nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của cá ngựa (hippocampus spp.) và đa dạng di truyền của cá ngựa đen (hippocampus kuda bleeker, 1852)

Các nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài của cá ngựa và đa dạng di truyền của cá ngựa đen tại khu vực Nam Trung Bộ nước ta – vùng có nhiều loài cá ngựa phân bố tự nhiên vẫn chưa được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG KIM QUỲNH

NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI

CỦA CÁ NGỰA (HIPPOCAMPUS SPP.)

VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁ NGỰA ĐEN

(HIPPOCAMPUS KUDA BLEEKER, 1852)

TẠI KHU VỰC NAM TRUNG BỘ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nha Trang - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG KIM QUỲNH

NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI

CỦA CÁ NGỰA (HIPPOCAMPUS SPP.)

VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁ NGỰA ĐEN

(HIPPOCAMPUS KUDA BLEEKER, 1852)

TẠI KHU VỰC NAM TRUNG BỘ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả và số liệu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào

Tác giả luận văn

Hoàng Kim Quỳnh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đặng Thúy Bình, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và dìu dắt tôi trong suốt quá trình định hướng nghiên cứu, thực hiện đề tài và viết luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn sự động viên, khích lệ và giúp đỡ của các Thầy, Cô trong Khoa Nuôi trồng Thủy sản, trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến hữu ích cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Chi cục Nuôi trồng thủy sản Khánh Hòa đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp CHNT09NT, anh Dũng, bạn Tâm,

em Hà và Ngoan đã nhiệt tình giúp đỡ, đóng góp những ý kiến hữu ích cho tôi trong quá trình viết và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình đã động viên và giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG LUẬN 3

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá ngựa 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái 3

1.1.2 Đặc điểm phân bố và môi trường sống 4

1.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng 5

1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 6

1.1.5 Đặc điểm sinh sản 8

1.2 Hiện trạng nghề khai thác và nuôi cá ngựa ở Việt Nam 11

1.2.1 Tình hình sản xuất giống và nuôi cá ngựa 11

2.2.2 Tình hình đánh bắt và mua bán cá ngựa 12

1.3 Đa dạng di truyền ở cá ngựa và một số loài thủy sinh vật 13

1.3.1 DNA ti thể và nghiên cứu di truyền quần thể 13

1.3.2 Các phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể 15

1.3.3 Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài và đa dạng di truyền ở cá ngựa cũng như một số loài thủy sinh vật khác 18

1.3.4 Nghiên cứu di truyền và vấn đề bảo tồn cá ngựa 21

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 25

2.3.1.1 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu hình thái 25

2.3.1.2 Phương pháp định danh 26

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu di truyền 27

2.3.2.1 Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự 27

2.3.2.2 Phân tích đa dạng loài cá ngựa Hippocampus kuda dựa trên haplotype 28

2.3.2.3 So sánh trình tự các loài cá ngựa 28

2.3.2.4 Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analysis).28 2.3.2.5 Phân tích di truyền quần thể loài cá ngựa đen Hippocampus kuda 29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Đặc điểm hình thái các loài cá ngựa thuộc giống Hippocampus tại vùng biển Khánh Hòa và Phú Yên 33

3.1.1 Cá ngựa đen (Hippocampus kuda Bleeker, 1852) 33

3.1.2 Cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus Leach, 1814) 34

3.1.3 Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus Weber, 1913) 35

3.1.4 Cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix Kaup, 1856) 35

3.1.5 Cá ngựa thân trắng (Hippocampus keloggi Jordan & Snyder, 1902) 36

3.1.6 Cá ngựa vằn (Hippocampus comes Cantor, 1850) 37

3.2 Đặc điểm di truyền cá ngựa 38

3.2.1 Khuếch đại DNA cá ngựa 38

3.2.2 Mối quan hệ phát sinh loài của các loài cá ngựa (Hippocampus spp.) 39

3.2.2.1 Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA 39

3.2.2.2 Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA 42

3.2.3 Đa dạng di truyền cá ngựa đen Hippocampus kuda 47

3.2.4 So sánh mối quan hệ loài cá ngựa trong một số nghiên cứu 50

3.3 Thảo luận 51

3.3.1 Phân loại cá ngựa dựa vào phương pháp hình thái 51

3.3.2 Mối quan hệ tiến hóa dựa trên các chỉ thị phân tử 52

3.3.3 Sự đa dạng di truyền của cá ngựa đen H kuda 54

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 56

4.1 Kết luận 56

4.2 Đề xuất ý kiến 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

Tài liệu tiếng Việt: 58

Tài liệu tiếng Anh: 59

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Sinh trưởng của cá ngựa đen nuôi 6 Bảng 1.2 Độ dài mùa sinh sản của một số loài cá ngựa 9 Bảng 1.3 Sức sinh sản của cá ngựa cái và khả năng ấp của cá ngựa đực (Trương Sĩ

Kỳ, 1997, 2000) 10 Bảng 1.4 Danh mục một số loài cá ngựa được nuôi trên thế giới 12 Bảng 2.1 Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 27 Bảng 2.2 Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích đa dạng loài cá

ngựa (Hippocampus spp.) (Modeltest 3.7, Akaike Information Criterion) 30

Bảng 2.3 Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích di truyền quần

thể Hippocampus kuda (Modeltest 3.7, Akaike Information Criterion) 30

Bảng 2.4 Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA của các loài cá ngựa 31

Bảng 3.1 Kích thước, số lượng và khối lượng cá ngựa (Hippocampus spp.) 38

Bảng 3.2 Sự tương đồng dựa trên gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam 41 Bảng 3.4 So sánh một số kết quả nghiên cứu phát sinh loài cá ngựa 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cá ngựa đen (Hippocampus kuda) 3

Hình 1.2 Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) 3

Hình 1.3 Cá ngựa vằn (Hippocampus comes); .4

Hình 1.4 Cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus) 4

Hình 1.5 Cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix); 4

Hình 1.6 Cá ngựa thân trắng (Hippocampus kelloggi) 4

Hình 1.7 Các giai đoạn phát triển của cá ngựa đen con .7

Hình 1.8 Cá ngựa chuyển trứng 10

Hình 1.9 DNA ti thể người 13

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 24

Hình 2.2 Đặc điểm hình thái ngoài và các chỉ tiêu phân loại cá ngựa .25

Hình 2.3 Đặc điểm hình thái phân loại các loài cá ngựa Việt Nam 26

Hình 3.1 Cá ngựa đen (Hippocampus kuda) 33

Hình 3.3 Cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus) 34

Hình 3.3 Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) 35

Hình 3.4 Cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix) 36

Hình 3.5 Cá ngựa thân trắng (Hippocampus kelloggi) 36

Hình 3.6 Cá ngựa vằn (Hippocampus comes) 37

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu cá ngựa .39

Hình 3.8 Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại vùng biển Nam Trung Bộ 44

Hình 3.9 Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của cá ngựa thu tại vùng biển Nam Trung Bộ 45

Hình 3.10 Cây đa dạng loài dựa trên gen CO1 mtDNA của cá ngựa đen Hippocampus kuda thu tại vùng biển Nam Trung Bộ; 48

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (cặp bazơ )

DNA, RNA Deoxyribonucleic acid, Ribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate

