Sử dụng trình tựđoạn gen 16S rDNA của 5 chủng đã giải trình tự trên cùng với các chủng chuẩn của 4 loài Proteus đã biết, chúng tôi tiến hành xây xựng cây phát sinh loài (Hình 3.6). Kết quả từ cây phân loài cho thấy:
+ 2 chủng CT1.1, G1 có trình tự giống nhau nên chỉ chọn 1 chủng để xây dựng cây phát sinh loài.
+ 4 chủng N1.4, B3.7A, CT1.1, và G1 được phân tách rõ ràng với các chủng chuẩn của 4 loài Proteus đã biết, cho nên có thể chúng là các loài mới.
+ Chủng B3.10B cùng nhánh với P. mirabilis nên có thể chủng này thuộc loài P. mirabilis.
Bảng 3.13: So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài trong chi Proteus
Độ tương đồng (%)
Mã số gen Chủng vi khuẩn
B3.7A B3.10B CT1.1 G1 N1.4
JF430797 Proteus mirabilis ATCC 29906 98,8 99,8 98,8 98,8 98,8 DQ836272 Proteus penneri ATCC
33519 99,3 99,4 98,7 98,7 98,7
DQ836273 Proteus vulgaris ATCC 29905 99,1 99,4 99,1 99,1 99,0 DQ836271 Proteus hauseri ATCC 13315 98,8 98,6 99,1 99,1 98,6
Hình 3.6: Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của 5 chủng thí nghiệm và các chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi
Proteus
Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp Neighbor Joining. Mã số Genbank
được chỉ ra trong ngoặc đơn. Đơn vị khoảng cách tiến hóa được thể hiện bằng thanh ngang. Chỉ số
bootstrap ≥ 50% được chỉ ra trên các nhánh. Providencia stuartii ATCC 29914 được sử dụng làm
nhóm ngoại.
Sử dụng trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng đã giải trình tự trên cùng với các chủng chuẩn của 4 loài Proteus đã biết, chúng tôi tiến hành xây xựng cây phát sinh loài (Hình 3.7).
Bảng 3.14: So sánh trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn của các loài trong chi Proteus
Độ tương đồng (%)
Mã số gen Chủng vi khuẩn
B3.7A B3.10B CT1.1 G1 N1.4
JF430797 Proteus mirabilis ATCC 29906 92,9 99,5 93,4 94,6 99,2 DQ836272 Proteus penneri ATCC
33519 98,1 93,8 98,2 98,2 93,5
DQ836273 Proteus vulgaris ATCC 29905 97,8 93,2 96,6 96,6 92,8 DQ836271 Proteus hauseri ATCC
Hình 3.7: Cây phát sinh loài dựa trên trình tự đoạn gen rpoB của 5 chủng thí nghiệm và 4 chủng chuẩn (type strain) của các loài trong chi Proteus
Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor Joining. Mã số Genbank được chỉ ra trong ngoặc đơn. Đơn vị khoảng cách tiến hóa được thể hiện bằng thanh ngang. Chỉ số bootstrap ≥
50% được chỉ ra trên các nhánh. Providencia stuartii ATCC 29914 được sử dụng làm nhóm ngoại.
Kết quả từ cây phát sinh loài từ giải trình tự gen rpoB của 5 chủng nghiên cứu có khác so với cây cây phát sinh loài cho thấy:
+ 2 chủng CT1.1, G1 có trình tự gen rpoB chỉ khác nhau 1 nucleotide.
+ 3 chủng CT1.1, G1 và B3.7A được phân tách rõ ràng với các chủng chuẩn của 4 loài Proteus đã biết, cho nên có thể chúng là các loài mới.
Bảng 3.15: Đánh giá chung về định danh 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu
Loài gần nhất Chủng đoạn gen 16S Dựa trên
rDNA (% tỉ lệ tương đồng) Dựa trên đoạn gen rpoB (% tỉ lệ tương đồng) Dựa trên đặc
điểm hóa sinh
(đặc điểm khác biệt)
Kết luận
B3.7A P. penneri (99,3) P. penneri (98,1)
P. penneri (esculin, trehelose, indol) Có thể là Proteus penneri hoặc một loài mới gần gũi với loài này B3.10B P. mirabilis (99,8) P. mirabilis (99,5) P. mirabilis (sản xuất acetoin) P. mirabilis CT1.1 P. hauseri (99,1) P. vulgaris (99,1) P. penneri (98,2) P. vulgaris (96,6) Proteus genomospecies 4 Có thể là P. vulgaris, P. penneri hoặc một loài mới gần gũi với 2 loài này. G1 P. hauseri (99,1) P. vulgaris (99,1) P. penneri (98,2) P. vulgaris (96,6) Proteus genomospecies 4 Có thể là P. vulgaris, P. penneri hoặc một loài mới gần gũi với 2 loài này. N1.4 P. vulgaris (99,0) P. mirabilis (99,2) P. vulgaris (mannitol, saccharose, trehelose, indol) Có thể là P. vulgaris, P. mirabilis, hoặc một loài mới gần gũi với 2 loài này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết Luận
- Chủng B3.10B thuộc loài Proteus mirabilis (tương đồng 99,8% về trình
tự gen 16S rDNA, 99,5% về trình tự gen rpoB).
