• Thuốc nhuộm Tím Violet:
- Tím Violet: 1 g
- Ethylic: 1 g
- Phenol tinh thể: 2 g
- Nước cất vô trùng: đủ 100 ml
● Thuốc nhuộm Lugol:
- Iod tinh thể: 1 g
- KI: 2 g
- Nước cất vô trùng: đủ 100 ml
● Thuốc nhuộm Fuschin:
- Fuschin kiềm: 1 g
- Rượu ethylic 95%: 10 ml
- Phenol tinh thể : 5 g
- Nước cất vô trùng: đủ 100 ml
2.2. Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng
- Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)
- Kính hiển vi 3 mắt BA 300 (Motic/Xiamen-Trung Quốc)
- Máy lắc vòng 3005 (Gel/ Đức)
- Tủ âm sâu DF 9007 (Labkorea/Hàn Quốc)
- Tủ cấy (Telstar AV 100, Tây Ban Nha)
- Tủ sấy ED115 (Binder, Đức)
- Nồi khử trùng (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan)
- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)
- Máy vortex Maxi mix II M37615 (Thermolyne, Mỹ)
- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)
- Máy Densimat (IDN007881, BioMériux Italia S.p.A)
- Máy PCR DNA Engine (Biorad, Mỹ)
- Bộđiện di (Biorad, Mỹ)
- Máy đinh danh vi khuẩn API INS004395
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Cách tiếp cận tổng quát của đề tài được trình bày trên Hình 2.1.
2.3.1. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm Gram dương (positive Gram bacteria) và Gram âm (negative Gram bacteria) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Phương pháp này được
đặt tên theo tên nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 -1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến.
Các bước tiến hành nhuộm Gram:
- Dùng bút viết kính vẽ 1 đường tròn lên lam kính để giới hạn vùng phết vi khuẩn.
- Nhỏ 1 giọt nước từ bình tia vào vòng tròn đã vẽ.
- Dùng que cấy thu sinh khối từ khuẩn lạc chọn lọc, rồi đưa vào lam kính, dàn
đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, tránh để lâu quá nóng sẽ làm tế bào vi khuẩn vỡ ra, làm lệch kết quả quan sát.
- Nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút.
- Nghiêng đổ rồi rửa lại bằng nước cất.
- Nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước cất bằng bình tia.
- Rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 96% cho đến khi phiến kính bạc màu trong khoảng 10 – 15 giây, rồi rửa lại với nước.
- Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại với nước.
- Để khô tự nhiên hoặc dung giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh vùng vi khuẩn, sau đó đưa lên vật kính dầu quan sát 100X.
2.3.2. Nuôi cấy và bảo quản vi khuẩn
Nuôi cấy vi khuẩn
Mỗi loại vi khuẩn khác nhau có điều kiện sinh trưởng và phát triển khác nhau vì thế cần nghiên cứu thật kĩ về vi khuẩn đó trước khi tiến hành nuôi cấy để đảm bảo điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho vi khuẩn đó sinh trưởng và phát triển tốt nhất,
đảm bảo tiết kiệm được thời gian, chi phí, hiệu quả nghiên cứu. Proteus thuộc loại vi khuẩn kị khí tùy ý, chúng sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37oC.
- Cách tiến hành:
+ Ống giống gốc cần được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh bằng cách đưa ngay vào tủấm 37oC trong 40-60 giây.
+ Dùng pipet hút dịch từ trong eppendorf vào bình tam giác chứa môi trường
đã được khử trùng.
Hình 2.1: Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát của đề tài
Bảo quản vi khuẩn Nuôi lỏng trong môi
trường TSB Chọn khuẩn lạc đơn, đặc trưng Thử nghiệm API 20E Thử nghiệm API 50CH Tách chiết DNA Điện di kiểm tra kết quả Giải trình tự, phân tích trình tự
Xây dựng cây phân loại Chủng vi khuẩn Hoạt hóa Cấy truyền Cấy ria/Cấy trang Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rpoB
Môi trường NaCl 0,85% (API,Biomeriex)
Môi trường 50 CHB/E
+ Đối với môi trường TSA sau khi hấp khử trùng để nguội khoảng 45 – 50oC thì đổ đĩa, đợi môi trường thạch đông lại thì tiến hành cấy vi khuẩn (bằng phương pháp cây trang hoặc cấy ria để kiểm tra tạp nhiễm hoặc để tạo khuẩn lạc đơn). Nuôi vi khuẩn bằng cách để trong tủấm 37oC từ 18- 24 giờ.