ITS2 rDNA Đoạn chèn số 2 giữa gen DNA ribosome

PCR Polymerase Chain Reaction

MỞ ĐẦU

Nước ta, với tiềm năng diện tích mặt biển lớn, có điều kiện rất lớn để phát triển nghề nuôi trồng và khai thác thủy sản Trong những năm qua, sự phát triển của nghề nuôi thủy sản giữ vị trí quan trọng trong cơ cấu GDP, góp phần giải quyết việc làm, nâng cao thu nhập và cải thiện đời sống nông ngư dân Bên cạnh các đối tượng truyền thống như cá tra, tôm sú, cá biển,…, cá ngựa gần đây, với ứng dụng nổi bật trong y học và sinh vật cảnh, đã và đang trở thành một đối tượng quan trọng và thu hút được

sự quan tâm của người nuôi và các nhà nghiên cứu

Việt Nam là một trong năm quốc gia xuất khẩu cá ngựa nhiều nhất thế giới Trung bình, Việt Nam bán khoảng 6,5 tấn cá ngựa (tương ứng với khoảng 2,2 triệu con) mỗi năm, chủ yếu là xuất sang Trung Quốc (Vincent, 1996; Giles và ctv, 2005) Mặc dù một

số loài cá ngựa đã được sản xuất giống và nuôi thương phẩm thành công nhưng phần lớn sản lượng được khai thác từ tự nhiên Những hạn chế trong công tác quản lý, quy hoạch và bảo vệ nguồn lợi thủy sản nói chung và cá ngựa nói riêng mà nguyên nhân chính là thiếu những nghiên cứu làm cơ sở cho việc xây dựng các giải pháp bảo tồn đã dẫn đến việc khai thác quá mức và cạn kiệt nguồn lợi cá ngựa nước ta Hậu quả là nhiều loài đã bị suy giảm nghiêm trọng về cả sản lượng và kích thước khai thác, ngày càng nhiều loài được liệt vào sách đỏ Việt Nam và quan trọng hơn là sự suy giảm mức độ đa dạng di truyền của nhiều quần thể cá ngựa nước ta Trong khi đó, cá ngựa vốn có khả năng sinh sản thấp, ít di chuyển, hình thức giao phối đặc biệt khiến chúng dễ dàng là đối tượng của các hình thức khai thác quá mức (Lourie và ctv, 1999)

Nghiên cứu về sinh sản nhân tạo cá ngựa nước ta đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu chuyên sâu liên quan đến điều tra nguồn lợi và đa dạng di truyền cá ngựa nước ta còn rất hạn chế, ngoại trừ công trình nghiên cứu của Lourie và ctv (1999) và nghiên cứu gần đây của Ngô Đăng Nghĩa và Đặng Thúy Bình (2009) Các nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài của cá ngựa và đa dạng di truyền của cá ngựa đen tại khu vực Nam Trung Bộ nước ta – vùng có nhiều loài cá ngựa phân bố tự nhiên vẫn chưa được đề cập

Trong tổng số 106 loài cá ngựa được công bố (McAllister, 1990), rất nhiều loài trong số đó bị định danh nhầm (McAllister, 1990; Eschmeyer, 1996) do thiếu tính đa

dạng về đặc điểm hình thái, thiếu mô tả gốc và khả năng ngụy trang bằng cách thay đổi màu sắc hoặc cấu trúc da để phù hợp với môi trường xung quanh (Lourie và ctv, 1999) Hiện nay, việc kết hợp đặc điểm hình thái và di truyền (giải trình tự các đoạn gen của DNA ti thể và DNA nhân) là phương pháp hữu hiệu trong nghiên cứu phân loại, mối quan hệ phát sinh loài và đa dạng di truyền của cá ngựa (Casey, 1999; Lourie và ctv,

2005; Teske và ctv, 2005; Pardo và ctv, 2007; Galbusera và ctv, 2007)

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài

của cá ngựa (Hippocampus spp.) và đa dạng di truyền của cá ngựa đen (Hippocampus kuda Bleeker, 1852) tại khu vực Nam Trung Bộ” được thực hiện

nhằm bước đầu xây dựng mối quan hệ loài và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của

cá ngựa tại khu vực Nam Trung Bộ nước ta

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài của đề tài:

(1) Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những thông tin khoa học liên quan đến mối quan

hệ phát sinh loài và đa dạng di truyền của cá ngựa đen nói riêng và cá ngựa nói chung (2) Đánh giá mức độ đa dạng di truyền cá ngựa khu vực Nam Trung Bộ, làm cơ

sở khoa học cho việc đề xuất các giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững nguồn lợi cá ngựa nước ta

Mục tiêu của đề tài: Mô tả đặc điển hình thái của một số loài cá ngựa thu được tại

khu vực Nam Trung Bộ Lập cây mô tả mối quan hệ phát sinh loài của các loài cá ngựa

(Hippocampus spp.) tại khu vực Nam Trung Bộ và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của cá ngựa đen (Hippocampus kuda)

Để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu này, đề tài tiến hành các nội dung sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các loài cá ngựa thu được tại khu vực Phú Yên và Khánh Hòa

2 Xây dựng cây phát sinh loài của các loài cá ngựa ven biển Nam Trung Bộ dựa trên phân tích đoạn gen 16S mtDNA và CO1 mtDNA

3 Nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của loài cá ngựa đen (H kuda) dựa trên

phân tích đoạn gen CO1 mtDNA

từ 10 - 20 cm Có loài có kích thước rất nhỏ như Hippocampus denise chỉ 2 cm, ngược lại, loài Hippocampus abdominalis có thể đạt đến kích thước 30 cm (Francis, 1988)

Phần lớn cá ngựa có màu nâu hoặc đen Tuy nhiên, một số loài có khả năng thay đổi

màu sắc như Hippocampus capensis, bình thường có màu nâu nhưng tùy theo điều

kiện môi trường, chúng có thể chuyển sang các màu như: đen, xanh, trắng hoặc vàng (Bell và ctv, 2003)

* Một số loài cá ngựa thường gặp ở biển Việt Nam:

Hình 1.1 Cá ngựa đen (H kuda) Hình 1.2 Cá ngựa gai (H spinosissimus)

[http://aquabird.com.vn] [http:// xttm.agroviet.gov.vn]

Hình 1.3 Cá ngựa vằn (H comes) Hình 1.4 Cá ngựa ba chấm (H trimaculatus)

[http://directsealife.com] [http://flora.coa.gov.tw]

Hình 1.5 Cá ngựa gai nhọn (H histrix) Hình 1.6 Cá ngựa thân trắng (H kelloggi)

[http://diverosa] [http://vinhuni.edu.vn]

1.1.2 Đặc điểm phân bố và môi trường sống

Cá ngựa thường phân bố ở các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới từ 50o vĩ Bắc đến 50o vĩ Nam, trong đó, Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương là nơi cá ngựa phân

bố nhiều Tất cả các loài cá ngựa đều sống đáy và gần đáy Phần lớn chúng sống ở độ

sâu dưới 30m, một số được tìm thấy ở độ sâu 40 – 100m như loài H kelloggi ở Malaysia (Choo và Liew, 2003) hay loài H minotaur ở Úc (Gomon, 1997)

Trong tự nhiên, cá ngựa thường phân bố ở các vùng sinh thái như thảm cỏ biển hoặc rừng ngập mặn (ở vùng cận nhiệt đới) và vùng rạn san hô (ở vùng nhiệt đới) Một

số loài có khả năng thích ứng tốt với cả môi trường nước lợ và nước mặn như H abdominalis (Foster và Vicent, 2004), H capensis (Whitfield, 1995), H kuda (Munro, 1967; Kuiter, 2000) và H reidi (Rosa và ctv, 2002) Một số loài thay đổi môi trường

sống tùy theo giai đoạn phát triển (Foster và Vicent, 2004) Ở giai đoạn ấu niên, loài

H comes thường sống ở các bãi rong mơ (Sargassum spp.) thuộc vùng dưới triều; khi

trưởng thành, chúng thường sống ở các vùng có san hô và bọt biển phát triển (Perante

1.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá ngựa thuộc nhóm bắt mồi ít chủ động Cá thường chọn các vị trí thuận lợi và rình con mồi bơi qua để đớp Mõm có dạng ống, không có răng và dạ dày, ruột thẳng Hầu hết các loài cá ngựa có phổ thức ăn tương đối giống nhau: artemia, mysid, copepoda, isopoda, luân trùng, amphipoda, cá nhỏ hoặc động vật không xương khác Trong đó, thành phần thức ăn là giáp xác chiếm tỷ lệ lớn trong khẩu phần thức ăn của cá ngựa và có sự thay đổi theo giai đoạn phát triển, với giai đoạn nhỏ ăn nhiều amphipoda

và giai đoạn lớn ăn các loài tôm thuộc bộ Caridea (Woods, 2002; Foster và Vicent, 2004; Kitsos và ctv, 2008) Ngoài tự nhiên cá ngựa không ăn thực vật như tảo và rong biển (Teixeira và Musick, 2001; Woods, 2002) Nhưng các mảnh cỏ biển được tìm thấy

trong ruột của một số loài như: H trimaculatus, H guttulatus, có thể do chúng bám vào

thức ăn của cá ngựa và theo vào trong ruột (Foster và Vicent, 2004; Kendrick và

Hyndes, 2005; Kitsos và ctv, 2008) Có ít nhất một loài đã biết (H guttulatus) ăn thức