- Chủng B3.7A có thể là loài mới, trong đó trình tự gen có độ tương đồng cao nhất với loài Proteus penneri (tương đồng 99,3% về trình tự gen 16S rDNA, 98,1% về trình tự gen rpoB) và sai khác 3 đặc điểm hóa sinh
(esculin, trehelose, indol).
- Chủng CT1.1 và chủng G1 thuộc cùng một loài, có thể thuộc loài
Proteus genomospecies 4 (chưa được đặt tên), trong đó trình tự gen có độ tương đồng cao nhất với chủng chuẩn của Proteus vulgaris (tương
đồng 99,1% về trình tự gen 16S rDNA, 96,6% về trình tự gen rpoB) và chủng chuẩn của Proteus penneri (tương đồng98,7% về trình tự gen 16S rDNA, 96,6% về trình tự gen rpoB) và đặc điểm hóa sinh giống với
Proteus genomospecies 4.
- Chủng N1.4 có thể là loài mới, trong đó có độ tương đồng cao với chủng chuẩn của Proteus mirabilis (98,8 % về trình tự gen 16S rDNA, 99,2% về trình tự gen rpoB) và sai khác 5 đặc điểm hóa sinh (arbutin, esculin,
saclicin, decacboxyl từ orbiithine và sản xuất acetoin), với chủng chuẩn của Proteus vulgaris (99,0% về trình tự gen 16S rDNA, 92,8% về trình tự gen rpoB) và sai khác 4 đặc điểm hóa sinh (mannitol, saccharose,
trehelose, indol) với Proteus vulgaris .
Kiến nghị
- Cần có những nghiên cứu sâu hơn như sử dụng phương pháp lai DNA- DNA, phổ mẫn cảm với kháng sinh, điện di Protein, xác định tỉ lệ phần trăm (G + C) trong DNA, … để định danh tới loài hoặc mô tả loài mới đối với các chủng B3.7A, CT1.1, G1 và N1.4.
- Cần có những nghiên cứu sâu hơn về khả năng gây bệnh của các chủng quan tâm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB giáo dục, Hà Nội, 300tr.
2. Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Thị Hải Thanh (2012), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ ruột cá chim vây vàng”, Tạp chí Công nghệ
sinh học 10(4A): 1045-1053,
3. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2008). Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, 152tr.
4. Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm
và mĩ phẩm, NXB Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh, 230tr.
Tài liệu tiếng Anh
5. Anderson R L and Engley F. B (1978). "Typing methods for Proteus rettgeri: comparison of biotype, antibiograms, serotype, and bacteriocin
production." Journal of Clinical Microbiology, 8(6): 715-24.
6. Case R. J, Boucher Y, Dahllof I, Holmstom C, Doolittle W. F, Kjelleberg S (2006), “Use of 16S rRNA and rpoB Genes as Molecular marker for
microbial ecology studies”, Applied and Environmetal Microbiology, 72(1): 278-288.
7. Giammanco G, Pignato S, Grimont P. A. D, Grimont F, Giammanco GiM, “Genotyping of the genus Proteus by rpoB sequence analysis”, Italian Journal of public health.
8. Giovanni M. Giammanco, Grimont P. A. D, Grimont F, Lefevre M, Giammanco G and Pignato S (2011), Phylogenetic analysis of the genera
Proteus, Morganella and Providencia by comparison of rpoB gene
sequences of type and clinical strains suggests the reclassification of Proteus
comb. Nov, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 61:1638–1644.
9. Hickman F. W, Steigerwalt A. G, Farmer III J. J, Brenner D. J (1982), “Identification of Proteus penneri sp. Nov, formerly known as Proteus
vulgaris Indol negative or as Proteus vulgaris Biogroup1”, Journal of
Clinical Microbiology,15(6):1097-1102.
10. Janda J. M, Abbott S. L. Microbiol J. C (2002), “Bacterial identification for publication when is Enough Enough?”, Journal of Clinical Microbiology, :
40(6): 1887-1891.
11. Janda J. M, Abbott S. L, Khashe S, Probert W (2001), “Biochemical
Identification and Characterization of DNA Groups within the Proteus vulgaris Complex”, Journal of Clinical Microbiology, 39(4): 1231-1234.
