Định danh và phân loại một số loài cá nước ngọt phổ biến ở đồng bằng sông Cửu Long dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

---o0o--- THÁI THỊ LAN PHƯƠNG ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ NƯỚC NGỌT PHỔ BIẾN Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chu

-o0o -

THÁI THỊ LAN PHƯƠNG

ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ NƯỚC NGỌT PHỔ BIẾN Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG DỰA TRÊN

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nha Trang, tháng 06 năm 2014

-o0o -

THÁI THỊ LAN PHƯƠNG

ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ NƯỚC NGỌT PHỔ BIẾN Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG DỰA TRÊN

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ

sở vật chất cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Đặc biệt em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới ThS Vũ Đặng Hạ Quyên và TS Đặng Thúy Bình đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đồ án

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học

đã giảng dạy, cung cấp kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập 4 năm qua

Cảm ơn đề tài nghiên cứu "Di truyền học bảo tồn ứng dụng trong đa dạng sinh học và nâng cao quản lý tài nguyên Đồng bằng sông Cửu Long" thuộc dự án PEER (USAID và NSF tài trợ) đã cung cấp kinh phí và hỗ trợ thực hiện nghiên cứu này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân đã quan tâm, hỗ trợ và động viên để em làm tốt đồ án

Trong quá trình thực hiện không thể nào tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo để đồ án được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày tháng năm 2014

Thái Thị Lan Phương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 4

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học cá sông Mekong trong và ngoài nước 7

1.3 Kỹ thuật di truyền ứng dụng trong đa dạng sinh học cá 10

1.3.1 Hệ gen ty thể và hệ gen nhân 10

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền mã vạch DNA barcoding 13

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu 16

2.2 Sơ đồ nghiên cứu 17

2.3 Phân loại hình thái 18

2.4 Nghiên cứu di truyền cá ĐBSCL 20

2.4.1 Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự 20

2.4.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại 22

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Phân loại hình thái 27

3.1.1 Thành phần loài các loài cá nước ngọt phổ biến thu tại ĐBSCL, Việt Nam 27

3.1.2 Đặc điểm hình thái các loài cá nước ngọt phổ biến thu tại ĐBSCL,Việt Nam 31

3.2 Nghiên cứu di truyền các loài cá nước ngọt phổ biến ở ĐBSCL 76

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 76

3.2.2 Khuếch đại, giải trình tự DNA cá nước ngọt ĐBSCL 76

3.2.3 So sánh khác biệt trình tự giữa các loài cá nghiên cứu 77

3.2.4 So sánh sự tương đồng trình tự với Genbank 80

3.2.5 Xây dựng cây phát sinh loài cá nước ngọt ĐBSCL 82

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87

4.1 Kết luận 87

4.2 Kiến nghị 88

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

PHỤ LỤC

DNA Deoxyribonucleic acid

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

mt DNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

tRNA Transfer ribonucleic acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá nước ngọt 22 Bảng 3.1 – Danh sách các loài cá nước ngọt phổ biến thu tại ĐBSCL, Việt Nam 27 Bảng 3.2 – Chỉ tiêu hình thái của các loài cá nước ngọt phổ biến ở ĐBSCL 29 Bảng 3.3 – Sự khác biệt về trình tự 16S mt DNA của 22 loài cá nước ngọt phổ biến

ở ĐBSCL 79 Bảng 3.4 – Kết quả độ tương đồng của các trình tự 16S mt DNA từ 22 loài cá thu tại ĐBSCL, Việt Nam với dữ liệu từ Genbank 80

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 – Lưu vực sông Mekong 4

Hình 1.2 – Đồng bằng sông Cửu Long (Albers và cs, 2013) 5

Hình 1.3 – DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein 11

Hình 2.1 – Các địa điểm thu mẫu cá trên địa bàn ĐBSCL(đánh dấu màu đỏ) 16

Hình 2.2 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 17

Hình 2.3 – Một số bộ phận của bộ cá xương 18

Hình 2.4 – Các chỉ số đo trong phân loại cá 19

Hình 2.5 – Các chỉ số đếm trong phân loại cá 20

Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 21

Hình 3.1 - Tỷ lệ (%) số lượng các họ, giống, loài trong thành phần cá nước ngọt thu tại ĐBSCL, Việt Nam 28

Hình 3.2a – Hình dáng cá chạch lấu Mastacembelus favus 31

Hình 3.2b – Đặc điểm hình thái cá chạch lấu Mastacembelus favus……… 32

Hình 3.3a – Hình dáng cá heo rừng Syncrossus helodes 33

Hình 3.3b – Đặc điểm hình thái cá heo rừng Syncrossus helodes 34

Hình 3.4a – Hình dáng cá heo vạch Yasuhikotakia modesta 35

Hình 3.4b – Đặc điểm hình thái cá heo vạch Yasuhikotaka modesta 36

Hình 3.5a – Hình dáng cá khoai sông Acantopsis sp 37

Hình 3.5b – Đặc điểm hình thái cá khoai sông Acantopsis sp 38

Hình 3.6a – Hình dáng cá linh Henicorhynchus lobatus 39

Hình 3.6b – Đặc điểm hình thái cá linh Henicorhynchus lobatus 40

Hình 3.7a – Hình dáng cá thiểu mẫu Paralaubuca typus 41

Hình 3.7b – Đặc điểm hình thái cá thiểu mẫu Paralaubuca typus 42

Hình 3.8a – Hình dáng cá bơn phên Cynoglossus feldmanni 43

Hình 3.8b – Đặc điểm hình thái cá bơn phên Cynoglossus feldmanni 44

Hình 3.9a – Hình dáng cá bơn lưỡi mèo Brachirus panoides 45

Hình 3.9b – Đặc điểm hình thái cá bơn lưỡi mèo Brachirus panoides 46

Hình 3.10a – Hình dáng cá thát lát Notopterus notopterus 47

Hình 3.10b – Đặc điểm hình thái cá thát lát Notopterus notopterus 48

Hình 3.11a – Hình dáng cá mang rổ Toxotes chatareus 49

Hình 3.11b – Đặc điểm hình thái cá mang rổ Toxotes chatareus 50

Hình 3.12a – Hình dáng cá sặc rằn Trichopodus pectoralis 51

Hình 3.12b – Đặc điểm hình thái cá sặc rằn Trichopodus pectoralis 52

Hình 3.13a – Hình dáng cá sặc chấm Trichopodus trichopterus 53

Hình 3.13b – Đặc điểm hình thái cá sặc chấm Trichopodus trichopterus 54

Hình 3.14a – Hình dáng cá sặc điệp Trichopodus microlepis 56

Hình 3.14b – Đặc điểm hình thái cá sặc điệp Trichopodus microlepis 56

Hình 3.15a – Hình dáng cá hường vện Datnioides polota 58

Hình 3.15b – Đặc điểm hình thái cá hường vện Datnioides polota 59

Hình 3.16a – Hình dáng cá rô biển Pristolepis fasciata 60

Hình 3.16b – Đặc điểm hình thái cá rô biển Pristolepis fasciata 61

Hình 3.17a – Hình dáng cá chốt sọc mitti Mystus mysticetus 62

Hình 3.17b – Đặc điểm hình thái cá chốt sọc mitti Mystus mysticetus 63

Hình 3.18a – Hình dáng cá trèn bầu Ompok bimaculatus 64

Hình 3.18b – Đặc điểm hình thái cá trèn bầu Ompok bimaculatus 65

Hình 3.19a – Hình dáng cá bông lau Pangasius krempfi 66

Hình 3.19b – Đặc điểm hình thái cá bông lau Pangasius krempfi 67

Hình 3.20a – Hình dáng cá sát sọc Pangasius macronema 68

Hình 3.20b – Đặc điểm hình thái cá sát sọc Pangasius macronema 69

Hình 3.21a – Hình dáng cá Pangasius sp 71

Hình 3.21b – Đặc điểm hình thái cá Pangasius sp.……… 71

Hình 3.22a – Hình dáng cá cơm trích Clupeoides borneensis 72

Hình 3.22b – Đặc điểm hình thái cá cơm trích Clupeoides borneensis 73

Hình 3.23a – Hình dáng cá lòng tong Coilia rebentischii……… 74

Hình 3.23b – Đặc điểm hình thái cá lòng tong Coilia rebentischii 75

Hình 3.24 – Kết quả điện di DNA tổng số một số mẫu cá nước ngọt ĐBSCL 76

Hình 3.25 – Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA mẫu cá ĐBSCL 77