ăn là các chất cặn bã, các hạt lơ lửng trong môi trường nước (Foster và Vicent, 2004)

Thức ăn cho cá ngựa giống trong nuôi nhân tạo là các loại động vật nổi còn sống và phù hợp với kích cỡ miệng, tuy nhiên, chúng cũng có thể ăn được các loại giáp xác đông lạnh như copepoda (Trương Sĩ Kỳ và ctv, 1993; Vicent, 1996; Woods, 2003b) Nghiên cứu về tính chọn lọc thức ăn trên cá ngựa, Payne và Rippingale (2000)

đã nhận thấy thức ăn thích hợp cho giai đoạn đầu của cá ngựa (mới nở - 35 ngày tuổi)

là nauplius của copepoda hay luân trùng Ương nuôi cá ngựa giống (H hippocampus)

bằng copepoda nauplii hay luân trùng cho kết quả sinh trưởng và tỷ lệ sống cao hơn so

với cho ăn bằng artemia nauplii do chúng được tiêu hóa tốt hơn (Hồ Thị Hoa, 2006;

Otero-Ferrer và ctv, 2010) Nghiên cứu của Woods và Valentino (2003) cho thấy có

thể thay thế artemia làm giàu bằng mysis (Amblyops kempi) đông lạnh trong nuôi cá ngựa Hippocampus abdominalis do hàm lượng axít béo không no (HUFA) và protein

cao của loại thức ăn này

Hoạt động bắt mồi của cá ngựa chủ yếu diễn ra vào ban ngày (6 – 18 giờ) điều này được đề cập trong nhiều nghiên cứu (Trương Sĩ Kỳ và ctv, 1996; Trương Sĩ Kỳ,

2000; Foster và Vincent, 2004) Một số loài cá ngựa như cá ngựa đen (Hippocampus kuda) có thể bắt mồi được vào ban đêm trong điều kiện chiếu sáng liên tục (Trần

Sương Ngọc và ctv, 1997; Trương Sĩ Kỳ, 2000)

1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

Có các nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng của cá ngựa, mối quan hệ giữa tuổi

và kích thước của chúng (Foster và Vicent, 2004) ngoại trừ công trình nghiên cứu của

Woods (2000) trên loài H abdominolis từ giai đoạn mới nở đến khi bắt đầu thành thục

(tương ứng với 52 tuần) Kết quả nghiên cứu của Job và ctv (2002) cho thấy, cá ngựa

đen (Hippocampus kuda) nuôi có tốc độ sinh trưởng 0,90 – 1,53 mm/ngày Theo

Trương Sĩ Kỳ (2000) sinh trưởng của cá ngựa đen nuôi theo thời gian được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Sinh trưởng của cá ngựa đen nuôi (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Các giai đoạn phát triển của cá ngựa con được mô tả chi tiết bởi Choo và Liew (2006) trên loài cá ngựa đen

Hình 1.7 Các giai đoạn phát triển của cá ngựa đen con

(a) 7.92–10.70 mm LS (1 ngày tuổi), (b) 7.08–12.79mm LS (3–4 ngày tuổi), (c) 11.57–14.40 mm LS (5–7 ngày tuổi), (d) 10.37–19.57 mm LS (9–12 ngày tuổi), (e) 20.19–21.76 mm LS (14–18 ngày tuổi), (f) 29.80–69.25 mm LS (25–51 ngày tuổi), (g) 49.19–107.88 mm LS (60–89 ngày tuổi), (h) 86.70–129.31 mm LS (98–124 ngày tuổi) (h i),

con cái, (h ii), con đực

1.1.5 Đặc điểm sinh sản

Việc xác định tuổi thành thục lần đầu của cá ngựa gặp rất nhiều khó khăn và

mới chỉ được đề cập trên một vài đối tượng Những loài có kích thước nhỏ như H zosterae thành thục lần đầu sau 3 tháng tuổi, trong khi các loài Hippocampus barbouri,

H fuscus, H hippocampus và H ingens thành thục sau 4 đến 5 tháng tuổi Một số loài khác như H spinosissimus, H trimaculatus, và H capensis thành thục muộn hơn sau 6

đến 12 tháng tuổi (Foster và Vincent, 2004)

Theo Foster và Vincent (2004), mùa vụ sinh sản và độ dài của mùa vụ sinh sản của cá ngựa có sự khác nhau giữa các quần thể tùy thuộc vào vùng địa lý và chịu sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như nhiệt độ, ánh sang và nguồn thức ăn sẵn có Mùa

sinh sản của H zosterae bị chi phối bởi độ dài chiếu sáng trong ngày hơn là ảnh hưởng của nhiệt độ Loài H trimaculatus ở Trung Quốc có đỉnh cao sinh sản từ tháng 3 đến

tháng 5, nếu trong điều kiện nhiệt độ được duy trì ở mức ổn định chúng có thể sinh sản quanh năm, hay ở Philippin nơi có nhiệt độ quanh năm tương đối ổn định thì người ta

bắt gặp cá thể mang trứng của loài H comes ở mọi thời điểm trong năm nhưng đỉnh cao

là từ tháng 7 đến tháng 12 (Foster và Vincent, 2004) Cá ngựa phân bố ở khu vực nhiệt đới có mùa vụ sinh sản dài hơn so với vùng cận nhiệt đới và các vùng nước lạnh, ngoại

trừ loài H abdominalis (Foster và Vincent, 2004; Vincent và Sadler, 1995).

Bảng 1.2 Độ dài mùa sinh sản của một số loài cá ngựa

Loài

Mùa sinh sản

Độ dài mùa sinh sản (tháng)

1979

Xu, 1985; Mi và ctv., 1998; Truong và Doan, 1994; Truong, 1994 Hầu hết các loài cá ngựa ở biển Việt Nam đều có mùa đẻ kéo dài quanh năm Tuy nhiên, tùy loài và vùng biển mà mùa đẻ rộ có thể thay đổi Đối với loài cá ngựa đen vùng biển Khánh Hòa mùa đẻ rộ thuộc các tháng 4, 5, 9, 10 và 12 (Trương Sĩ Kỳ

và ctv, 1993; Trương Sĩ Kỳ, 2000) Cá ngựa gai nhọn (H histrix) từ tháng 5 đến tháng

11 Cá ngựa ba chấm (H trimaculatus) từ tháng 3 đến tháng 5 và tháng 10 (Trương Sĩ

Kỳ và ctv, 1993; Trương Sĩ Kỳ, 1997, 2000) Cá ngựa loài H comes được tìm thấy đẻ

quanh năm ở Philippines nhưng số lượng con đực mang trứng đạt cực đại vào tháng 7

và tháng 12, tương ứng với mùa mưa (Perante và ctv, 2002) Sức sinh sản tuyệt đối của

cá ngựa phụ thuộc vào từng loài Mối quan hệ giữa sức sinh sản tuyệt đối của ngựa cái

và khả năng ấp của cá ngựa đực thể hiện ở bảng 2.3

Bảng 1.3 Sức sinh sản của cá ngựa cái và khả năng ấp của cá ngựa đực (Trương

ngược lại Thời gian phát triển phôi của loài H trimaculatus ở nhiệt độ 22,5 oC là 19 ngày, 26 oC là 16 ngày và chỉ còn 11 ngày ở 28,5 oC (Trương Sĩ Kỳ, 1997; Cai và ctv,

1984b) Các loài H abdominalis, H whitei cũng xảy ra hiện tượng tương tự (Weiss,

Hình 1.8 Cá ngựa chuyển trứng

(nguồn http://www.youtube.com/watch?v=MjM-ymELHhg và

http://www.youtube.com/watch?v=e8EfAODDoRo)