12. Janak Kishore (2010), “Isolation, identification & characterization of Proteus
penneri – a missed rare pathogen”, Department of microbiology, Sanjay Gandhi Post-Graduate institute of Medical Sciences: 341-345.
13. Jesaitis M. A. (1970). "The nature of colicin K from Proteus mirabilis."
Journal of Experimental Medicine, 131(5): 1016-38.
14. Kusek J. W and Herman L. G (1981). "Comparison of epidemiological methods for differentiation of Proteus mirabilis." American Society for Medical Technology, 47(10): 835-40.
15. Liu v, Li Lv, Khan Md. A, Zhu . (2013), “Popular mocular markers in bacteria”, Molecular Genetics, Microbilogy and Virology, 27(3): 103-107. 16.Mollet C, Drancourt M, Raoult D (1997), “rpoB sequence analysis as a novel
basis for bacterial identification”, Molecular Microbiology, 25(5): 1005-
1011.
17.Manos J, Belas R (2006), “The genera Proteus, Providencia, and Morganella”, Prokaryote_chapter 3.3.12, 6:245–269.
18.Nguyen Van Duy, Nguyen Thi Hai Thanh, Le Phuong Chung, Pham Thu Thuy (2012), “Isolation, screening and characterization of marine
bacteriocin-producing bacteria for the development of potential drugs in aquaculture”, Kỷ yếu Hội nghị Quốc tế “biển Đông 2012”
19. Nguyen Van Duy, Pham Thu Thuy (2012), “Phylogenetic diversity of 16S rDNA genes in beneficial and pathogenic bacteria isolated from marine animals in Viet Nam”, Tạp chí công nghệ sinh học 10(4A):803-813.
20.O'Hara C. M, Brenner F. W. and Miller J. M. (2000), “Classification, Identification, and Clinical Significance of Proteus, Providencia, and Morganella”, Clinical Microbiology Reviews,13:534-546.
21.Prakash O, Verma M, Sharma P, Kumar M, Kumari K, Singh A, Kumari H, Jit S, Gupta S. K, Khanna M, Lal R, (June 2007), “Polyphasic approach of bacterial classification – An overview recent advances”, Indian Journal of
Microbiology, 98–108.
22. Pauprich O, Matsushita M, Weijer C. J, Siegert F, Esipov S. E. and Shapiro
J. A. (1996), “Periodic Phenomena in Proteus mirabilis Swarm Colony Development”, Journal of Bacteriology, 178(22): 6525-6538.
23. Pearson M. M, Sebaihia M, Churchuer C, Quail M. A, Seshasayee A. S, Luscombe N. M, Abdellah Z, Arrosmith C, Atkin B, Chillingworth T, Hauser H, Jagels K, Moule S, Mungall K. Norbertczak H, Rabbinowitsch E, Walker D, Whithead S, Thomson N. R, Rather P. N, Parkhill J, and Mobley H. T. (2008), “Complete Genome Sequence of Uropathogenic Proteus mirabilis, a Master of both Adherence and Motility”, Journal of clinical Microbiology, 190(11): 4027-4037.
24.Pham Thu Thuy, Nguyen Van Duy (2012), “Bacteriocin production by
Proteus sp. Isolated from the intestine of cobia (Rachycentron canaudm), Tạp chí công nghệ sinh học 10(4A): 793-801.
25.Rybal'chenko O. V, Bomdarenko V. M. (2006). "Antagonistic effect of bacteriocinogenic Lactobacillus acidophilus on Klebsiella pneumoniae,
Citrobacter freundii and Proteus mirabilis cells" Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, (7): 8-11.
26. Pignato S, Giammanco G. M, Grimont F, Grimont P. A. D. and Giammanco
G (1999), “Molecular Characterization of the Genera Proteus, Morganella,
and Providencia by Ribotyping”, Journal of Clinical Microbiology, 37(9):
2840-2847.
27. Senior, B. W. and G. Sweeney (1984). "The association of particular types of
Proteus with chronic suppurative otitis media." Journal of Experimental Medicine, 17(2): 201-5.
28.Smit, J. A, N. Hugo, (1969). "A receptor for a Proteus vulgaris bacteriocin."
Journal of General Virology,5(1): 33-7.
29.Tamura, K, Peterson, D, Peterson, N, Stecher, G, Nei, M. and Kumar, (2011), "MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using Maximum Likelihood, evolutionary distance, and Maximum Parsimony methods",
PHỤ LỤC
PL 1: Kết quả Api 50CH vÀ Api 20E của 5 chủng Proteus nghiên cứu PL1.1: Kết quả Api 20E cho 5 chủng
B3.7A
B3.10B
CT1.1
G1
PL 1.2: Kết quả Api 50CH của 5 chủng nghiên cứu