Từđĩa thạch cấy ria (hoặc cấy trang), ta chọn một khuẩn lạc riêng lẻ chuyển vào bình tam giác chứa 20 ml môi trường TSB (đã được khử), đem nuôi lắc qua
đêm ở nhiệt độ phòng, 180 vòng/phút. Thu sinh khối và tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn bằng bộ kít tách chiết DNA bộ gen Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega, Mỹ). DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trong đệm TBE 0.5X dưới nguồn điện 110V để đọc kết quả, DNA được tách chiết thành công sẽđược bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các phản
ứng PCR tiếp theo.
- Các bước tiến hành tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA
Purification System:
+ Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng.
+ Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ phần dịch nổi bên trên, rửa cặn tế
bào 1 lần bằng đệm TE 1X rồi ly tâm 13000 vòng trong 2 phút như trên để loại bỏ
phần dịch nổi.
Thành phần Thể tích (µl)
Nuclei lysic solution 200
EDTA 0,5 M (pH 8,0) 50
Protease K 20 mg/ml 20
Rnase A 4 mg/ml 5
Tổng 275
+ Ủống mẫu trên các block nhiệt ở 55oC trong 1 giờ.
+ Thêm 250 µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống, sau đó
đem trộn nhẹ.
+ Ly tâm nhẹ, thu phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1,5 ml).
+ Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ dịch thu được.
+ Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mới. + Thêm vào 650 µl dung dịch rửa (Wizard SV Wash Solution).
+ Ly tâm 13000 vòng 2 phút, loại bỏ phần dung dịch rửa thu được. + Lặp lại bước rửa này thêm 1 lần nữa.
+ Chuyển cột Wizard SV minicolumn sang một Eppendorf 1,5 ml mới. + Thêm vào 100 µl dung dịch đệm TE 1X, ly tâm ở 13000 vòng trong 2 phút. + Cột Wizard SV Minicolumn được loại bỏ thu được dung dịch DNA.
+ Dịch chiết DNA được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.