1.2 Hiện trạng nghề khai thác và nuôi cá ngựa ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất giống và nuôi cá ngựa

Việc nuôi cá ngựa với mục đích kinh tế được bắt đầu từ những năm 50 cho đến

năm 1980 Từ năm 1957, Trung Quốc đã nuôi hai loài cá ngựa H kuda và H trimaculatus Thức ăn sử dụng trong nuôi cá chủ yếu là ấu trùng giáp xác, cá ngựa

trưởng thành được cho ăn moi, ruốc, bột tôm tươi hay khô Trung Quốc có 7 cơ sở nuôi qui mô lớn ở vùng biển phía nam (Trương Sĩ Kỳ, 2006b)

Nghiên cứu nuôi cá ngựa thương phẩm trong điều kiện nhân tạo đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều quốc gia Thái Lan bắt đầu nghiên cứu nuôi cá ngựa thương phẩm trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhưng kết quả bước đầu chưa thật sự khả quan Tỷ lệ sống của cá không cao, nguồn thức ăn nuôi cá chưa chủ động được cũng như chưa cho cá ngựa tái phát dục trong điều kiện nuôi nhốt, cho nên chưa tạo được thế

hệ F2 Các nước Anh, Úc, Ấn Độ, Nam Phi, Bỉ, cũng đang tập trung nghiên cứu đặc điểm sinh học, sản xuất giống và nuôi thương phẩm loài cá này, nhưng kết quả đạt được còn rất hạn chế, chỉ thành công ở qui mô thí nghiệm (Trương Sĩ Kỳ, 2006a)

Việt Nam đã được tiến hành thử nghiệm cho sinh sản nhân tạo cá ngựa đen từ năm 1990 (Trương Sĩ Kỳ và ctv, 1996) Đến nay qui trình nuôi tương đối ổn định, đã chủ động sản xuất giống và nuôi thương phẩm ở qui mô đại trà Khánh Hòa là nơi có nghề nuôi cá ngựa phát triển tập trung nhất cả nước, các loài được nuôi chính như cá

ngựa đen (H kuda), cá ngựa ba chấm (H trimaculatus), cá ngựa vằn (H comes)

(Lourie và ctv, 1999) Mô hình nuôi chủ yếu là trong các bể kính có kích thước nhỏ hay bể composite, cá cũng có thể được nuôi trong các lồng trên biển (Hồ Thị Hoa, 2006) Kích thước cá thu hoạch thường 6 – 12 cm, và cá chủ yếu được bán dưới dạng

cá cảnh (Trương Sĩ Kỳ, 2006b)

Bảng 1.4 Danh mục một số loài cá ngựa được nuôi trên thế giới

Thái Lan, Indonesia,

Trương Sĩ Kỳ và Đoàn Thị Kim

Loan, 1994

H trimaculatus,

H fuscus, H kuda,

2.2.2 Tình hình đánh bắt và mua bán cá ngựa

Mặc dù là loài có giá trị kinh tế và nhu cầu xuất khẩu cao nhưng vấn đề phát triển và bảo tồn chúng vẫn chưa được quan tâm đúng mực Cá ngựa được xuất khẩu dưới dạng sống và khô phục vụ cho các mục đích như làm thuốc chữa bệnh hay làm cảnh (Giles và ctv, 2006) Trong tự nhiên, cá ngựa được khai thác thông bằng cách lặn bắt hay sử dụng các thiết bị như lưới quét

Ở Việt Nam, việc điều tra và quản lý khai thác cá ngựa phục vụ cho mục đích thương mại đã được đánh giá Mặt dù tỷ lệ đánh bắt hàng ngày không lớn, nhưng mỗi năm vẫn có đến 6,5 tấn cá ngựa khô (khoảng 2,2 triệu con) được khai thác và tập trung chủ yếu ở 5 tỉnh ven biển Cá được thu mua bởi các thương lái ở địa phương, sau đó cung cấp cho các thị trường nội địa chính như Thành Phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng và

Đà Nẵng Tuy nhiên, phần lớn sản lượng cá khai thác được xuất khẩu sang thị trường Trung Quốc, chủ yếu là các tỉnh gần biên giới với nước ta, trong đó phải kể đến tỉnh Quảng Tây Các quy định về phương pháp và kích cỡ cá khai thác ở nước ta còn thiếu

và chưa rõ ràng

Dựa vào phương pháp hình thái và di truyền, Lourie và ctv (1999) đã chỉ ra có tổng cộng 7 loài cá ngựa được tìm thấy trong lãnh hải Việt Nam Chúng chủ yếu phân

bố ở các khu vực biển có rạng san hô hay thảm cỏ biển phát triển và cả các cửa sông ven biển Trong tổng số 7 loài thì có 3 loài được thị trường ưa chuộng bao gồm

Hippocampus spinosissimus, H trimaculatus và H kuda

1.3 Đa dạng di truyền ở cá ngựa và một số loài thủy sinh vật

1.3.1 DNA ti thể và nghiên cứu di truyền quần thể

DNA ti thể (mitochondrial DNA-mtDNA) là một hệ gen độc lập, thường là mạch vòng, được định vị trong ti thể Bộ gen ti thể có cấu tạo xoắn kép, trần, mạch vòng với 2 chức năng chủ yếu: mã hóa nhiều thành phần của ti thể và mã hóa cho một

số protein tham gia vào chuỗi chuyền điện tử Có khoảng một vài trăm ti thể trên một

tế bào Mỗi ti thể có nhiều bản sao DNA Số lượng tổng số của DNA ti thể so với DNA nhân là rất nhỏ (<1%)

Hình 1.9 DNA ti thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein Mũi tên chỉ các vùng gen được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại

DNA bộ gen và DNA ti thể có nguồn gốc tiến hóa và kích thước khác nhau Do kích thước của hệ gen nhân là rất lớn, việc sử dụng các gen trong nhân làm đối tượng nghiên cứu đa dạng di truyền có nhiều nhược điểm Gen nhân có tần số đột biến thấp, mặt khác chúng lại được di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn Bởi vậy, DNA ti thể với những lợi thế của mình như số lượng alen ít (chỉ bằng

1/4 so với hệ gen nhân), tần số đột biến cao (cao hơn gấp 3 lần so với gen 12S và 18S của DNA ribosome), di truyền theo dòng mẹ, không tái tổ hợp, số lượng bản sao lớn

và khá đồng nhất, đã, đang và sẽ là công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về

di truyền quần thể và phát sinh chủng loài (Song và ctv,1998, Ballard và Witlock, 2004)

Hệ gen ti thể gồm có hai vùng chức năng chính: vùng mã hóa chiếm tới 93% hệ gen ti thể và vùng còn lại được gọi là vùng siêu biến (vùng điều khiển) không được dịch mã, chứa trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản của chuỗi nặng và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gen trong vùng mã hóa Vùng siêu biến có tốc

độ tiến hóa nhanh hơn nhiều so với các vùng khác của hệ gen ti thể, vì vậy nó là vùng thích hợp và có giá trị nhất trong phân tích di truyền quần thể, đặc biệt là đối với các nghiên cứu biến đổi di truyền bên trong loài (Brown và ctv, 1979) Do đó, xác định và

so sánh trình tự mtDNA nhất là trình tự vùng siêu biến là phương pháp có độ tin cậy cao được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền quần thể Chúng không chỉ được

sử dụng để phân biệt các loài trong cùng một giống mà còn phân biệt các nhóm địa lý trong cùng một loài (Wu và ctv, 2005) Trình tự của hệ gen ti thể của nhiều loài sinh vật đã được nghiên cứu và công bố trên ngân hàng gen (GenBank) là cơ sở quan trọng trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể sinh vật trên thế giới

Một ưu điểm khác của DNA ti thể là chúng hiện diện với một số lượng lớn trong tất cả các tế bào Vì vậy, việc tách chiết DNA ti thể rất dễ dàng ngay cả với một lượng mẫu nhỏ và không được bảo quản trong điều kiện thích hợp Bên cạnh đó, DNA

ti thể không có các đoạn không mã hóa Các đoạn này vốn rất phổ biến trong DNA bộ gen, thường làm cho quá trình giải trình tự thêm phức tạp vì đôi khi cần phải tạo dòng