Bảo quản vi khuẩn
Có nhiều phương pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau như cấy truyền định kỳ
lên môi trường mới, phương pháp lạnh đông, phương pháp đông khô, phương pháp bảo quản bằng nitơ lỏng…Thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một hoặc một vài phương pháp bảo quản nhất định. Và tùy theo mục đích sử
dụng, loại vi sinh vật cần bảo quản, thời gian bảo quản và điều kiện kinh tế, cơ sở
vật chất mà ta lựa chọn phương pháp bảo quản thích hợp nhất.
Do điều kiện cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm và điều kiện nghiên cứu làm thí nghiệm chúng tôi sử dụng phương pháp bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ - 67oC. Với phương pháp này tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể
nước đá trong tế bào, vì thếđể khắc phục nhược điểm này người ta thường bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide), ở đây cụ thể chúng tôi sử dụng glycerol bổ sung vào sao cho dịch đem đi bảo quản có nồng độ cuối glycerol là 30%.
- Cách tiến hành:
Dịch vi khuẩn sau khi hoạt hóa qua đêm được cấy truyền sang môi trường TSB đem nuôi lắc 180 vòng/phút trong thời gian 3 tiếng sau đó tiến hành bảo quản vi khuẩn. Dùng pipet pauster hút 300 µl glycerol cho vào eppendorf 1.5 ml sau đó hút 700 µl dịch vi khuẩn trên cho vào eppendorf trên, mix đều cho glycerol trộn đều với dịch vi khuẩn. Ghi tên chủng, ngày, tháng tiến hành bảo quản lên trên eppendorf sau đó cho vào trong túi đem bảo quản trong tủ lạnh -67oC. Chú ý đầu tuýp, eppendorf, glycerol phải được hấp khử trùng 121oC trong 15 phút để tránh tạp nhiễm.
2.3.3. Định danh vi khuẩn bằng thử nghiệm sinh hóa
2.3.3.1. Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 20E
Bộ kít API 20E (Biomerieux, Pháp) là hệ thống định danh được chuẩn hóa
đối với họ Enterobacteriaceae, sử dụng 20 phản ứng sinh hóa kết hợp thử nghiệm oxidase và phân tích kết quả dựa trên phần mềm vi tính. Kết quả được định danh trên phần mềm APIweb. Các thử nghiệm trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 20E
Thử nghiệm Phản ứng – enzyme (mg/giếng)
0. OPNG β-galactosidase 0,223
1. ADH Argine Dihydrolase 1,9
2. LDC Lysine Decacboxylase 1,9
3. ODC Ornithine Decacboxylase 1,9
4. CIT Sử dụng Citrate 0,756
5. H2S Sản xuất H2S 0,075
6. URE Urease 0,76
7. TDA Triptophane Deaminase 0,38
8. IND Sản xuất Indole 0,19
9. VP Sản xuất Acetoin 1,9
10. GEL Gelatinase 0,6
11. GLU Len men – oxy hóa Glucose 1,9
12. MAN Len men – oxy hóa Mannitol 1,9
13. INO Len men – oxy hóa Inositol 1,9
14. SOR Len men – oxy hóa Sorbitol 1,9
15. RHA Len men – oxy hóa Rhamnose 1,9
16. SAC Len men – oxy hóa D-saccharose 1,9
17. MEL Len men – oxy hóa Melibiose 1,9
18. AMY Len men – oxy hóa Amygdalin 0,57
- Các bước tiến hành:
+ Từđĩa thạch cấy ria chọn một khuẩn lạc to, riêng rẻ, đặc trưng cho vào môi trường nuôi cấy tương ứng.
+ Cho khuẩn lạc vào môi trường API NaCl 0.85%, trộn bằng máy vortex Maxi mix II M37615 cho khuẩn lạc tan đều trong môi trường.
+ Kiểm tra độ đục sao cho McF = 0.5.
+ Dùng pipet hút dịch, lần lượt bơm vào 20 test của kit API 20E đến miệng của tube. Lưu ý đối với test CIT, VP, GEL bơm đầy tube, test ADH, LDC, ODC, URE và H2S sau khi bơm dịch vi khuẩn đến miệng tube thì tiếp tục bơm dầu khoáng vô trùng đến khi đầy tube mục đích tạo điều kiện kị khí cho phản ứng. Sau 24 giờ đọc kết quả, nếu như kết quả có số phản ứng dương tính (không kể test GLU là âm tính hay dương tính) lớn hơn 3 thì ta sẽ thêm thuốc thử TDA, JAMES, VP1+VP2 tương ứng vào 3 test TDA, IND, VP và ghi kết quả.Nếu như kết quả có số phản ứng dương tính (bao gồm cả test GLU) sau khi thêm thuốc thử nhỏ hơn 3 thì ủ lại strip thêm 24h nữa với thuốc thử và đọc kết quả.