Hình 3.26 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Maximum Neighbor – Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen 16S mt DNA của các loài cá thu tại ĐBSCL, Việt Nam 83

MỞ ĐẦU

Nằm ở hạ lưu sông Mekong, Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có tổng diện tích là 40.553,1 km2 (Tổng cục Thống kê, 2012) Với hệ thống sông ngòi dày đặc, các loại hình thủy vực khác nhau như sông, kênh rạch, vùng cửa sông, rừng ngập mặn và bãi bồi ven biển, ĐBSCL có điều kiện thuận lợi phát triển nền nông nghiệp trồng lúa và khai thác, nuôi trồng thủy hải sản Mức độ đa dạng của các loài

cá nước ngọt ở khu vực này cao (Nguyễn Văn Hảo, 2005a, 2005b), chủ yếu là các loài cá có nguồn gốc từ thượng nguồn sông Mekong đổ về (Campell, 2009)

Tuy nhiên, sự đa dạng sinh học ở ĐBSCL đang phải đối mặt với những thách thức từ bùng nổ dân số, sự khai thác quá mức (Kỷ Quang Vinh, 2012; Campell, 2012), xây dựng đập (MRC, 2010) và biến đổi khí hậu (Kỷ Quang Vinh, 2012) Áp lực của việc gia tăng dân số đòi hỏi đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của con người đối với các nguồn tài nguyên thiên nhiên, đặc biệt là đất nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản, làm giảm đáng kể mức độ sinh cảnh tự nhiên và bán tự nhiên ở vùng đồng bằng (Campell, 2012) Theo Tổng cục thủy sản (2012), sản lượng thủy sản giảm từ 24,8% xuống chỉ còn 21,9 % năm 2010, thể hiện được sự suy giảm nguồn lợi thuỷ sản và tác động đến mức độ đa dạng sinh học trong khu vực Theo bản Đánh giá môi trường chiến lược của Ủy hội sông Mekong (MRC, 2010), việc 11 con đập dự kiến được xây dựng trên sông Mekong, đoạn chảy qua Lào, Campuchia, Thái Lan

và Việt Nam sẽ ngăn chặn sự di cư của cá sông Mekong và thay đổi môi trường sống tự nhiên của chúng Nguồn lợi cá sông Mekong sẽ bị suy giảm ước tính từ 26% đến 42%, hơn 100 loài sẽ có nguy cơ tuyệt chủng (MRC, 2010)

Nhiều nghiên cứu về đa dạng sinh học các loài cá nước ngọt ở Việt Nam đã được tiến hành với phương pháp phân loại truyền thống là dựa trên đặc điểm hình thái (Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân, 2001; Nguyễn Văn Hảo, 2005a, 2005b) Đa dạng sinh học các loài cá nước ngọt ở ĐBSCL có các nghiên cứu của Mai Đình Yên

và cs (1992); Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993); Trần Đắc Định và

cs (2013) Tuy nhiên, đặc điểm hình thái dưới tác động của môi trường và biến dị cá

thể có thể gây nhầm lẫn trong công tác phân loại Mặc dù sở hữu sự đa dạng sinh học cao về nguồn lợi cá nước ngọt nhưng chưa có công bố nào về dữ liệu di truyền

mã vạch (DNA barcoding) của cá nước ngọt ĐBSCL

Kỹ thuật di truyền mã vạch DNA – barcoding (Floyd và cs, 2002; Hebert và cs, 2003a) là kỹ thuật phân tích một đoạn ngắn của hệ gen, sử dụng một cặp mồi chung

để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, rồi dựa trên dữ liệu di truyền thu được để xác định các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định đa dạng sinh học và biến động di truyền của sinh vật (Hebert và cs, 2003a , 2003b; Tautz và cs, 2003) Hiện nay, việc phân tích di truyền mã vạch là một lựa chọn hiệu quả vì chi phí thấp và ứng dụng được cho nhiều đối tượng sinh vật (Hajibabaei và cs, 2005)

Nhận thấy bảo tồn nguồn lợi và đa dạng sinh học tại khu vực ĐBSCL là một

trong những yếu tố then chốt của sự phát triển bền vững, đề tài “Định danh và phân loại một số loài cá nước ngọt phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền” được thực hiện nhằm cung cấp dẫn liệu về

hình thái và di truyền của một số loài cá nước ngọt ĐBSCL, làm cơ sở cho các nghiên cứu đánh giá đa dạng sinh học bằng việc xây dựng mã vạch DNA (DNA barcoding) Đề tài nằm trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu “Di truyền học bảo tồn ứng dụng trong đa dạng sinh học và nâng cao quản lý tài nguyên Đồng bằng sông Cửu Long” thuộc dự án PEER (USAID và NSF tài trợ ) do Tiến sĩ Đặng Thúy Bình (Đại học Nha Trang) chủ trì

Mục tiêu của đề tài

Đề tài ứng dụng kỹ thuật di truyền DNA barcoding với chỉ thị 16S của DNA

ty thể (16S mtDNA) để xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cá nước ngọt ĐBSCL, Việt Nam, đồng thời mô tả đặc điểm hình thái, phân bố, sinh thái Đây là những dẫn liệu đầu vào về đa dạng loài, hệ thống phân loại và đa dạng di truyền của khu hệ cá nước ngọt ĐBSCL, làm cơ sở cho công tác bảo tồn và quản lý nguồn lợi

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các loài cá nước ngọt được thu vào tháng 9 và tháng 12/2013 dựa trên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên ngoài thực địa Địa điểm thu mẫu là các chợ cá địa phương thuộc các tỉnh Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre, Tiền Giang của ĐBSCL Cá được phân loại bằng hình thái ngay khi mẫu còn tươi Các nghiên cứu di truyền được tiến hành tại phòng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu và phân loại các loài cá nước ngọt phổ biến ở ĐBSCL dựa trên đặc điểm hình thái Xây dựng dữ liệu về đặc điểm sinh học của những loài cá

nước ngọt phổ biến ở ĐBSCL

- Xây dựng dữ liệu di truyền mã vạch (DNA barcoding) dựa trên gen 16S mtDNA của các loài cá nước ngọt phổ biến ở ĐBSCL Kiểm chứng phân loại với các dữ liệu có sẵn trên ngân hàng quốc tế Genbank

- Bước đầu khảo sát mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nước ngọt phổ biến ở ĐBSCL

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu này khảo sát sự đa dạng khu hệ cá nước ngọt phổ biến ở ĐBSCL dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền (DNA barcoding), đồng thời xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nghiên cứu Đây là dữ liệu di truyền mã vạch đầu tiên của các loài cá phổ biến ĐBSCL, dữ liệu này có thể được sử dụng cho các nghiên cứu đa dạng sinh học và quản lý nguồn lợi thủy sản ĐBSCL