để thu được đoạn gen mong muốn tinh sạch (Tautz và ctv, 2003, Schander và Willasen, 2005) Việc khuếch đại các đoạn gen của DNA ti thể chỉ cần một số lượng giới hạn các đoạn mồi Trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) của DNA ti thể có thể định danh được đến loài

ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật ngoại trừ lớp Cnidaria (Herbert

và ctv, 2004) Đoạn gen này đã được đề nghị sử dụng như một mã vạch DNA (DNA barcoding) để nghiên cứu sự đa dạng sinh học của giới sinh vật (Herbet và ctv, 2003,

2004, Schander và Willasen, 2005)

Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ti thể trong nghiên cứu di truyền quần thể cũng

có cũng có một số giới hạn Đôi khi, trong những nghiên cứu phân loại, cây phát sinh loài dựa trên gen có thể không phản ánh đúng hệ thống phân loại của loài bởi vì sự phân nhánh của các giống loài có thể trước hoặc sau khi phân chia quần thể, thậm chí loài mới Hơn nữa, vì DNA ti thể di truyền theo dòng mẹ nên sự đa dạng có thể lớn và không nhất thiết phản ánh đúng sự đa dạng tại các vị trí khác của gen ở mức độ loài

Sự khác nhau về giới tính cũng sẽ ảnh hưởng đến sự đa dạng của DNA ti thể so với DNA bộ gen Vì vậy, người ta đề nghị nên sử dụng nhiều đoạn gen để có kết quả với

độ chính xác cao (Schander và ctv, 2005; Avise, 2009)

Bên cạnh đó, trình tự của các gen mã hóa thuộc DNA ribosome (28S, 5.8S và 18S) cũng như các gen không mã hóa (khoảng chèn giữa gen ITS1 & ITS2) cũng được

sử dụng rộng rãi trong phân loại và định danh loài (Cunningham và ctv, 1996, 2000) Tuy nhiên, tỉ lệ đột biến của DNA bộ gen thấp hơn khoảng 4 lần so với DNA ti thể Hơn nữa, nghiên cứu DNA bộ gen thường phức tạp hơn vì có xảy ra quá trình tái tổ hợp và những hiểu biết còn khá ít ỏi về cơ chế tiến hóa của chúng (Swofford và ctv, 1996)

1.3.2 Các phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể

Hầu hết các nghiên cứu di truyền quần thể đều tập trung trả lời câu hỏi: nguyên nhân nào gây nên sự khác biệt các quần thể ở các vùng địa lý khác nhau? Sự biến động

di truyền ở các quần đàn gây nên do nhân tố ngăn cách địa lý, sự thích nghi với môi trường Dần dần qua thời gian, quần thể tích lũy những đặc điểm riêng phù hợp với vùng địa lý sinh sống Loài mới hình thành sau khi trải qua một quá trình cách ly lâu dài và từ đây sẽ có con đường tiến hóa khác với quần thể ban đầu

Di truyền học quần thể nghiên cứu về sự phân bố những khác biệt di truyền trong các quần thể và những thay đổi của sự phân bố đó theo thời gian (Griffiths và ctv, 2000) Thay đổi về tần số một allen trong quần thể có thể là do ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên, khi tỷ lệ những cá thể mang một allen nào đó sống sót và sinh sản được cao hơn khiến allen này xuất hiện nhiều hơn trong quần thể qua thời gian

(Griffiths và ctv, 2000) Sự lạc dòng di truyền (genetic drift) cũng có thể diễn ra, khi

những sự kiện ngẫu nhiên làm biến đổi ngẫu nhiên tần số allen (Griffiths và ctv, 2000)

Trải qua nhiều thế hệ, bộ gen của các sinh vật có thể thay đổi, dẫn đến hiện tượng tiến hóa Đột biến và chọn lọc các đột biến có lợi giúp các loài tiến hóa và tồn tại tốt hơn trong môi trường của chúng, quá trình này gọi là thích nghi (Darwin, 1859) Những loài mới được tạo thành thông qua quá trình hình thành loài, quá trình thường có nguyên nhân

từ cách biệt địa lý dẫn đến những quần thể khác nhau trở nên cách ly về di truyền (Gavrilets, 2003) Việc ứng dụng các nguyên lý di truyền vào nghiên cứu sinh học quần thể và tiến hóa được xem là thuyết tiến hóa tổng hợp hiện đại

Khi các trình tự được cách ly và biến đổi trong quá trình tiến hóa, những khác biệt giữa các trình tự có thể được dùng như một đồng hồ phân tử để tính khoảng cách tiến hóa giữa chúng (Wolf và ctv, 2002) Những so sánh di truyền nhìn chung được xem như cách thức đúng đắn nhất để mô tả mối liên hệ giữa các loài - một tiến bộ so với việc so sánh các đặc tính kiểu hình vốn dễ nhầm lẫn trước đây Khoảng cách tiến hóa giữa các loài có thể được kết hợp tạo thành cây tiến hóa - những cây này miêu tả nguồn gốc chung và sự phân hướng của các loài qua thời gian, dù chúng không thể hiện được sự chuyển giao vật liệu di truyền giữa các loài không liên quan với nhau (được biết đến là sự chuyển gen ngang (Horizental gene transfer) và chủ yếu phổ biến

ở vi khuẩn)

Hiện nay, việc nghiên cứu di truyền quần thể và những biến động di truyền xảy

ra trong quá trình hình thành, phân hóa quần thể đang được sự quan tâm rộng rãi của các nhà sinh học, di truyền học và tiến hóa Để phát hiện sự phân hóa trong quần thể,

có rất nhiều các chỉ thị phân tử đã và đang được sử dụng như chỉ thị hình thái, protein (allozymes) Sự phát triển của hàng loạt các chỉ thị phân tử DNA là một cuộc cách mạng ảnh hưởng mạnh mẽ lên các nghiên cứu di truyền động vật Với những thỉ thị này, về mặt lý thuyết nó sẽ giúp nhà nghiên cứu có thể theo dõi và khai thác sự đa dạng di truyền trong một bộ gen Hiện nay, cùng với sự ra đời của kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) năm 1988, đã mở đầu cho hàng loạt chỉ thị DNA mới Các kỹ thuật DNA có thể ứng dụng trên nhiều mẫu mô với nhiều phương pháp bảo quản khác nhau Các chỉ thị DNA rất phong phú do sự đa dạng của DNA và chúng không lệ thuộc vào yếu tố môi trường Các chỉ thị DNA được dùng phổ biến hiện nay

là RFLP (restriction fragment length polymorphism), RADP (Random Amplified Polymorphic DNA), DNA ti thể, microsatellite, minisatellites, SSCP (Single Strand

Conformational Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SNP (Single Nucleotide Polymorphisms), và chỉ thị EST (Expressed Sequence Tag)… Trong đó, chỉ thị thông dụng nhất là microsatellites và SNP, tuy nhiên, các chỉ thị khác như AFLP và RFLP có thể được sử dụng để phân tích sự khác biệt giữa các quần thể (Mobley và ctv, 2011)

Sự kết hợp các đặc điểm hình thái và di truyền là công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu về phân loại và phát sinh loài, đặc biệt là đối với các giống loài thiếu sự đa dạng trong các đặc điểm hình thái như cá ngựa (Lourie và ctv, 1999; Ngô Đăng Nghĩa

và Đặng Thúy Bình, 2009) Là nhóm cá có tính bảo thủ cao về mặt hình thái, cá ngựa thiếu một số đặc điểm hình thái đặc trưng (vây bụng và vây đuôi) - thường dùng trong nghiên cứu phân loại cá nói chung Trong khi đó, những đặc điểm phân loại cá ngựa (tỷ lệ kích thước cơ thể, số lượng đốt thân) lại có tính biến dị cao và thường chồng lấn

và đan xen nhau giữa các loài (Louie và ctv, 1999) Mặt khác, do sự thiếu đa dạng trong đặc điểm hình thái (dấu hiệu phân loại ít và nhỏ lẻ), thiếu mô tả gốc và sự giả trang (camouflage) của cá ngựa bằng cách thay đổi màu sắc hoặc cấu trúc da để thích nghi với môi trường sống, đã gây ra nhiều khó khăn trong việc định danh các loài cá này (Knowlton, 1993; Ngô Đăng Nghĩa và Đặng Thúy Bình, 2009) Kết quả là, trong tổng 106 loài cá ngựa đã được định danh (McAllister, 1990), rất nhiều loài trong số đó

