ bộ sưu tập

chủng vi khuẩn của Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và môi trường (Bảng 2.1) [18], [19], [24]

Bảng 2.1 Danh sách các chủng vi khuẩn Proteus sử dụng cho nghiên cứu

STT Chủng vi khuẩn Nguồn gốc phân lập Đặc điểm sinh học

1 Proteus sp B3.7A Tôm sú (Penaeus monodon) Có khả năng sinh bacteriocin

2 Proteus sp B3.10B Cá giò (Rachycentron

canadum)

Có khả năng sinh bacteriocin

3 Proteus sp CT1.1 Tôm hùm bông (Ornate spiny lobster) Có khả năng sinh bacteriocin

4 Proteus sp G1 Tôm sú

(Black tiger shrimp)

Có khả năng sinh bacteriocin

5 Proteus sp N1.4 Tôm hùm bông (Ornate spiny lobster) Có khả năng sinh bacteriocin

2.1.2. Hóa chất, môi trường, thuốc thử

2.1.2.1. Hóa chất

• Bộ kít API 20E:

- Strip API 20E

- Môi trường API NaCl 0.85%

- API 20E reagent kit (1 hộp gồm các thuốc thử: TDA, IND, VP 1, VP 2, NIT

1, NIT 2, JAME) và dầu khoáng

- Dung dịch đệm TE 1X (Tris 10 mM – EDTA 1mM)

- Proteinase K 20 mg/ml

- Rnase 4 mg/ml

- Wizard SV Lysis Buffer

- Wizard SV Wash Solution

- Nước loại nuclease

- Cột

• Hóa chất cho điện di

- Dung dịch đệm Tris-borat/EDTA 10X (TBE): 108g Tris base, 55g acid boric, 40ml EDTA 0.5M

- Dung dịch đệm mang mẫu (6X)

- Ethidium bromide 10 mg/ml

- Thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas, Mỹ)

- Agarose tinh khiết

- Cặp mồi 16S-27F, 16S-1492R và cặp mồi CM7, CM31b do công ty IDT

(Integrated DNA Technologies) tổng hợp

2.1.2.2 Môi trường

• Môi trường TSB (Trypticase Soy Broth):

+ Thành phần:

Trypticase peptone 17 g Phytone peptone 3 g

+ Cách pha: Bổ sung thêm 1% muối NaCl, làm nóng và lắc nhẹ để hòa tan, phân phối 20 ml vào các bình tam giác 100 ml Hấp ở 121oC trong 15 phút

• Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar):

+ Thành phần:

Trypticase peptone 15 g Phytone peptone 5 g

- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

- Kính hiển vi 3 mắt BA 300 (Motic/Xiamen-Trung Quốc)

- Cân kỹ thuật BL 3200 (Shimadzu/Nhật)

- Máy lắc vòng 3005 (Gel/ Đức)

- Tủ âm sâu DF 9007 (Labkorea/Hàn Quốc)

- Tủ cấy (Telstar AV 100, Tây Ban Nha)

- Tủ sấy ED115 (Binder, Đức)

- Nồi khử trùng (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan)

- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)

- Máy vortex Maxi mix II M37615 (Thermolyne, Mỹ)

- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

- Máy Densimat (IDN007881, BioMériux Italia S.p.A)

- Máy PCR DNA Engine (Biorad, Mỹ)

- Bộ điện di (Biorad, Mỹ)

- Máy đinh danh vi khuẩn API INS004395

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Cách tiếp cận tổng quát của đề tài được trình bày trên Hình 2.1

2.3.1 Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm Gram dương (positive Gram bacteria) và Gram âm (negative Gram bacteria) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào Phương pháp này được đặt tên theo tên nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 -1938) Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến

Các bước tiến hành nhuộm Gram:

- Dùng bút viết kính vẽ 1 đường tròn lên lam kính để giới hạn vùng phết vi khuẩn

- Nhỏ 1 giọt nước từ bình tia vào vòng tròn đã vẽ

- Dùng que cấy thu sinh khối từ khuẩn lạc chọn lọc, rồi đưa vào lam kính, dàn đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, tránh để lâu quá nóng sẽ làm tế bào vi khuẩn vỡ ra, làm lệch kết quả quan sát

- Nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút

- Nghiêng đổ rồi rửa lại bằng nước cất

- Nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước cất bằng bình tia

- Rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 96% cho đến khi phiến kính bạc màu trong khoảng 10 – 15 giây, rồi rửa lại với nước

- Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại với nước

- Để khô tự nhiên hoặc dung giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh vùng

vi khuẩn, sau đó đưa lên vật kính dầu quan sát 100X

2.3.2 Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn

Nuôi cấy vi khuẩn

Mỗi loại vi khuẩn khác nhau có điều kiện sinh trưởng và phát triển khác nhau

vì thế cần nghiên cứu thật kĩ về vi khuẩn đó trước khi tiến hành nuôi cấy để đảm bảo điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho vi khuẩn đó sinh trưởng và phát triển tốt nhất, đảm bảo tiết kiệm được thời gian, chi phí, hiệu quả nghiên cứu Proteus thuộc loại

vi khuẩn kị khí tùy ý, chúng sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37oC

Hình 2.1: Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát của đề tài

Bảo quản vi khuẩn Nuôi lỏng trong môi

trường TSB Chọn khuẩn lạc đơn, đặc trưng

Thử nghiệm API

20E

Thử nghiệm API 50CH

Tách chiết DNA

Điện di kiểm tra kết quả

Giải trình tự, phân tích trình tự Xây dựng cây phân loại

Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rpoB

Môi trường NaCl

0,85%

(API,Biomeriex)

Môi trường 50 CHB/E

Định danh loài

+ Đối với môi trường TSA sau khi hấp khử trùng để nguội khoảng 45 – 50oC thì đổ đĩa, đợi môi trường thạch đông lại thì tiến hành cấy vi khuẩn (bằng phương pháp cây trang hoặc cấy ria để kiểm tra tạp nhiễm hoặc để tạo khuẩn lạc đơn) Nuôi vi khuẩn bằng cách để trong tủ ấm 37oC từ 18- 24 giờ

Bảo quản vi khuẩn

Có nhiều phương pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau như cấy truyền định kỳ lên môi trường mới, phương pháp lạnh đông, phương pháp đông khô, phương pháp bảo quản bằng nitơ lỏng…Thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một hoặc một vài phương pháp bảo quản nhất định Và tùy theo mục đích sử dụng, loại vi sinh vật cần bảo quản, thời gian bảo quản và điều kiện kinh tế, cơ sở vật chất mà ta lựa chọn phương pháp bảo quản thích hợp nhất

Do điều kiện cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm và điều kiện nghiên cứu làm thí nghiệm chúng tôi sử dụng phương pháp bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ - 67oC Với phương pháp này tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu

do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước đá trong tế bào, vì thế để khắc phục nhược điểm này người ta thường bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide), ở đây cụ thể chúng tôi sử dụng glycerol bổ sung vào sao cho dịch đem đi bảo quản có nồng độ cuối glycerol là 30%

2.3.3 Định danh vi khuẩn bằng thử nghiệm sinh hóa

2.3.3.1 Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 20E

Bộ kít API 20E (Biomerieux, Pháp) là hệ thống định danh được chuẩn hóa đối với họ Enterobacteriaceae, sử dụng 20 phản ứng sinh hóa kết hợp thử nghiệm oxidase và phân tích kết quả dựa trên phần mềm vi tính Kết quả được định danh trên phần mềm APIweb Các thử nghiệm trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 20E

+ Kiểm tra độ đục sao cho McF = 0.5

+ Dùng pipet hút dịch, lần lượt bơm vào 20 test của kit API 20E đến miệng của tube Lưu ý đối với test CIT, VP, GEL bơm đầy tube, test ADH, LDC, ODC, URE và H2S sau khi bơm dịch vi khuẩn đến miệng tube thì tiếp tục bơm dầu khoáng

vô trùng đến khi đầy tube mục đích tạo điều kiện kị khí cho phản ứng Sau 24 giờ đọc kết quả, nếu như kết quả có số phản ứng dương tính (không kể test GLU là âm tính hay dương tính) lớn hơn 3 thì ta sẽ thêm thuốc thử TDA, JAMES, VP1+VP2 tương ứng vào 3 test TDA, IND, VP và ghi kết quả.Nếu như kết quả có số phản ứng dương tính (bao gồm cả test GLU) sau khi thêm thuốc thử nhỏ hơn 3 thì ủ lại strip thêm 24h nữa với thuốc thử và đọc kết quả

2.3.3.2 Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 50CH

Bộ Kit API 50CH sử dụng 49 phản ứng sinh hóa xác định khả năng lên men cacbohydrate của vi sinh vật Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, kết quả được định danh trên phần mềm APIweb Các thử nghiệm được trình bày trong Bảng 2.3

Bảng 2.3: Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 50CH

Thử nghiệm Cơ chất cacbohydrate (mg/giếng)