2.3.3.2. Định danh bằng sử dụng bộ Kit API 50CH
Bộ Kit API 50CH sử dụng 49 phản ứng sinh hóa xác định khả năng lên men cacbohydrate của vi sinh vật. Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, kết quả được định danh trên phần mềm APIweb. Các thử nghiệm được trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3: Các thử nghiệm sử dụng trong Kit API 50CH
Thử nghiệm Cơ chất cacbohydrate (mg/giếng)
Đối chứng - 1. GLY Glycerol 1.64 2. ERY Erythritol 1,44 3. DARA D-Arabinose 1,4 4. LARA L- Arabinose 1,4 5. RIB D-Ribose 1,4 6. DXYL D-Xylose 1,4 7. LXYL L-Xylose 1,4 8. ADO D-Adonitol 1,36 9. MDX Methyl-β-D-Xylopyranoside 1,28 10. GAL D-Galactose 1,4
Thử nghiệm Cơ chất cacbohydrate (mg/giếng) 11. GLU D-Glucose 1,56 12. FRU D-Fructose 1,4 13. MNE D-Mannose 1,4 14. SBE L-Sorbose 1,4 15. RHA L- Rhamnose 1,36 16. DUL Dulciton 1,36 17. INO Inocitol 1,4 18. MAN D-Mannitol 1,36 19. SOR D-Sorbitol 1,36 20. MDM Methyl-α-D-Mannopyranoside 1,28 21. MDG Methyl-α-D-Glucopyranoside 1,28 22. NAG N-Acetylglucosamine 1,28 23. AMY Amygdalin 1,08 24. ARB Arbutin 1,08 25. ESC Esculin ferric citrate 1,16 0,152 26. SAL Salicin 1,04 27. CEL D-Celobiose 1,32 28. MAL D-Maltose 1,4
29. LAC D-Lactose (bovine origin) 1,4
30. MEL D-Melibiose 1,32 31. SAC D-Saccharose 1,32 32. TRE D-Trehalose 1,32 33. INU Inulin 1,28 34. MLZ D-Melezitose 1,32 35. RAF D-Rafinose 1,56 36. AMD Amidon 1,28 37. GLYG Glycogen 1,28 38. XLT Xylitol 1,4 39. GEN Gentiobiose 0,5 40. TUR D-Turanose 1,32 41. LYX D-Lyxose 1,4 42. TAG D-Tagatose 1,4 43. DFUC D-Fucose 1,28 44. LFUC L-Fucose 1,28 45. DARL D-Arabitol 1,4 46. LARL L-Arabitol 1,4 47. GNT Potassium Gluconate 1,84 48. 2KG Potassium 2-KetoGluconate 2,12 49. 5KG Potassium 5-KetoGluconate 1,8 -
- Cách tiến hành:
+ Từđĩa thạch cấy ria chọn một khuẩn lạc to, riêng rẻ, đặc trưng cho vào môi trường nuôi cấy tương ứng
+ Cho khuẩn lạc vào môi trường API 50CH/E, trộn bằng máy vortex cho khuẩn lạc tan đều trong môi trường đem đi đo độ đục bằng máy Densitometer sao cho độ đục McF = 2
+ Hút dịch và lần lược bơm vào tất cả 50 test đến vạch đầu tiên của tube + Tiếp tục bơm dầu khoáng vô trùng đầy tube cho tất cả 50 test
+ Nuôi trong tủ ấm 37oC sau mỗi 24 tiếng, 48 tiếng, đối chiếu để kiểm tra và
đọc kết quả dựa trên sự thay đổi màu của môi trường trong các giếng.
2.3.4. Kĩ thuật tách chiết DNA tổng số
Từđĩa thạch cấy ria (hoặc cấy trang), ta chọn một khuẩn lạc riêng lẻ chuyển vào bình tam giác chứa 20 ml môi trường TSB (đã được khử), đem nuôi lắc qua
đêm ở nhiệt độ phòng, 180 vòng/phút. Thu sinh khối và tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn bằng bộ kít tách chiết DNA bộ gen Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega, Mỹ). DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trong đệm TBE 0.5X dưới nguồn điện 110V để đọc kết quả, DNA được tách chiết thành công sẽđược bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các phản
ứng PCR tiếp theo.