đã bị định danh nhầm Một số loài đã được đặt cùng tên trong khi chúng là loài khác Một số loài lại được đặt các tên khác nhau trong khi chúng cùng loài (McAllister, 1990; Eschmeyer, 1996)

Ứng dụng công nghệ di truyền trong định danh các loài sinh vật là một phương pháp hiện đại, chính xác và đang được áp dụng rộng rãi hiện nay Đặc trưng của phương pháp này là sử dụng các chỉ thị phân tử để nhận biết các allen quy định các đặc điểm hình thái nằm trên các locus khác nhau (Bartlett và Davidson, 1991; Powers, 1991; Duellman và Hillis, 1987) Đặc biệt, phân tử DNA ti thể đã được sử dụng như là chỉ thị trong vấn đề nghiên cứu phân loại và bảo tồn nhiều loài sinh vật (Avise, 1995; Moritz, 1994) Kỹ thuật phân tích hệ gen của ti thể (mtDNA) cho xây dựng mối quan

hệ phát sinh loài đã được xây dựng và ứng dụng hiệu quả (Avise, 1995; Mayer, 1994) trên nhiều nhóm thủy sinh vật, đặc biệt là cá (Sturmbauer và ctv, 1994) Các nghiên cứu về đa dạng di truyền của một số loài cá ngựa theo vùng địa lý đã được tiến hành

dựa trên việc giải trình tự đoạn gen của DNA ti thể ở nước ta cũng như trên thế giới trong những năm trở lại đây (Casey, 1999; Lourie và ctv, 2005; Testke và ctv, 2005; Pardo và ctv, 2007; Galbusera và ctv, 2007; Ngô Đăng Nghĩa và Đặng Thúy Bình, 2009) Tuy nhiên, việc bảo tồn các loài dựa trên điều kiện thực tế cần dựa trên các căn

cứ phân loại hình thái rõ ràng (Lourie và ctv, 1999)

1.3.3 Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài và đa dạng di truyền ở cá ngựa cũng như một số loài thủy sinh vật khác

Trong vài năm trở lại đây, việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền phân tử ngày càng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản và sinh thái học để đánh giá mức độ đa dạng di truyền và nghiên cứu các tính trạng số lượng và chất lượng nhằm nâng cao năng suất vật nuôi (Hiendleder và ctv, 2003; Kühn và ctv, 2003) Các chỉ thị (marker) phân tử (điện di allozyme, RADP, RLPD, microsatelite) và các kỹ thuật di truyền hiện đại (PCR, giải trình tự) đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, di truyền quần thể, sự phát sinh loài và định danh loài mới, cũng như phân biệt các loài cận giống Bằng các kỹ thuật hiện đại này, nghiên cứu về đa dạng di

di truyền và mối quan hệ phát sinh loài đã được thực hiện trên nhiều đối tượng thủy sinh vật như cá, giáp xác và thân mềm (Song và ctv, 2010; Kochzius và Nuryanto, 2008) Kết quả của các nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển các đối tượng này, đồng thời xây dựng quỹ gen phục vụ cho nghiên cứu đa dạng di truyền

Ở Việt nam, các nghiên cứu về cấu trúc di truyền quần thể và mối quan hệ phát sinh loài cũng được quan tâm nghiên cứu trong thời gian qua Tuy nhiên, các nghiên cứu trên các đối tượng nuôi thủy sản nhìn chung còn hạn chế so với động vật trên cạn, thực vật và vi sinh vật Các nghiên cứu tập trung vào một vài đối tượng có giá trị kinh tế cao

như tôm sú (Penaeus monodon) (Ngô Đăng Nghĩa và Đặng Thúy Bình, 2008; Nguyễn

và ctv, 2004), cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) (Hà và ctv, 2009), cá song da báo (Plectropomus leopardus) (Nguyễn và Đặng, 2010) Trong các nghiên cứu này, các tác

giả đánh giá mức độ đa dạng di truyền và xây dựng mối quan hệ phát sinh loài trong tương quan so sánh với các vùng biển khác ở nước ta cũng như trên thế giới

Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài và đa dạng di truyền cá ngựa đã được thực hiện bởi một số tác giả trong và ngoài nước thông qua việc phân tích các chỉ thị phân tử (microsatellite và mtDNA) kết hợp với các phân tích về hình thái Trong đó, nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài cá ngựa được nhiều tác giả đề cập (Wilson

và ctv, 2001, 2003) Lourie và ctv (1999) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của 7

loài cá ngựa thu tại Việt Nam (Hippocampus spinosissimus, H comes, H.trimaculatus,

H kuda, H kelloggi, H mohnikei và H histrix) dựa vào 354 bp của gen cytochrome b

mtDNA Casey và ctv (2004) dựa trên 1300 bp của phân tử cytochrome b, đã nghiên

cứu mối quan hệ phát sinh loài của 22 loài cá ngựa thuộc giống Hippocampus thu từ

Đại Tây Dương và Ấn Độ - Thái Bình Dương ghi nhận 69 kiểu đơn (haplotype) trên tổng số 93 cá thể Teske và ctv (2004) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của 32 loài cá ngựa dựa vào chuỗi 2317 bp của hệ gen ti thể mtDNA (16S, cytochrome b) và

hệ gen nhân (alsolase, S7) Theo Jones và ctv (2005), sử dụng gen cytochrome b (với

1141bp) của 22 loài cá ngựa thuộc giống Hippocampus và nhóm ngoại (gồm 2 loài Syngnathus acus và S floridae) từ Genbank được sử dụng để xây dựng cây phát sinh

loài Teske và ctv (2007) nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài của 13 loài cá ngựa (26 cá thể) với 5 chỉ thị phân tử (3 gen thuộc DNA ti thể là: vùng điều khiển, 16S, cytochrome b và 2 chỉ thị phân tử khác là: S7 và Aldolase) Woodall và ctv (2009)

phân tích vùng điều khiển và cytochrome b DNA ti thể của 4 loài (H erectus, H H hippocampus, H algiricus, H guttulatus) Kết quả thu được cây phát sinh loài với sự

phân tách rõ rệt các haplotype của từng loài

Nghiên cứu về sự đa dạng cá ngựa vùng biển Việt Nam được tiến hành từ những thập niên 90 (Lourie và ctv, 1999) Khi phân tích 354 bp, 14 kiểu hình đơn được phát hiện trên tổng số 23 mẫu nghiên cứu Sự khác biệt về kiểu hình là 7,2 – 19,4% trong khi sự khác biệt trong một haplotype là dưới 1% Trong số các loài thu

được, hai loài H spinosissimus (thuộc kiểu hình A) và loài H trimaculatus (kiểu hình

C) phổ biến nhất chiếm 44 – 86% số mẫu thu được tại các vùng nghiên cứu Nghiên cứu của Ngô Đăng Nghĩa và Đặng Thúy Bình (2009) về đa dạng di truyền của quần

thể cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao

(26 haplotype trên 48 cá thể) của quần thể cá ngựa gai ở Phú Quốc với 4 nhánh chính (lineage SpinoTH, lineage B, lineage C và lineage PF)

Kết hợp phương pháp hình thái và di truyền, Nickel và Elisabeth (2009) phát

hiện các quần thể cá ngựa (Hippocampus abdominalis) ở New Zealand có sự da dạng

di truyền cao trong khi ít có sự khác biệt về hình thái giữa chúng Kết quả nghiên cứu

trên loài Hippocampus kuda ở Thái Lan cho thấy mức độ đa dạng di truyền của cá

ngựa đen ở vùng biển này ở mức thấp thể hiện qua số nucleotide và kiểu hình đơn thấp