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu

Sông Mekong bắt nguồn từ Trung Quốc (MOC, 2004), qua địa bàn tỉnh Qinghai, khu vực tự trị Tây Tạng, tỉnh Vân Nam của Trung Quốc và các nước Myanmar, Thái Lan, Lào, Campuchia, hình thành nên Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) ở Việt Nam và đổ vào Biển Đông (MRC, 1997) Sông Mekong là con sông dài thứ 12 trên thế giới và lớn thứ 10 về tổng lượng dòng chảy (MRC, 2011) Tổng diện tích lưu vực sông Mekong là khoảng 795.000 km 2, trong đó Việt Nam chiếm khoảng 20% diện tích (Hori, 2000)

Nguồn: http://webworld.unesco.org/water/wwap/pccp/useful_links/Mekong_maps.shtml

Hình 1.1 – Lưu vực sông Mekong

Lưu vực sông Mekong (MRB) đại diện cho một điểm nóng toàn cầu về đa dạng sinh học (Dudgeon và cs, 2006; Allen và cs, 2012), đứng thứ hai sau sông Amazon về sự phong phú các loài cá (Baran, 2010) Hạ lưu sông Mekong là một trong những nguồn đảm bảo an ninh lương thực chính ở Đông Nam Á Trong số 60 triệu người dân sống trong lưu vực sông, khoảng 80% phụ thuộc trực tiếp vào sông

vì lương thực và sinh kế (International Rivers, 2013)

ĐBSCL còn có tên là Đồng bằng Nam Bộ hoặc miền Tây Nam Bộ, nhưng thường được gọi là miền Tây ĐBSCL nằm liền kề vùng Đông Nam Bộ, phía Bắc giáp Campuchia, phía Tây Nam là vịnh Thái Lan, phía Đông Nam là Biển Đông Sông Mekong chảy qua ĐBSCL bao gồm hai nhánh chính là sông Tiền và sông Hậu (sông Cửu Long), các sông nhánh và mạng lưới kênh rạch chằng chịt kết nối với sông Vàm Cỏ và hệ thống sông Đồng Nai (Pham Van Mien, 2002) Nguồn lợi cá nước ngọt ĐBSCL chủ yếu là các loài cá từ thượng nguồn sông Mekong đổ về (Campell, 2009) Thêm vào đó, nhờ những trầm tích phù sa màu mỡ của sông Mekong bồi đắp qua thời gian, ĐBSCL có điều kiện thuận lợi để phát triển nền nông nghiệp trồng lúa

và cây ăn quả

Hình 1.2 – Đồng bằng sông Cửu Long (Albers và cs, 2013)

Khí hậu ở ĐBSCL là khí hậu nhiệt đới ẩm với tính chất cận xích đạo rõ rệt Nhiệt độ trung bình năm của khu vực là 26 – 27 °C, biến thiên nhiệt độ trung bình 3 – 3,5 °C Ẩm độ trung bình ở ĐBSCL là 82 – 83% với lượng mưa khá lớn, trung bình từ 1.400 – 2.200 mm/năm Khí hậu chia làm hai mùa rõ rệt: mùa mưa tập trung

từ tháng 5 – 10, lượng mưa chiếm tới 75 – 95% tổng lượng mưa của cả năm; mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau (Lê Anh Tuấn, 2008) Có thể nói, các yếu tố khí hậu đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và đa dạng của sinh vật nơi đây, đặc biệt là các loài cá nước ngọt

Hệ sinh thái rừng ngập mặn ở ĐBSCL cũng đóng vai trò quan trọng với sinh thái và môi trường Bên cạnh việc bảo vệ bờ biển, hạn chế xói lở và điều hòa khí hậu, rừng ngập mặn còn là nơi cư trú của nhiều loài cá Theo Schmitt (2009), vật rụng (lá, cành, chồi, hoa, quả) của cây rừng ngập mặn được các vi sinh vật phân hủy thành mùn bã hữu cơ (ước tính 3,6 tấn mùn bã hữu cơ/hecta/năm) là nguồn thức ăn cho các loài thủy sản

Tuy nhiên, ĐBSCL được xác nhận là nơi chịu tác động mạnh mẽ của biến đổi khí hậu và nước biển dâng (IPCC, 2007), điều này sẽ tăng nguy cơ xâm nhập mặn

và tăng tần suất của các cơn bão, lũ lụt, biến động dòng chảy sẽ ảnh hưởng đến đường đi của cá, các bãi đẻ và khu vực kiếm mồi của chúng

Ngoài ra, ĐBSCL cũng phải đối mặt với những thách thức từ bùng nổ dân số Theo Tổng cục thống kê (2012), dân số trung bình ĐBSCL là 17390.5 nghìn người, mật độ dân số bình quân 429 người/km2, gần gấp đôi mật độ dân số cả nước Áp lực của việc gia tăng dân số ở ĐBSCL đòi hỏi việc đáp ứng tài nguyên vật chất cho hoạt động sống tăng cao, dẫn đến việc ô nhiễm môi trường do các chất thải sinh hoạt, công nghiệp Hạn chế về trình độ dân trí và thu nhập thấp của người dân dẫn đến sự khai thác bừa bãi, quá mức, làm giảm thiểu nguồn lợi cá nước ngọt và tác động đến mức độ đa dạng sinh học trong khu vực (Kỷ Quang Vinh, 2012) Đai rừng ngập mặn ven biển cũng bị phá hủy nghiêm trọng do nạn chặt phá cây, làm tăng xói mòn, xâm nhập mặn và nước biển dâng (Albers và cs, 2013)

Thêm vào đó, các đập thủy điện ở phía thượng nguồn sông Mekong dẫn đến việc làm giảm lưu lượng nước trong các dòng chảy về phía hạ lưu, đồng thời là chướng ngại chính cho sự di cư của các loài cá và thay đổi môi trường sống tự nhiên của chúng (Campbell, 2012) Điều này sẽ làm giảm thiểu nguồn lợi thủy sản

và ảnh hưởng đến độ đa dạng sinh học khu hệ cá nước ngọt của ĐBSCL

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học cá sông Mekong trong và ngoài nước

 Ngoài nước:

Lưu vực sông Mekong (MRB) đại diện cho một điểm nóng toàn cầu về đa dạng sinh học (Dudgeon và cs, 2006; Allen và cs, 2012) Nhiều công trình nghiên cứu ở khu vực sông Mekong đã được tiến hành Theo Hortle (2009), lưu vực sông Mekong chỉ đứng thứ 2 sau sông Amazon về sự phong phú các loài cá Nguồn gốc của sự đa dạng này được giả thuyết xuất phát từ quá trình địa sinh học phức tạp (Woodruff, 2010) Đa dạng sinh học của MRB bao gồm hơn 790 loài cá nước ngọt, trong đó có 28 loài đặc hữu (Campbell, 2012)

Smith (1945) mô tả 560 loài cá sông Mekong ở Thái Lan, thuộc 209 giống, 49

họ, 15 bộ Rainboth (1996) cung cấp hướng dẫn phân loại 500 loài cá ở Campuchia Ông cũng báo cáo các loài cá được cho rằng phân bố tại lưu vực sông Mekong ở Campuchia được ghi nhận hoặc tìm thấy bởi các tác giả từ Việt Nam, Lào và Campuchia

Kottelat (2001a) báo cáo 481 loài cá nước ngọt sông Mekong ở Lào, với hơn

100 loài mới được ghi nhận Nghiên cứu chỉ ra sự đa dạng các loài cá chạch thuộc

giống Schistura với 57 loài, chiếm hơn 10% thành phần khu hệ cá ở nước này

Các nhà khoa học thuộc tổ chức MRC (2003) xây dựng cơ sở dữ liệu về các loài cá sông Mekong (Mekong Fish Database – MFD) MFD cung cấp thông tin của

