Nuôi cấy vi khuẩn
Mỗi loại vi khuẩn khác nhau có điều kiện sinh trưởng và phát triển khác nhau vì thế cần nghiên cứu thật kĩ về vi khuẩn đó trước khi tiến hành nuôi cấy để đảm bảo điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho vi khuẩn đó sinh trưởng và phát triển tốt nhất,
đảm bảo tiết kiệm được thời gian, chi phí, hiệu quả nghiên cứu. Proteus thuộc loại vi khuẩn kị khí tùy ý, chúng sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37oC.
- Cách tiến hành:
+ Ống giống gốc cần được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh bằng cách đưa ngay vào tủấm 37oC trong 40-60 giây.
+ Dùng pipet hút dịch từ trong eppendorf vào bình tam giác chứa môi trường
đã được khử trùng.
Hình 2.1: Sơ đồ cách tiếp cận tổng quát của đề tài
Bảo quản vi khuẩn Nuôi lỏng trong môi
trường TSB Chọn khuẩn lạc đơn, đặc trưng Thử nghiệm API 20E Thử nghiệm API 50CH Tách chiết DNA Điện di kiểm tra kết quả Giải trình tự, phân tích trình tự
Xây dựng cây phân loại Chủng vi khuẩn Hoạt hóa Cấy truyền Cấy ria/Cấy trang Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rpoB
Môi trường NaCl 0,85% (API,Biomeriex)
Môi trường 50 CHB/E
+ Đối với môi trường TSA sau khi hấp khử trùng để nguội khoảng 45 – 50oC thì đổ đĩa, đợi môi trường thạch đông lại thì tiến hành cấy vi khuẩn (bằng phương pháp cây trang hoặc cấy ria để kiểm tra tạp nhiễm hoặc để tạo khuẩn lạc đơn). Nuôi vi khuẩn bằng cách để trong tủấm 37oC từ 18- 24 giờ.
Bảo quản vi khuẩn
Có nhiều phương pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau như cấy truyền định kỳ
lên môi trường mới, phương pháp lạnh đông, phương pháp đông khô, phương pháp bảo quản bằng nitơ lỏng…Thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một hoặc một vài phương pháp bảo quản nhất định. Và tùy theo mục đích sử
dụng, loại vi sinh vật cần bảo quản, thời gian bảo quản và điều kiện kinh tế, cơ sở
vật chất mà ta lựa chọn phương pháp bảo quản thích hợp nhất.
Do điều kiện cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm và điều kiện nghiên cứu làm thí nghiệm chúng tôi sử dụng phương pháp bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ - 67oC. Với phương pháp này tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu do việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể
nước đá trong tế bào, vì thếđể khắc phục nhược điểm này người ta thường bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide), ở đây cụ thể chúng tôi sử dụng glycerol bổ sung vào sao cho dịch đem đi bảo quản có nồng độ cuối glycerol là 30%.
- Cách tiến hành:
Dịch vi khuẩn sau khi hoạt hóa qua đêm được cấy truyền sang môi trường TSB đem nuôi lắc 180 vòng/phút trong thời gian 3 tiếng sau đó tiến hành bảo quản vi khuẩn. Dùng pipet pauster hút 300 µl glycerol cho vào eppendorf 1.5 ml sau đó hút 700 µl dịch vi khuẩn trên cho vào eppendorf trên, mix đều cho glycerol trộn đều với dịch vi khuẩn. Ghi tên chủng, ngày, tháng tiến hành bảo quản lên trên eppendorf sau đó cho vào trong túi đem bảo quản trong tủ lạnh -67oC. Chú ý đầu tuýp, eppendorf, glycerol phải được hấp khử trùng 121oC trong 15 phút để tránh tạp nhiễm.