(Panithanarak và ctv, 2009) Kết quả này tương tự như nghiên cứu trên loài cá ngựa H trimaculatus ở Ấn Độ Dương; tuy nhiên, khi so sánh với các quần thể ở Thái Bình

Dương, chúng đa dạng hơn về các haplotype nhưng thấp hơn về nucleotide (Lourie và Vincent, 2004; Thangaraj và Lipton, 2010)

Một số các nghiên cứu về sự đa dạng loài cá ngựa theo sự phân bố địa lý đã được tiến hành tại vùng biển Ấn Độ-Thái Bình Dương (Teske và ctv, 2005) và vùng biển Đông Nam Á (Lourie và ctv, 2005) Theo Lourie và ctv (2005), 4 kiểu phân loài theo vùng địa lý ở vùng biển Đông Nam Á đã được quan sát thấy ở 4 loài cá ngựa

(Hippocampus spp.) với các đặc điểm sinh thái khác nhau Sự khác biệt về mặt di truyền

(dựa trên sự so sánh trình tự gen cytochrom b của DNA ti thể) liên quan có ý nghĩa thống kê với địa điểm thu mẫu (Φ ST = 0.190–0.810, P< 0.0001) và với khoảng cách địa

lý (Mantel’s r = 0.37–0.59, P < 0.019) Hai loài cá ngựa sinh sống ở vùng biển nông

(Hippocampus barbouri và H kuda) có mức độ đa dạng ít hơn so với hai loài cá ngựa sống ở vùng biển sâu (Hippocampusss spinosissimus và H trimaculatus) Sự giới hạn

các kiểu haplotype theo vùng địa lý ở Philippine có thể là do sự phân hóa hoặc/và do sự

di chuyển của quần thể theo thời gian Nghiên cứu chỉ ra rằng sự di chuyển và phân hóa quần thể là nguyên nhân chính tạo thành cấu trúc quần thể của hai loài cá ngựa sống ở vùng nước cạn Trong khi đó, sự mở rộng khu vực sinh sống và sự hạn chế phân tán và cách ly địa lý là những tác nhân quan trọng trong lịch sử hình thành quần thể của hai

loài cá ngựa sống ở vùng nước sâu H trimaculatus là loài có các haplotype phân bố rộng nhất (khoảng cách trung bình Dc = 1169 km), trong khi đó, H barbouri có sự phân

bố haplotype hẹp nhất (khoảng cách trung bình Dc = 67 km)

Bên cạnh đó, Teske và ctv (2005) nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nhóm cá

ngựa đen (H kuda) tại vùng biển Ấn Độ-Thái Bình Dương (Ấn độ, Malaysia, Indonesia và Philippine), H fuscus từ vùng biển Đỏ và H capensis từ Nam Phi Dữ

liệu từ DNA ti thể chỉ ra rằng tất cả các quần thể nghiên cứu đều có sự phân chia

nhưng khác nhau về khoảng thời gian Quần thể cá ngựa đen H kuda từ vùng biển Ấn

Độ được tìm thấy là phân hóa trong thời gian lâu nhất Trong khi đó, quần thể H fuscus từ vùng biển Đỏ mới phân hóa gần đây Tất cả những quần thể cá ngựa đều có

tổ tiên chung là một haplotype riêng lẻ và tỉ lệ di cư là rất thấp Hơn nữa, không có mối liên quan giữa di truyền và khoảng cách địa lý giữa các quần thể, chứng tỏ sự phân hóa quần đàn theo khoảng cách là rất nhỏ

1.3.4 Nghiên cứu di truyền và vấn đề bảo tồn cá ngựa

Là một trong những nước xuất khẩu cá ngựa lớn trên thế giới, mỗi năm nước ta xuất khoảng 5 tấn cá ngựa ra thị trường (Vincent, 1996) Với giá trị cao và các ứng dụng rộng rãi trong y học và giải trí, việc khai thác quá mức cho nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu đã dẫn đến sự suy giảm nguồn lợi về số lượng và kích thước cũng như cấu trúc của quần thể trong tự nhiên (Foster và Vincent, 2004; Scales, 2010) Mặt khác, do cá ngựa có khả năng sinh sản thấp, ít di chuyển, hình thức giao phối đặc biệt khiến chúng dễ dàng là đối tượng của việc khai thác quá mức (Lourie và ctv, 1999) Các công trình nghiên cứu và khảo sát sự đa dạng di truyền của các quần thể cá

ngựa H spinosissimus (Ngô Đăng Nghĩa và Đặng Thúy Bình, 2009) và nhiều quần thể

khác (Lourie và ctv, 1999) góp phần cung cấp cơ sở khoa học cho việc đánh giá nguồn lợi, xác định mức độ đa dạng thành phần loài và các giải pháp bảo tồn và phát triển nghề nuôi cá ngựa

Họ Syngnathidae cũng phải đối mặt với các thách thức về bảo tồn, trong đó, hệ sinh thái của nhiều loài thuộc vùng cửa sông hay các rạn san hô thường dễ bị tổn thương nhất dưới các tác động của con người (Pihl và ctv, 2006; Hughes và ctv, 2009; Shokri và ctv, 2009; Waycott và ctv, 2009; Scales, 2010) May mắn là nhiều loài thuộc

họ Syngnathidae phân bố rộng và phong phú ở nhiều khu vực cho nên chúng được xếp vào sự quan tâm ở các mức độ khác nhau (IUCN, 2010; Scales, 2010) Tuy nhiên, một

số loài nằm trong danh mục bảo tồn đặc biệt Chỉ thị phân tử cung cấp cơ sở quan trọng cho việc bảo tồn và quản lý chúng (Lopez và ctv, 2010) Bởi vì DNA có thể được tách chiết từ phần mô nào đó trên cơ thể, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, có thể đánh giá được các thông tin liên quan đến biến dị di truyền, kiểu gen trong quần thể, kích thước quần thể, mức độ gần gũi giữa các quần thể và sự tiến hóa của chúng

(Teske và ctv, 2003; L´opez và ctv, 2010; Mobley và ctv, 2010; Saarman và ctv, 2010) Hơn nữa, hiểu biết về các thông số của quần thể có thể giúp xây dựng các chiến lược quản lý và bảo tồn vốn gen của quần thể (Teske và ctv, 2003; Saarman và ctv, 2010)

Ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử trong bảo tồn các loài cá ngựa có nguy cơ

tuyệt chủng được thực hiện trên loài H capensis Teske và ctv (2003) nghiên cứu

dòng gen và đa dạng di truyền của loài cá ngựa này tại ba vùng khác nhau ở Nam Phi bằng phân tích DNA ti thể Kết quả cho thấy 2/3 quần thể có mức độ đa dạng di truyền cao thể hiện ở số lượng haplotype nhiều hơn quần thể còn lại, tuy nhiên chúng cũng mang những haplotype chung cho cả ba quần thể Nghiên cứu của Goswami và ctv

(2009) trên quần thể cá ngựa Hippocampus kuda và H trimaculatus ở Ấn Độ cho thấy

các quần thể ở phía Đông Nam và Tây Nam mang đặc điểm di truyền khác nhau thông qua giải trình tự phân tử cytochrome b Tác giả cho rằng việc sinh sản hay thả nuôi các quần thể này cần chú ý đến việc bảo tồn sự khác biệt giữa chúng Nghiên cứu về các ngựa đen được thực hiện ở Thái Lan dựa trên phân tích các quần thể từ biển Andaman

và Vịnh Thái Lan (Panithanarak và ctv, 2010) kết quả cho thấy có sự khác biệt di truyền giữa các quần thể

Các kỹ thuật sinh học phân tử và ứng dụng của chúng đã và đang là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu bảo tồn nhiều loài sinh vật (Avise, 1989; Haig, 1998; Frankham, 2010) Trong tương lai, các nghiên cứu bảo tồn đa dạng di truyền họ Syngnathidae vẫn dựa trên các dữ liệu về DNA ti thể, tuy nhiên, các chỉ thị phân tử khác như microsatellites có thể giúp xác định mối quan hệ giữa các biến dị di truyền giữa các quần thể cá ngựa có nguy cơ tuyệt chủng (Saarman và ctv, 2010) Sự kết hợp giữa phương pháp sinh học phân tử và hình thái là hướng đi hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền cá ngựa (Foster và Vincent, 2004; Scales, 2010) Các tiến bộ trong chỉ thị phân tử có thể đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp các dữ liệu cho việc nhận dạng một loài cá ngựa nào đó mà chúng được khai thác cho mục đích thương mại