924 loài cá (với 219 loài đặc hữu) thuộc 87 họ và 24 bộ, trong đó có 60% các loài sống hoàn toàn ở nước ngọt và 40% các loài bình thường sống trong nước mặn hoặc nước lợ nhưng có thời gian di chuyển vào vùng nước ngọt

Poulsen và cs (2005) bổ sung các thông tin về 40 loài cá nước ngọt quan trọng nhất đối với nghề cá của sông Mekong, trong đó có 9 loài đặc hữu và 3 loài được liệt vào danh sách có nguy cơ tuyệt chủng Nghiên cứu cung cấp đặc điểm phân

bố, tập tính dinh dưỡng, kích thước, cấu trúc đàn, chu kỳ sống và vai trò của mỗi loài trong ngành thủy sản Những thông tin trong báo cáo này chủ yếu lấy kết quả từ việc khảo sát trong lưu vực sông Mekong thời gian từ năm 1995 đến năm

2001 của các cơ quan nghề cá mỗi nước kết hợp với các chương trình thủy sản

do Danida tài trợ

Vidthayanon (2008) mô tả 363 loài cá trong sách ảnh về các loại cá ở khu vực

hạ lưu sông Mekong, trong đó gồm 160 loài có nguồn gốc và quần đàn chính ở thượng nguồn, 80 loài cá sống ở nước mặn nhưng có thời gian di chuyển vào cửa sông Khu hệ cá bị chi phối bởi bộ Cypriniformes và Perciformes, cùng chiếm hơn 30% Nghiên cứu cung cấp hình ảnh giai đoạn cá bột và cá trưởng thành, thông tin

về đặc điểm sinh học và phân bố của chúng

Dựa trên cơ sở dữ liệu Mekong Fish Database – MFD, Valbo-Jørgensen và

cs (2009) phân loại được 924 loài cá của lưu vực sông Mekong, trong đó có 898 loài bản địa Nghiên cứu ghi nhận được 89 loài cá thường sống ở vùng nước lợ và cửa sông, 4 loài cá thường sống ở cửa sông nhưng có thể di chuyển lên phía thượng nguồn hoặc ra biển, 47 loài cá sống ở nước mặn nhưng có thời gian di chuyển vào cửa sông, 2 loài cá sinh sản ở cửa sông và nước mặn nhưng sống ở nước ngọt là

Anguilla marmorata và Lates calcarifer, 2 loài cá có thời gian sống ở biển nhưng

bơi ngược sông để sinh sản là Pangasius krempfi và Pangasius mekongiensis, 111

loài có thể sống ở cả nước ngọt, nước lợ và nước mặn

Trung tâm Nghề cá thế giới (ICLARM) cùng với Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp thế giới (FAO) lập ra trang web FishBase http://www.fishbase.org/ cập nhật thông tin khoảng 32.800 loài cá trên thế giới và phân bố của chúng Tính đến tháng 6/2014, FishBase đã cập nhật 797 loài cá của lưu vực sông Mekong, cung

cấp các thông tin về phân loại, đặc điểm phân bố, tập tính dinh dưỡng, kích thước, chu kỳ sống và nguy cơ bị đe dọa của chúng

 Trong nước

Nhiều nghiên cứu về đa dạng sinh học các loài cá nước ngọt ở Việt Nam đã được tiến hành với phương pháp phân loại truyền thống là dựa trên đặc điểm hình thái (Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân (2001); Nguyễn Văn Hảo (2005a, 2005b); Thái Thanh Dương (2007) Đối với đa dạng sinh học các loài cá nước ngọt ở ĐBSCL, việc tiến hành các nghiên cứu như vậy là rất cần thiết, bổ sung thêm nguồn

tư liệu cho các nghiên cứu đa dạng sinh học và công tác quản lý nguồn lợi thủy sản trong khu vực

Mai Đình Yên và cs (1992) định loại 255 loài cá nước ngọt ở Nam Bộ, thuộc 41

họ của 14 bộ Cũng ở khu vực này, Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) định loại 173 loài cá nước ngọt, thuộc 39 họ của 13 bộ

Le Dien Duc (1989) báo cáo về 260 loài cá từ ĐBSCL Nhiều loài di cư về khu vực thượng nguồn theo mùa và một số di cư đến các vùng nước ngọt để đẻ trứng Các loài cá nước lợ và vùng ven biển chủ yếu là các loài trong các họ Clupeidae, Scombridae, Sciaenidae, Tachysauridae và Cynoglossidae Trong khi đó, khu hệ cá nước ngọt phổ biển bởi họ Cyprinidae, Siluridae, Clariidae, Schilbeidae, Bagridae, Sisoridae, Akysidae, Chanidae và Ophicephalidae

Nguyễn Thanh Tùng và cs (2005) kiểm tra khu hệ cá ở tỉnh Vĩnh Long Nhóm tác giả nghiên cứu 152 loài cá thuộc 50 họ, 15 giống, trong đó, khu hệ cá bị chi phối bởi bộ Cypriniformes (47 loài, chiếm 30,92%), Perciformes (41 loài, chiếm 26,97%

và Silluriformes (32 loài, chiếm 22,37% )

Đoàn Văn Tiến và Mai Thị Trúc Chi (2005) khảo sát được 193 loài thuộc 40

họ, 13 bộ của ĐBSCL Đa số các loài cá khảo sát thuộc 3 bộ Cypriniformes, Perciformes và Siluriformes, được chia thành 3 nhóm chính : Nhóm cá sông – chủ yếu sống ở nước ngọt, có các họ: Cyprinidae, Siluridae, Pangasidae, Labotidae, Bagridae ; Nhóm cá đồng – sống chủ yếu ở đồng ruộng, thỉnh thoảng bắt gặp ở

kênh mương, có các họ Clariidae, Channidae, Belonidae, Synbranchidae ; Nhóm cá nước lợ - sống chủ yếu ở vùng cửa sông, di cư ngược về vùng nước ngọt để tìm mồi hoặc sinh sản như Eleotridae, Gobiidae, Muilidae, Leiognathidae, Trichuridae, Megalopidae Ngoài ra cũng hiện diện một số loài cá từ biển đi vào vùng cửa sông

như: Tenualosa thibaudeaui, Tenualosa toli (Clupeidae), Lycothrissa crocodilus

(Engraulidae)

Trần Đắc Định và cs (2013) hợp tác với Quỹ môi trường thiên nhiên Nagao (NEF) tiến hành dự án nghiên cứu về khu hệ cá ĐBSCL từ 10/2006-01/2013 với kinh phí tài trợ của Quỹ bảo vệ môi trường toàn cầu (JFGE) thuộc Tổ chức phục hồi

và bảo vệ môi trường (ERCA) của Nhật Bản Kết quả đã mô tả và lưu trữ các mẫu của 322 loài cá ĐBSCL, trong đó có 186 loài cá nước ngọt

1.3 Kỹ thuật di truyền ứng dụng trong đa dạng sinh học cá

1.3.1 Hệ gen ty thể và hệ gen nhân

Hệ gen (genome) chứa toàn bộ thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho cơ thể hoạt động Ở các sinh vật nhân chuẩn (eukaryote), 99% genome nằm trong nhân tế bào (hệ gen nhân – nuclear DNA (nDNA)) và phần còn lại nằm trong một số cơ quan tử như ty thể và lạp thể (hệ gen ty thể - mitochondrial DNA (mtDNA) và hệ gen lạp thể - chloroplast DNA (ctDNA)) Genome trong nhân thường lớn (3,3 tỷ base pairs ở người) và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng Trong khi đó đa số genome các cơ quan tử thường có kích thước nhỏ (16.569 base pairs ở người) và ở dạng vòng khép kín (Chial và Craig, 2008)

