Nguyên tắc chung:
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử tích điện âm khác nhau về kích thước, điện tích, mức
mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di dưới tác dụng của
điện trường. Các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển trên điện trường nhanh hơn và ngược lại vì vậy ta có thể phân tách được từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ.
Các nucleic acid trong gel agarose sẽ được phát hiện dưới tia tử ngoại UV nhờ ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ = 300 nm) sẽ phát huỳnh quang và quan sát sẽ thấy các vạch đỏ màu cam. Mỗi một băng điện di phản ánh một tập hợp các phân tử
DNA có cùng kích thước.
Các bước tiến hành:
- Cân 0,48 g agarose và thêm vào 40 ml đệm TBE 0,5X (gel agarose 1,2 %) vào trong bình tam giác 100 ml, đun cách thủy đến lúc gel tan hoàn toàn. - Sau đó để nguội khoảng 50oC, thêm 3µl ethidium bromide 10 mg/ml vào
gel, lắc đều bình.
- Khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40 – 45oC, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược. - Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra.
- Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm TBE 0,5X cho đến khi ngập bản gel. - Trộn đều 10 µl mẫu DNA tách chiết với 2µl chất nhuộm tải mẫu (loading
dye 6X), tra mẫu lần lượt vào các giếng. Giếng đầu tiên tra marker 1kp. - Tiến hành chạy điện di với nguồn 120 V, đến lúc DNA chạy được 2/3 bản
gel thì dừng lại.
- Đọc kết quả trên máy chụp và phân tích hình ảnh gel.