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: mẫu cá ngựa được thu tại Khánh Hòa và Phú Yên Mẫu sau khi thu mua tại một số cảng cá, được xử lý và phân tích tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2010 đến tháng 3/2011

- Đối tượng nghiên cứu: một số loài cá ngựa (Hippocampus spp.) tại vùng biển Nam Trung

Bộ, Việt Nam, với hệ thống phân loại của Vincent, 1996 như sau:

Ngành động vật có xương sống Vertebrata

Lớp có xương Osteichthyes

Bộ cá gai Gasterosteformes

Họ cá chìa vôi Syngnathidae

Giống cá ngựa Hippocampus

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Mẫu cá ngựa

Cân, đo, chụp hình, mô tả đặc điểm hình thái, phân loại

Tách chiết DNA, PCR, điện di

Giải trình tự

Trình tự gen CO1

mtDNA từ Genbank

Trình tự gen CO1 mtDNA

Trình tự gen 16S mtDNA

Trình tự gen 16S mtDNA từ Genbank

Phân tích mối quan hệ phát sinh loài Phân tích đa dạng di truyền cá ngựa đen

Kết luận và đề xuất ý kiến

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

2.3.1.1 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu hình thái

Các mẫu cá ngựa còn sống hoặc tươi, sau khi thu mua, được bảo quản trong đá lạnh Mẫu cá ngựa được rửa bằng nước sạch và đặt lên khay đá để ráo nước Dùng thước đo có độ chính xác 1 mm để đo chiều dài cơ thể, chiều dài thân và đuôi, chiều dài của đầu và mõm của chúng (Hình 2.2) Mẫu cá sau khi đo chiều dài được xác định khối lượng bằng cân điện tử có độ chính xác là 0,01 g

Hình 2.2 Đặc điểm hình thái ngoài và các chỉ tiêu phân loại cá ngựa Chiều dài cơ thể (a), chiều dài thân (b) và đuôi (c), chiều dài đầu (d) và mõm (e) (Lourie và ctv, 1999)

B 5

Hình 2.3 Đặc điểm hình thái phân loại các loài cá ngựa Việt Nam (A) Cá ngựa

gai H spinosissimus, (B) cá ngựa vằn H comes, (C) Cá ngựa ba chấm H

trimaculatus, (D) Cá ngựa đen H kuda, (E) Cá ngựa thân trắng H kelloggi, (F)

Cá ngựa gai nhọn H histrix (Lourie và ctv, 1999)

Quan sát trực tiếp mẫu tươi bằng mắt thường và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số Cá ngựa được định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo Lourie và ctv

(1999), với các đặc điểm phân loại chính bao gồm: hình dạng cơ thể, chiều dài của mõm, chùm gai đỉnh đầu, số đốt xương vòng ở đuôi, hình dạng, mức độ phát triển của các gai trên thân và đuôi

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu di truyền

2.3.2.1 Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự

Các mẫu cá ngựa sau khi xác định hình thái và kích thước, được sử dụng cho các phân tích về di truyền DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể cá ngựa bằng bộ Kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất 2 µl của dung dịch tách chiết được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA) và CO1 mtDNA (Oxidase cytochrom c Subunit 1 mitochondrial DNA) Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

Gen Mồi xuôi Mồi ngược Nguồn

Gen 16S mt DNA : Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu

kỳ của 94oC trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 5 phút

Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 95oC trong 5 phút, sau đó là 35 chu

kỳ của 94oC trong 40 giây, 42oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 5 phút

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-rad)

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system

(Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất 1-2µl sản phẩm PCR đã tinh sạch được

tiến hành phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v 3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây, cuối cùng là 60°C trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems) Các trình tự được kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v 9

2.3.2.2 Phân tích đa dạng loài cá ngựa Hippocampus kuda dựa trên haplotype

Các trình tự của cá ngựa được kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ancbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Các trình tự được gióng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.0.1 (Hall, 1999), sử dụng tính năng Clustax và được kiểm tra lại và chỉnh sửa bằng mắt thường

Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể được tính bằng tổng số kiểu đơn - haplotype (k), số lượng của vị trí đa hình - polymorphic sites (s), đa dạng kiểu đơn - haplotype diversity (d) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity ()

2.3.2.3 So sánh trình tự các loài cá ngựa

Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính toán theo công thức (số nucleotide khác biệt/tổng số nucleotide gióng hàng x 100%)

2.3.2.4 Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analysis)

Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA và CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên) trong năm 2010 và 2011, cụ thể như sau:

Dữ liệu gen 16SmtDNA bao gồm 27 trình tự của cá ngựa trong đó 5 trình tự từ

nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự từ Genbank Trình tự của loài Syngnathoides biaculeatus từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại

Dữ liệu gen CO1 mtDNA bao gồm 26 trình tự trong đó 6 trình tự từ nghiên

cứu hiện tại và 20 trình tự từ Genbank Trình tự của loài Syngnathifomes sp từ

Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại

Thông tin về các trình tự, mã số gen của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.4

2.3.2.5 Phân tích di truyền quần thể loài cá ngựa đen Hippocampus kuda

Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen CO1 mtDNA của cá ngựa đen thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên) năm 2010 và

2011, bao gồm 31 trình tự trong đó 7 trình tự CO1 mtDNA của Hippocampus kuda từ nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự H kuda từ Genbank Trình tự của 2 loài cá ngựa H algiricus và H fisheries từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại (mã số gen được

trình bày ở bảng 2.4)

Phương pháp phân tích

Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa và đa dạng di truyền H kuda được

tiến hành dựa trên 3 thuật toán maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML)

và Bayesain inference (BI) Các phương pháp được phân tích bằng phần mềm PAUP 4.0 (Swofford, 2001) và MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck và Ronquist, 2001) Đối với thuật toán MP, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng Tuy nhiên, đối với thuật toán

ML, độ lặp lại là 100 vì tổng số trình tự nghiên cứu lớn Trước khi tiến hành thuật toán

ML và BI, các mô hình tiến hóa đã được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7 (Posada and Crandall, 1998) và MrModeltest 2.2 (Nylander, 2004), mô hình tối ưu và các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa cá ngựa và đa dạng di truyền cá ngựa đen

H kuda được trình bày ở bảng 2.2 và bảng 2.3

Bảng 2.2 Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích mối quan hệ

phát sinh loài của cá ngựa (Hippocampus spp.) (Modeltest 3.7, Akaike

Information Criterion)

Tổng số trình tự

Tổng số Nucleotide gióng hàng

Vị trí không đổi (Constant sites)

Vị trí không mang thông tin (Parsimony

uninformative)

Vị trí mang thông tin (Parsimony

informative)

Mô hình tiến hóa (Best fit model)

Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide

equilibrium frequency µ (A,C,G,T)

Phân bố gama (Gama distribution)

Bảng 2.3 Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích di truyền

quần thể Hippocampus kuda (Modeltest 3.7, Akaike Information Criterion)

Tổng số trình tự

Tổng số Nucleotide gióng hàng

Vị trí không đổi (Constant sites)

Vị trí không mang thông tin (Parsimony

uninformative)

Vị trí mang thông tin (Parsimony informative)

Mô hình tiến hóa (Best fit model)

Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium

Đối với thuật toán BI, các mô hình thay thế được tính toán Chương trình được chạy trên 4 kênh với 1 triệu thế hệ, với tần suất tính toán trên 100 thế hệ Phân tích được lặp lại 2 lần để xác định độ chính xác của phương pháp phân tích Giá trị tin cậy (posterior probability (PP) được biểu hiện trên các nhánh của cây tiến hóa (Huelsenbeck and Ronquist, 2001)