+ Hút dịch và lần lược bơm vào tất cả 50 test đến vạch đầu tiên của tube

+ Tiếp tục bơm dầu khoáng vô trùng đầy tube cho tất cả 50 test

+ Nuôi trong tủ ấm 37oC sau mỗi 24 tiếng, 48 tiếng, đối chiếu để kiểm tra và đọc kết quả dựa trên sự thay đổi màu của môi trường trong các giếng

2.3.4 Kĩ thuật tách chiết DNA tổng số

Từ đĩa thạch cấy ria (hoặc cấy trang), ta chọn một khuẩn lạc riêng lẻ chuyển vào bình tam giác chứa 20 ml môi trường TSB (đã được khử), đem nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng, 180 vòng/phút Thu sinh khối và tách chiết DNA bộ gen của

vi khuẩn bằng bộ kít tách chiết DNA bộ gen Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega, Mỹ) DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ được kiểm

tra bằng cách điện di trong đệm TBE 0.5X dưới nguồn điện 110V để đọc kết quả, DNA được tách chiết thành công sẽ được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các phản ứng PCR tiếp theo

- Các bước tiến hành tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA

Purification System:

+ Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng

+ Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ phần dịch nổi bên trên, rửa cặn tế bào 1 lần bằng đệm TE 1X rồi ly tâm 13000 vòng trong 2 phút như trên để loại bỏ phần dịch nổi

+ Sau đó thêm vào 275 µl dung dịch phá tế bào vào mỗi ống, trộn đều

+ Ủ ống mẫu trên các block nhiệt ở 55oC trong 1 giờ

+ Thêm 250 µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống, sau đó đem trộn nhẹ

+ Ly tâm nhẹ, thu phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1,5 ml)

+ Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ dịch thu được

+ Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mới + Thêm vào 650 µl dung dịch rửa (Wizard SV Wash Solution)

+ Ly tâm 13000 vòng 2 phút, loại bỏ phần dung dịch rửa thu được

+ Lặp lại bước rửa này thêm 1 lần nữa

+ Chuyển cột Wizard SV minicolumn sang một Eppendorf 1,5 ml mới

+ Thêm vào 100 µl dung dịch đệm TE 1X, ly tâm ở 13000 vòng trong 2 phút + Cột Wizard SV Minicolumn được loại bỏ thu được dung dịch DNA

+ Dịch chiết DNA được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng

2.3.5. Kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB

Các bước tiến hành

Phản ứng PCR nhân đoạn gen rpoB

+ Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng PCR này là CM7 và CM31b (Mollet

et al., 1997) được thiết lập cách nhau 1090bp trong gen rpoB Trình tự của 2 mồi

như sau:

Mồi xuôi CM7: 5’-AACCAGTTCCGCGTTGGCCTGG-3’ (22 nu)

Mồi ngược CM31b: 5’-CCTGAACAACACGCTCGGA-3’ (19 nu)

+ Thành phần phản ứng PCR (cho 50 µl phản ứng)

Thành phần Thể tích (µl)

H20 đã khử ion MgCl2 25 mM dNTPs 10 mM

Mồi xuôi CM7 Mồi ngược CM31b

Taq Buffer 10X Taq DNA polymerase DNA

2 + Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần

ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Taq (1X)

+ Chu trình nhiệt

▪ Giai đoạn 1: 94oC trong 3 phút

▪ Giai đoạn 2: 94oC trong 30 giây

52oC trong 30 giây

72oC trong 1 phút 20 giây

Lặp lại 35 chu kỳ

▪ Giai đoạn 3: 72oC trong 7 phút

▪ Giai đoạn 4: Giữ ở 24oC

+ Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi CM7 và CM31b

Để tiến hành khảo sát nhiệt độ tối ưu nhất cho phản ứng PCR nhân bản đoạn

gen rpoB chúng tôi thực hiện các phản ứng PCR các điều của phản ứng đều được

giữ nguyên và đồng nhất, còn nhiệt độ bắt cặp của mồi sẽ tiến hành khảo sát trên một gradient nhiệt độ từ 50oC đến 62oC Dựa trên phân tích kết quả điện di chúng

tôi sẽ lựa chọn ra nhiệt độ tối ưu nhất cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen rpoB

Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rDNA

+ Cặp mồi 16S-27F và 16S-1492R (Luan et al., 2007) được sử dụng cho phản

ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA này (IDT, Mỹ) có trình tự như sau:

Mồi xuôi 16S-27F: 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (20 nu)

Mồi ngược 16S-1492R: 5'ACGGCTACCTTGTTACGACT (20 nu)