DNA ty thể (mtDNA) là một gen độc lập có cấu trúc mạch vòng nằm trong ty thể, mã hóa đặc trưng cho 13 protein (các enzym tham gia vào phosphoryl hóa oxy hóa), 2rRNA và 22 tRNA (Wolstenholme, 1992)

Nguồn: http://mail.nbfgr.res.in/fmir/

Hình 1.3 – DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng

mã hóa protein Mũi tên chỉ vùng gen (16S mtDNA) được sử dụng trong nghiên

cứu hiện tại

DNA ty thể được ưu tiên sử dụng làm chỉ thị phân tử hơn DNA nhân trong kỹ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) để xác định đa dạng sinh học và biến động di truyền của sinh vật bởi những ưu điểm: vùng mã hóa lớn, không tái tổ hợp,

di truyền theo dòng mẹ (Saccone và cs, 1999) và số lượng bản sao lớn (Taylor và Turnbull, 2005) DNA nhân di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn Trong khi đó, DNA ty thể di truyền theo dòng mẹ, nên có thể hạn chế

trường hợp này (Hebert và cs, 2003a ; Neigel và cs, 2007 ; Swartz và cs, 2008) Sự

tái tổ hợp (recombination) trên DNA ty thể thường không xảy ra, nên sẽ không hình thành các đoạn DNA tái tổ hợp (Krishnamurthy và Francis, 2012) Một tế bào chứa vài trăm ty thể, mà một ty thể chứa hàng chục bản sao bộ gen của nó.Vì vậy, trong một tế bào có thể chứa được hàng ngàn bản sao của bộ gen ty thể, nhưng bộ gen nhân

thì chỉ có hai bản sao Hơn nữa, ở DNA nhân, vùng không mã hóa chiếm tới 93%; trong khi ở DNA ty thể, vùng không mã hóa chỉ chiếm 3% (Taylor và Turnbull, 2005) Các vùng không mã hóa này sẽ làm cho quá trình giải trình tự thêm phức tạp

vì đôi khi cần phải tạo dòng để thu được đoạn gen mong muốn (Tauz và cs, 2003;

Schander và Willassen, 2005) Việc khuếch đại các đoạn gen của DNA ty thể chỉ cần

một số lượng giới hạn các đoạn mồi Trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của DNA ty thể có thể định danh được đến loài ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật ngoại trừ ngành ruột khoang Cnidaria (Herbert và cs, 2004)

DNA ty thể là một công cụ đắc lực trong xác định các loài, đánh giá mối quan

hệ của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyền trong công tác bảo tồn các loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng (Rubinoff, 2006) Việc sử dụng DNA

ty thể để xác định loài được tuyên bố có tỷ lệ thất bại tương đối nhỏ, dưới 5% (Waugh, 2007) Hebert và cs (2003) xác định tỷ lệ thành công 100% khi ứng dụng DNA ty thể trong nghiên cứu xác định các loài bướm Hubert và cs (2008) báo cáo một tỷ lệ thành công 93% trong nghiên cứu xác định các loài cá nước ngọt Canada Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008) Việc khuếch đại đoạn gen cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của DNA ty thể thường được sử dụng như một mã vạch DNA (DNA barcoding) để nghiên cứu sự đa dạng sinh học của giới sinh vật (Hebert và

đề nghị nên sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử để có kết quả với độ chính xác cao (Hebert và cs, 2004) Các marker DNA ty thể được sử dụng kết hợp với marker DNA nhân trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Schander và cs, 2005)

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền mã vạch DNA barcoding

Những hạn chế của công tác phân loại dựa trên đặc điểm hình thái đòi hỏi một phương pháp tiếp cận nhanh chóng và chính xác hơn Kỹ thuật di truyền mã vạch DNA – barcoding (Floyd và cs, 2002; Hebert và cs, 2003a) tập trung phân tích trên một đoạn ngắn hệ gen, sử dụng một cặp mồi chung để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, rồi dựa trên dữ liệu di truyền thu được để xác định các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật di truyền mã vạch được sử dụng rộng rãi và có thể xác định đa dạng sinh học và biến động di truyền của sinh vật (Hebert và cs, 2003a, 2003b; Tautz và cs, 2003) Phương pháp di truyền hiện đại có thể giúp quản lý bền vững tài nguyên thiên nhiên và cung cấp cơ sở khoa học cho việc bảo tồn các hệ sinh thái có giá trị, cùng với quần thể các loài phân bố trong khu hệ sinh thái và tính

đa dạng di truyền của chúng (Ovenden và cs, 2013; Willette và cs, 2014) Hiện nay, việc phân tích di truyền mã vạch là một lựa chọn hiệu quả vì chi phí thấp và có thể

sử dụng cho nhiều đối tượng sinh vật, đồng thời rất hữu hiệu trong việc xây dựng

dữ liệu di truyền ứng dụng trong quản lý nguồn lợi (Hajibabaei và cs, 2005)

DNA ty thể được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong xác định các loài, đánh giá mối quan hệ của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyền trong công tác bảo tồn các loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng (Grande và cs, 2008) Các chỉ thị phân tử (marker) chuẩn của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen

mã hóa cho vùng gen điều khiển (control region – CR) mtDNA, cytochrome b (cyt b) mtDNA, 16S mtDNA và cytochrome oxidase c subunit 1 (CO1) mtDNA (Grande

và cs, 2008)

Hiện nay, kỹ thuật di truyền mã vạch DNA được áp dụng ở nhiều loài động

vật như chim (Hebert và cs, 2004), động vật lưỡng cư (Vences và cs,2 005), kiến (Smith và cs, 2005) và động vật giáp xác (Lefebure và cs, 2006)

Bartlett và Davidson (1991) lần đầu tiên sử dụng trình tự mtDNA để định danh cá và chỉ ra rằng trình tự cytochrome b có thể sử dụng để phân loại 4 loài

cá ngừ thuộc giống Thunnus là T thynnus, T obesus, T albacares và T

alalunga Theo Teletchea (2009), sử dụng DNA ty thể là công cụ hữu hiệu trong

phân loại các loài cá

Muchlisin và cs (2013) xây dựng dữ liệu mã vạch cho cá trong hồ Laut Tawar, Indonesia Tổng cộng có 31 haplotype từ 14 loài cá nước ngọt được phát hiện trong nghiên cứu này Khoảng cách nucleotide giữa các loài dao động từ 7,1%, giữa

Puntius brevis (Bleeker, 1850) và Poropuntius tawarensis (Weber et de Beaufort,

1916) đến 30,4% giữa Channa gachua (Hamilton, 1822) và Homaloptera sp

Jondeung và cs (2006) xác định trình tự đầy đủ (16.533bp) của bộ gen ty thể

loài Pangasianodon gigas, đồng thời phân tích mối quan hệ phát sinh loài dựa trên

13 vùng gen mã hóa protein trên ty thể và rRNA (12S và 16S) Kết quả cho thấy

mối quan hệ giữa P gigas với 15 trong số 33 họ thuộc bộ Siluriformes, cụ thể P

gigas của họ Pangasidae có mối quan hệ gần gũi với họ Siluridae hơn họ Bagridae

Jumawan và cs (2011) áp dụng gen CO1 mt DNA để phân định giữa hai loài

cá da trơn Pterygoplichthys suckermouth sailfin – P pardalis và P disjunctivus tại

hệ thống sông Marikina, Philippines Kết quả hỗ trợ khả năng lai tạo giữa P

pardalis và P disjunctivus và sự cần thiết phải đánh giá lại chỉ tiêu phân loại của

hai loài làm cơ sở để định danh loài

Zhang (2011) kiểm tra hiệu quả của kỹ thuật mã vạch DNA trong phân loại các loài cá biển của Trung Quốc Nhóm nghiên cứu thu được trình tự của khoảng