- Các bước tiến hành tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA
Purification System:
+ Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng.
+ Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ phần dịch nổi bên trên, rửa cặn tế
bào 1 lần bằng đệm TE 1X rồi ly tâm 13000 vòng trong 2 phút như trên để loại bỏ
phần dịch nổi.
Thành phần Thể tích (µl)
Nuclei lysic solution 200
EDTA 0,5 M (pH 8,0) 50
Protease K 20 mg/ml 20
Rnase A 4 mg/ml 5
Tổng 275
+ Ủống mẫu trên các block nhiệt ở 55oC trong 1 giờ.
+ Thêm 250 µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống, sau đó
đem trộn nhẹ.
+ Ly tâm nhẹ, thu phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1,5 ml).
+ Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ dịch thu được.
+ Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mới. + Thêm vào 650 µl dung dịch rửa (Wizard SV Wash Solution).
+ Ly tâm 13000 vòng 2 phút, loại bỏ phần dung dịch rửa thu được. + Lặp lại bước rửa này thêm 1 lần nữa.
+ Chuyển cột Wizard SV minicolumn sang một Eppendorf 1,5 ml mới. + Thêm vào 100 µl dung dịch đệm TE 1X, ly tâm ở 13000 vòng trong 2 phút. + Cột Wizard SV Minicolumn được loại bỏ thu được dung dịch DNA.
+ Dịch chiết DNA được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
2.3.5. Kĩ thuật PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA và rpoB
Các bước tiến hành
Phản ứng PCR nhân đoạn gen rpoB
+ Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng PCR này là CM7 và CM31b (Mollet et al., 1997) được thiết lập cách nhau 1090bp trong gen rpoB. Trình tự của 2 mồi như sau:
Mồi xuôi CM7: 5’-AACCAGTTCCGCGTTGGCCTGG-3’ (22 nu). Mồi ngược CM31b: 5’-CCTGAACAACACGCTCGGA-3’ (19 nu). + Thành phần phản ứng PCR (cho 50 µl phản ứng)
Thành phần Thể tích (µl) H20 đã khử ion MgCl2 25 mM dNTPs 10 mM Mồi xuôi CM7 Mồi ngược CM31b Taq Buffer 10X Taq DNA polymerase DNA 24,75 10 4 2 2 5 0,25 2 + Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Taq (1X).
+ Chu trình nhiệt
▪ Giai đoạn 1: 94oC trong 3 phút
▪ Giai đoạn 2: 94oC trong 30 giây 52oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 20 giây Lặp lại 35 chu kỳ ▪ Giai đoạn 3: 72oC trong 7 phút. ▪ Giai đoạn 4: Giữở 24oC. + Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi CM7 và CM31b
Để tiến hành khảo sát nhiệt độ tối ưu nhất cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen rpoB chúng tôi thực hiện các phản ứng PCR các điều của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất, còn nhiệt độ bắt cặp của mồi sẽ tiến hành khảo sát trên một gradient nhiệt độ từ 50oC đến 62oC. Dựa trên phân tích kết quả điện di chúng tôi sẽ lựa chọn ra nhiệt độ tối ưu nhất cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen rpoB.
Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rDNA
+ Cặp mồi 16S-27F và 16S-1492R (Luan et al., 2007) được sử dụng cho phản
ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA này (IDT, Mỹ) có trình tự như sau: Mồi xuôi 16S-27F: 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (20 nu)
+ Thành phần của phản ứng PCR (cho 50 µl phản ứng) Thành phần Thể tích (µl) H20 đã khử ion MgCl2 25 mM dNTPs 10 mM Mồi xuôi 16s-27F Mồi ngược 16s-1492R Taq Buffer 10X Taq DNA polymerase
DNA 24,75 10 4 2 2 5 0,25 2 + Chu trình nhiệt ▪ Giai đoạn 1: 95oC trong 5 phút ▪ Giai đoạn 2: 95oC trong 1 phút 62oC trong 1 phút 72oC trong 1 phút 30 giây Lặp lại 35 chu kỳ ▪ Giai đoạn 3: 72oC trong 7 phút. ▪ Giai đoạn 4: Giữở 24oC. + Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi 16S-27F và 16S-1492R
Tương tự như việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu của phản ứng PCR cho
đoạn gen rpoB. Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu trên một gradient nhiệt độ từ 55oC đến 65oC các thành phần và các điều kiện khác sẽ được