121 loài, bao gồm phần lớn các loài cá sống ở biển Đông Khoảng cách di truyền trung bình 15,742% giữa các loài và chỉ có 0,319% cho các cá thể trong cùng 1 loài Pereira và cs (2013) kiểm tra hiệu quả của phương pháp di truyền mã vạch (gen CO1 mtDNA) để xác định sự đa dạng các khu hệ cá nước ngọt ở khu vực Neotropical Để tiến hành nghiên cứu này, 254 loài cá được phân tích từ vùng thượng lưu của lưu vực sông Parana Với 254 loài được phân tích, 252 được xác

định một cách chính xác bằng các trình tự mã vạch với độ chính xác 99,2% Giá trị khác biệt di truyền trung bình cùng loài và khác loài lần lượt là 0,3% và 6,8% Karinthanyakit và Jondeuung (2012) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của 13 loài thuộc họ Pangasidae và 6 loài thuộc họ Schilbeida của Thái Lan dựa trên vùng cyt b, 12S rRNA, tRNA-Val và 16S rRNA của DNA ty thể Nghiên cứu chỉ ra họ Pangasidae và họ Schilbeidae là nhóm đơn ngành Họ Pangasidae được

chia làm 4 giống Pangasius, Pseudolais, Helicophagus và Pangasianodon, tương ứng với khoảng cách di truyền của vùng cyt b mtDNA Kết quả thể hiện Pangasius

sanitwongsei thuộc nhóm gần gũi với Pangasius larnaudii; Pangasius krempfi

thuộc nhóm gần gũi với Pangasius nasutus, Pangasius conchophilus; Pangasius

polyuranodon gần gũi với Pangasisu macronema

Dữ liệu mã vạch DNA đã được xây dựng cho hơn 8.000 loài cá và các trình tự CO1 mtDNA gửi vào hệ thống dữ liệu DNA barcode (BOLD) (Ragnasingham và Hebert 2007) Genbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ là cơ sở dữ liệu di truyền, chứa các trình tự DNA đã được công bố của 26.000 loài sinh vật Genbank được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của Ngân hàng dữ liệu DNA Nhật Bản (DDBJ), Phòng thí nghiệm sinh học phân tử châu Âu (EMBL) Dựa vào Genbank để đối chiếu sự phân loại cá đã và đang được sử dụng rộng rãi

Mặc dù sở hữu sự đa dạng sinh học cao về nguồn lợi cá nước ngọt, tuy nhiên chưa có công bố nào về dữ liệu di truyền mã vạch (DNA barcoding) của cá nước ngọt ĐBSCL

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu

Các loài cá nước ngọt được thu vào tháng 9 và tháng 12/2013 dựa trên phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên ngoài thực địa; địa điểm thu mẫu là các chợ cá địa phương thuộc các tỉnh Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến

Tre, Tiền Giang của ĐBSCL (Hình 2.1) Số lượng cá thể trên một loài thu thập tại

mỗi địa điểm dao động từ 1 đến 8 Mẫu sau khi thu được rửa sạch bằng nước ngọt

và mã hóa Tiến hành phân loại bằng hình thái ngay khi mẫu còn tươi Mô cơ cá được cố định trong cồn 96o và bảo quản lạnh ở - 200C cho các nghiên cứu di truyền

Hình 2.1– Các địa điểm thu mẫu cá trên địa bàn ĐBSCL(đánh dấu màu đỏ)

2.2 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.2 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.3 Phân loại hình thái

Quan sát sơ bộ bên ngoài cơ thể cá (Hình 2.3), đo các chỉ tiêu hình thái (mm) (Hình 2.4), đếm các chỉ tiêu phân loại (Hình 2.5), cân trọng lượng (g) cơ thể

Cá được phân loại theo các khóa phân loại và mô tả của Rainboth (1996), Nguyễn Văn Hảo (2005), Trần Đắc Định và cs (2013) Xây dựng bộ mẫu cá và sắp xếp theo

họ, giống Mẫu được bảo quản ở phòng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang

Hình 2.3 – Một số bộ phận của bộ cá xương (theo Trần Đắc Định và cs,

2013)

 Đo các chỉ tiêu hình thái

Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên, sau đó dùng thước có chia độ đo (cm, mm) để đo kích thước các mẫu cá theo các chỉ tiêu sau:

- Chiều dài cá (L): đo từ đầu cá đến điểm cuối của thân cá

- Chiều dài cá bỏ đuôi (Lo): đo từ đầu cá đến cuống đuôi

- Chiều cao thân cá (H): đo phần cao nhất của cơ thể cá

- Chiều dài đầu (T): đo từ phần đầu cá đến hết phần mang cá

- Chiều dài gốc vây lưng (lD): đo từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc gốc vây lưng

- Chiều dài gốc vây hậu môn (lA): đo từ điểm khởi đầu gốc đến điểm kết thúc vây hậu môn

- Chiều dài gốc vây ngực (lP): đo từ điểm khởi đầu gốc vây ngực đến cuối vây ngực

- Chiều dài gốc vây bụng (lV): đo từ điểm khởi đầu gốc vây bụng đến cuối vây bụng

Hình 2.4 – Các chỉ số đo trong phân loại cá (theo Rainboth, 1996)

 Đếm các chỉ tiêu phân loại

Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên, đếm các tia vây cứng, tia vây mềm và tia phân nhánh có trên các vây Các chữ đầu của tiếng được dùng để ký hiệu cho các vây D (Dorsal) – Số lượng tia và gai vây lưng (nếu có 2 vây lưng thì chia thành D1 và D2) V (Ventral) – Số lượng tia và gai vây bụng; A (Anal) – Số lượng tia và gai vây hậu môn; P (Pelvic) – Số lượng tia và gai vây ngực; C (Caudal)

– Số lượng tia và gai vây đuôi (Hình 2.5) Số tia gai cứng được ký hiệu bằng chữ số

La Mã, còn số lượng tia vây mềm ký hiệu bằng chữ số thường, cách nhau bằng dấu phẩy, dao động giữa các mẫu ghi bằng dấu gạch nối

Hình 2.5 – Các chỉ số đếm trong phân loại cá (theo Rainboth, 1996) 2.4 Nghiên cứu di truyền cá ĐBSCL

2.4.1 Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự

 Tách chiết DNA

DNA tổng số được tách chiết từ 20 mg mẫu cơ của từng cá thể cá bằng bộ kit

Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific) theo hướng

dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 1) Bảo quản DNA trong tủ đông – 400

 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Đoạn gen 16S của DNA ty thể được khuếch đại với cặp mồi 16SF

(5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) và 16SR (5’-CCGGTCTGAACTCAGATC

ACGT-3’) (Palumbi và cs, 1991)

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µL bao gồm 2,5 µL

Buffer (1X), 5 µL mẫu DNA, 1 µL mỗi mồi (10µM), 0,5 µL dNTP (10µM), 0,125

µL Dream Taq Polymerase (5U/µL) và H2O cho đủ thể tích Chu trình nhiệt của

phản ứng PCR: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút; sau đó là 38 chu kỳ của

94oC trong 30 giây, nhiệt độ lai 48oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút; cuối cùng là

bước kéo dài tại 72oC trong 7 phút (Hình 2.6)

Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

 Điện di kiểm tra kết quả

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,7% nhuộm

Ethidium bromide

Chuẩn bị gel agarose 1,7% : Cân 0,68 g agarose rồi cho vào 40mL đệm SB

1X chứa trong bình tam giác 100 mL, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn Để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 – 700C rồi chuyển qua bình tam giác

100 mL thứ hai Thêm 1,5 µL Ethidium bromide, lắc nhẹ tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác)

Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược (lược 8 giếng hoặc lược 15 giếng) Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra theo phương thẳng đứng để tránh rách các giếng

Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di và thêm đệm SB 1X cho đến khi ngập

bản gel Dùng micropipette mix đều 4 µL mẫu với 2 µL loading dye 6X, rồi load vào các giếng của gel Hút 5 µL DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 500A trong 20 phút

Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator và

xem các band DNA dưới tia cực tím, sản phẩm của quá trình khuếch đại là các band

có kích thước vào khoảng 560 bp

 Giải trình tự DNA

Sản phẩm PCR được gửi đến công ty THNHH Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh giải trình tự Phản ứng giải trình tự được tiến hành theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 96oC trong 20 giây,

50oC trong 20 giây, cuối cùng là 60oC trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.4.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại

 Kết nối trình tự và phân tích dữ liệu

Các trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá nước ngọt được kết nối bằng chương trình Geneious (ver 7) (www.support.geneious.com/), và kiểm chứng với dữ liệu từ Genbank bằng chương trình BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/) Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), sau đó được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường, xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài cá nước ngọt

Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự các loài cần so sánh được tính theo công thức sau:

Sự khác biệt di truyền =

 Xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nghiên cứu

Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen 16S của DNA ty thể các mẫu cá nước ngọt, bao gồm 22 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở ĐBSCL, Việt Nam và 71 trình tự từ Genbank Thông tin về các trình tự cá nước ngọt được thể

hiện ở Bảng 2.1

Bảng2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá nước ngọt

1 Pangasius krempfi Cần Thơ Nghiên cứu hiện tại

2 Pangasius macronema Cần Thơ Nghiên cứu hiện tại

4 Pangasius krempfi Thái Lan HM355773.1 Karinthanyakit và

8 Pangasius pangasius Ấn Độ GQ411088.1 Lal và cs, 2009

9 Pangasius nasutus Thái Lan HM355778.1 Karinthanyakit và

Jondeung, 2012

10 Pangasius

conchophilus Thái Lan HM355772.1

Karinthanyakit và Jondeung, 2012

11 Pangasius

polyuranodon Thái Lan HM355779.1

Karinthanyakit và Jondeung, 2012

12 Pangasius bocourti Thái Lan HM355770.1 Karinthanyakit và

14 Mystus mysticetus Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại

15 Mystus mysticetus Thái Lan HQ257355.1 Karinthanyakit và

Jondeung, 2013

16 Mystus rhegma Trung Quốc NC_023223.1 Zeng và Peng, 2014

17 Mystus multiradiatus Thái Lan HQ257353.1 Karinthanyakit và

25 Ompok bimaculatus An Giang Nghiên cứu hiện tại

26 Ompok bimaculatus Ấn Độ GQ469642.1 Lakra và cs, 2009

27 Ompok malabaricus Ấn Độ FJ432680.1 Lekshmi và cs,

2008

28 Ompok pabo Ấn Độ GQ469605.1 Lakra và cs, 2009

29 Ompok pabda Ấn Độ GQ469568.1 Lakra và cs, 2009

ornatipinnis Thái Lan JX074122.1 Yang và cs, 2012

35 Paralaubuca typus An Giang Nghiên cứu hiện tại

36 Paralaubuca typus Campuchia AP011211.1 Saitoh và cs, 2011

37 Acantopsis sp Cần Thơ Nghiên cứu hiện tại

38 Acantopsis

choirorhynchos Nhật Bản AB242161.1 Saitoh và cs, 2006

39 Syncrossus helodes Cần Thơ Nghiên cứu hiện tại

40 Sinibotia superciliaris Trung Quốc JX683724.1 Yang và cs, 2013

41 Botia sp Trung và Nam

43 Yasuhikotakia modesta An Giang Nghiên cứu hiện tại

44 Coilia rebentischii Tiền Giang Nghiên cứu hiện tại

45 Coilia ectenes Trung Quốc JX625133.1 Qiao và cs, 2013

46 Coilia nasus Nhật Bản AP009135.1 Lavoué và cs, 2007

47 Coilia lindmani Ấn Độ Dương

Thái Bình Dương AP011558.1 Lavoué và cs, 2010

48 Coilia mystus Trung Quốc JX534238.1 Zhang và cs, 2013

49 Coilia grayii Trung Quốc KF938994.1 Li và cs, 2013

50 Coilia reynaldi Ấn Độ Dương

Thái Bình Dương AP011559.1 Lavoué và cs, 2010

51 Clupeoides borneensis Vĩnh Long Nghiên cứu hiện tại

52 Clupeoides borneensis Thái Lan AP011586.1 Lavoué và cs, 2010

53 Clupeoides sp Thái Lan AP011587.1 Lavoué và cs, 2010

54 Toxotes chatareus Vĩnh Long Nghiên cứu hiện tại

55 Toxotes chatareus Nhật Bản AP006806.1

Yagishita và cs,2009

56 Brachirus panoides Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại

57 Achiroides

leucorhynchos Đài Loan AM182050.1

Lei và Chuang,

2006

58 Datnioides polota Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại

59 Datnioides polota Mỹ EF120868.1

Smith và Craig,

2007

60 Trichogaster

61 Trichogaster pectoralis Cần Thơ Nghiên cứu hiện tại

62 Trichogaster microlepis Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại

63 Trichogaster

trichopterus Châu Á AY763713.1 Ruber và cs, 2006

64 Trichogaster pectoralis Châu Á AY763712.1 Ruber và cs, 2006

65 Trichogaster microlepis Châu Á AY763711.1 Ruber và cs, 2006

66 Trichogaster leerii Châu Á AF519656.1 Ruber và cs, 2004

67 Pristolepis fasciata Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại

68 Pristolepis rubripinnis Ấn Độ KC774738.1 Lenka và cs, 2013

69 Pristolepis fasciata Ấn Độ GQ478235.1 RajaSwaminathan

và cs, 2009

70 Pristolepis marginata Ấn Độ KC774737.1 Lenka và cs, 2013

71 Mastacembelus favus An Giang Nghiên cứu hiện tại

72 Mastacembelus favus Nhật Bản AP002946.1 Miya và cs, 2001

76 Notopterus notopterus An Giang Nghiên cứu hiện tại

77 Notopterus notopterus Thái Lan AP008925.1 Inoue và cs,2009

78 Notopterus notopterus Ấn Độ AP008924.1 Inoue và cs,2009

79 Chitala blanci Đông Nam Á AP008921.1 Inoue và cs,2009

80 Chitala ornata Đông Nam Á AP008923.1 Inoue và cs,2009

81 Chitala lopis Đông Nam Á AP008922.1 Inoue và cs,2009

82 Cynoglossus feldmanni Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại

83 Cynoglossus semilaevis Trung Quốc DQ112682.1 Kong và cs, 2006

84 Cynoglossus lineolatus Trung Quốc JQ349004.1 Kong và cs, 2013

85 Cynoglossus

abbreviatus Trung Quốc DQ112681.1 Kong và cs, 2006

86 Cynoglossus joyneri Hàn Quốc HQ003908.1 Kwun và Kim,

2010

87 Cynoglossus lighti Trung Quốc DQ112683.1 Kong và cs, 2006

88 Cynoglossus

purpureomaculatus Trung Quốc DQ112680.1 Kong và cs, 2006

89 Cynoglossus sinicus Trung Quốc DQ112684.1 Kong và cs, 2006

90 Cynoglossus robustus Hàn Quốc HQ003913.1 Kwun và Kim,

Phân tích mối quan hệ phát sinh loài được tiến hành dựa trên thuật toán

Maximum Neighbor – Joining sử dụng phần mềm MEGA 6 (Tamura và cs, 2013)

với độ lặp lại 1000 lần Giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán Cây đa dạng loài được hiệu chỉnh bằng phần mềm MEGA 6

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân loại hình thái

3.1.1.Thành phần loài các loài cá nước ngọt phổ biến thu tại ĐBSCL, Việt Nam

Sau khi phân tích hình thái, nghiên cứu phát hiện 22 loài cá thuộc 17 giống, 15

họ, 7 bộ Danh sách các loài cá được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 – Danh sách các loài cá nước ngọt phổ biến thu tại ĐBSCL, Việt Nam

(*): Cá nằm trong Sách đỏ Việt Nam

 Tỷ lệ các loài cá xét theo bộ

Trong số các bộ mà nghiên cứu ghi nhận được thì bộ cá vược – Percifomes có

số loài nhiều nhất với 6 loài (27,27%), tiếp đến là bộ cá da trơn – Siluriforms và bộ

cá chép – Cypriniformes với 5 loài mỗi bộ (mỗi bộ chiếm 22,73%) Bộ cá trích –

Synbranchiformes Mastacembelidae Mastacembelus Mastacembelus favus Cá chạch lấu Cypriniformes Cobotidae /Botiinae

Cobotidae/Cobitinae

Cyprinidae/Cyprinidae Cyprinidae/Cultrinae

Pleuronectiformes Cynoglossidae Cynoglossus Cynoglossus feldmanni Cá bơn phên

Soleidae Brachirus Brachius panoides Cá lưỡi mèo Osteoglossiformes Notopteridae Notopterus Notopterus notopterus Cá thát lát Perciformes Toxotidae Toxotes Toxotes chatareus * Cá mang rổ

Osphronemidae Trichopodus Trichopodus trichopterus Cá sặc chấm

Datnioididae Datnioides Datnioides polota * Cá hường vện Pristolepididae Pristolepis Pristolepis fasciata Cá rô biển Siluriform Bagridae Mystus Mystus mysticetus Cá chốt sọc

Siluridae Ompok Ompok bimaculatus Cá trèn bầu Pangasiidae Pangasius Pangasius macronema Cá sát sọc

Clupeiformes Clupeidae Clupeoides Clupeoides borneensis Cá cơm trích

Engraulidae/ Coiliinae Coilia Coilia rebentischii Cá lòng tong

Clupeiformes và bộ cá bơn – Pleuronectiformes có 2 loài mỗi bộ (mỗi bộ chiếm 9,09%) 2 bộ cá còn lại là bộ cá mang liền – Synbranchiformes và bộ cá thát lát – Osteoglossiformes chỉ có 1 loài (mỗi bộ chiếm 4,55%)

 Tỷ lệ các loài cá xét theo họ

Trong số các họ mà nghiên cứu ghi nhận được thì họ cá tai tượng – Osphronemidae và họ cá tra – Pangasiidae có số loài nhiều nhất với 3 loài mỗi họ (mỗi họ chiếm 13,64%), tiếp đến là họ cá chép – Cyprinidae với 2 loài (chiếm 9,1%) Các họ còn lại đều chỉ có 1 loài (mỗi họ chiếm 4,55%)

 Tỷ lệ các loài cá xét theo giống

Trong số các giống ghi nhận được thì giống cá sặc – Trichopodus và giống cá tra – Pangasius có số loài nhiều nhất với 3 loài mỗi giống (mỗi giống chiếm 13,64%)

Các giống còn lại đều chỉ có 1 loài (mỗi giống chiếm 4,55%) Tỷ lệ (%) số lượng các

họ, giống, loài trong các bộ cá nước ngọt của nghiên cứu hiện tại được thể hiện ở

Hình 3.1

Hình 3.1 - Tỷ lệ (%) số lượng các họ, giống, loài trong thành phần cá nước

ngọt thu tại ĐBSCL, Việt Nam.

2 72 – 82 50 – 65 2 – 3 (phải)

4 – 5 (trái) 0 7,6 ± 0,2 5,2 ± 0,2 2,05 ± 0,05 1,2 ± 0,1 7,05 ± 0,15 6,65 ± 0,05

0,25±0,05 (trái) 0,3±0,1 (phải) 0 17,48 ± 2,63

D – Số lượng tia và gai vây lưng

V – Số lượng tia và gai vây bụng

A – Số lượng tia và gai vây hậu môn

P – Số lượng tia và gai vây ngực;

C – Số lượng tia và gai vây đuôi

Số tia gai cứng được ký hiệu bằng chữ

số La Mã, còn số lượng tia vây mềm

ký hiệu bằng chữ số thường, cách nhau bằng dấu phẩy (vd: 2 tia gai cứng, 8 tia mềm thì ký hiệu: II,8)

L – Chiều dài cá

Lo – Chiều dài cá bỏ đuôi

H – Chiều cao thân cá

T – Chiều dài đầu

lD – Chiều dài gốc vây lưng

A – Chiều dài gốc vây hậu môn

P – Chiều dài gốc vây ngực

V – Chiều dài gốc vây bụng

Trong 22 loài cá nghiên cứu đã phát hiện có 2 loài được ghi nhận trong Sách

đỏ Việt Nam (Sách đỏ Việt Nam, 2007) là cá mang rổ – Toxotes chatareus và cá hường vện – Datnioides polota Theo đó, 2 loài này được xếp vào nhóm VU

(Vulnerable) – Sẽ nguy cấp (Sách đỏ Việt Nam, 2007)

3.1.2 Đặc điểm hình thái các loài cá nước ngọt phổ biến thu tại ĐBSCL, Việt Nam

(1) Mastacembelus favus Hora, 1924 – Cá chạch lấu

Tên tiếng Anh (FAO name): Tire track eel

Tên địa phương: Cá chạch lấu, cá chạch bông

Theo FishBase http://www.fishbase.org/ (cập nhật tháng 4/2014),

Mastacembelus favus có hệ thống phân loại như sau:

Bộ: Cá mang liền – Synbranchiformes

Họ: Cá chạch sông – Mastacembelidae

Giống: Cá chạch – Mastacembelus (Scopoli, 1777)

Hình 3.2a – Hình dáng cá chạch lấu Mastacembelus favus (Thanh tỷ lệ = 1,5 cm)

Danh pháp tương tự: Mastacembelus armatus (Lacepède,1800)

Mastacembelus favus (Hora, 1923) Địa điểm thu mẫu : Tỉnh An Giang

 Đặc điểm hình thái

M favus có đầu nhỏ, ngắn và dẹp bên, trên đầu có một vạch màu nâu thẫm

Mõm cá dài nhọn Thân cá dài, hình ống, phần trước tròn, phần sau dẹp bên Chiều cao thân trung bình 1,97 ± 0,17 cm (n = 3), chiều dài trung bình 17,8 ± 0,5cm (n =

3) và khối lượng trung bình 30,19 ± 3,21 g (n = 3) (Bảng 3.2) Trên thân cá có các

vân mạng lưới màu nâu đậm bao quanh các đốm màu nâu nhạt hơn, dạng hình yên ngựa ở trên lưng, hình tròn ở bên hông Vây ngực tròn, có 20 – 25 tia mềm Vây