Loài cá ngựa gai H. spinosissimus Weber, 1913 Tên tiếng Anh: Hedgehog seahorse.
Giống như tên gọi, cá ngựa gai có đặc trưng trên cơ thể có khá nhiều gai. Những
gai ở vị trí đốt thân số 1, 4, 7, 11 thường dài hơn những gai dài trên phần đuôi. Trên mũi
không có gai hoặc gai rất nhỏ. Gai nằm trước chùm gai đỉnh đầu (coronet) ngắn. Chiều
dài chuẩn của cá ngựa gai trưởng thành vào khoảng 11 - 16 cm. Số lượng đốt xương vòng
trên cơ thể là 47 - 48 đốt, số lượng đốt đuôi là 36 - 37 đốt. Các vây lưng và vây ngực với
số lượng tia vây lần lượt là: 17 - 18; 16 - 19 (Hình 3.3). Các số liệu đo đạc của cá ngựa gai được trình bày ở bảng 3.1. Cá ngựa gai thường phân bố ở Hải Phòng, Khánh Hòa, Kiên Giang và Cà Mau (Lourie và ctv, 1999).
Hình 3.3. Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) 3.1.4. Cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix Kaup, 1856)
Loài cá ngựa gai nhọn Hippocampus histrix Kaup, 1856 Tên tiếng Anh: Thorny seahorse.
Cá ngựa gai nhọn có những đặc điểm dễ nhận dạng như: đỉnh đầu có chùm gai cao, các góc của đốt thân có gai dài và nhọn. Vây lưng và vây ngực đều có 18 tia vây.
Vây hậu môn rất nhỏ, chỉ có 4 tia vây. Cá ngựa gai nhọn cũng có nhiều màu sắc, các cá thể thu trong nghiên cứu này có màu nâu trên toàn bộ cơ thể nhưng phần lưng màu sậm
36
hơn phần bụng. Các cá thể khác có thể có màu hồng, đỏ, vàng... rất sặc sỡ. Chiều dài của
chúng có thể đạt 17 cm [http://en.wikipedia.org] nhưng trong nghiên cứu này các cá thể
thu được chỉ có kích thước 9 - 13 cm. Phần đuôi khá ngắn (khoảng 5 - 5,5 cm), chưa
bằng một nửa chiều dài chuẩn và chỉ có 35 đốt xương vòng (Hình 3.4). Cá ngựa gai
nhọn chủ yếu phân bố ở Khánh Hòa và Phú Yên (Lourie và ctv, 1999).
Hình 3.4. Cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix)
3.1.5. Cá ngựa thân trắng (Hippocampus kelloggi Jordan & Snyder, 1902)
Loài cá ngựa thân trắng H. kelloggi Jordan & Snyder, 1902
Tên tiếng Anh: Great seahorse, Kellogg’s Seahorse, Offshore Seahorse.
Cá ngựa thân trắng (H. kelloggi) là loài cá ngựa lớn nhất ở Việt Nam cũng như
trên thế giới, chúng có thể đạt chiều dài tới 30 cm. Cá ngựa thân trắng trong nghiên cứu này thường có chiều dài khoảng 15 - 25 cm.
37
Ngoài kích thước lớn hơn các loài cá ngựa khác, cá ngựa thân trắng còn dễ nhận
thấy thông qua màu trắng, kem hay vàng nhạt đặc trưng của cơ thể. Chùm gai đỉnh đầu nhô lên tương đối cao, tương đương với chùm gai của cá ngựa gai (H. spinosissimus). Phần đuôi khá dài với 40 đốt xương vòng và phần thân chỉ có 11 đốt. Dáng cơ thể thon hơn các loài khác (Hình 3.5) (kể cả con cái và con đực). Các số liệu đo đạc của cá
ngựa thân trắng được trình bày tại bảng 3.1. Cá ngựa thân trắng thường được tìm thấy
tại Đà Nẵng, Khánh Hòa, Phú Yên, Sóc Trăng (Lourie và ctv, 1999).
3.1.6. Cá ngựa vằn (Hippocampus comes Cantor, 1850)
Loài cá ngựa vằn H. comes Cantor, 1850 Tên tiếng Anh: Tiger tail seahorse.
Cá ngựa vằn có hình dạng ngoài dễ nhận biết với chiếc mõm thon nhỏ, dài và chiếc đuôi có vằn nổi bật kết hợp của các màu đen và vàng hoặc trắng và vàng giống như vằn của loài hổ. Tuy nhiên, đuôi khá ngắn với số lượng đốt xương vòng là 35 đốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chiều dài chuẩn của cơ thể khoảng 15 - 17 cm. Chùm gai đỉnh đầu gồm 4 - 5 gai nhô lên không cao. Vây lưng có 17 - 19 tia vây và vây ngực có 16 - 19 tia vây. Các gai trên thân loài cá ngựa vằn rất tù, da của chúng có dạng sần sùi (Hình 3.6).
Hình 3.6. Cá ngựa vằn (H. comes)
Các chỉ tiêu về kích thước, số lượng đốt và khối lượng thân cá ngựa cá ngựa
38
Bảng 3.1. Các thông số hình thái của cá ngựa (Hippocampus spp.)
Chỉ tiêu
phân loại H.comes H.histrix H.kelloggi H.kuda H.spinosissimus H.trimaculatus
Số mẫu (con) 5 7 12 21 15 17
KÍCH THƯỚC
(mm)
Chiều dài chuẩn 158±9,8 110±17 199±44 148±13 135±20 130±17
Chiều dài thân 42,7±2,2 31,9±1,5 54,7±2,4 38,5±1,5 35,1±1,6 32,5±1,4
Chiều dài đuôi 82,2±3,6 51,7±2,1 105,5±3,4 81,4±2,0 72,9±2,6 74,1±2,3
Chiều dài đầu 33,2±1,9 26,4±1,0 39,8±1,6 28,1±1,4 27,1±1,9 23,4±1,4
Chiều dài mõm 15,6±0,7 14,8±0,4 19,1±0,5 12,1±0,5 12,0±0,4 10,4±0,5
SỐ LƯỢNG Đốt xương vòng thân 11 11 11 11 11 11 Đốt xương vòng đuôi 35 35 40 36 37 41 KHỐI LƯỢNG (g) 11,4±0,7 7,7±1,2 12,6±2,8 11,1±1,0 10,3±1,5 6,8±0,9
(Số liệu trong bảng được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD)
(Chiều dài chuẩn = chiều dài đầu + chiều dài thân + chiều dài đuôi)
3.2. Đặc điểm di truyền cá ngựa 3.2.1. Khuếch đại DNA cá ngựa 3.2.1. Khuếch đại DNA cá ngựa
Sản phẩm của đoạn gen 16S mtDNA (được khuếch đại dựa vào đoạn mồi 16SF và 16SR) và đoạn gen CO1 mtDNA (được khuếch đại bằng đoạn mồi LCO và HCO)
được trình bày tại hình 3.7. Kết quả điện di là một băng đậm nét có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (530bp đối với gen 16S và 750bp đối với gen CO1). Điều
này cho thấy cặp mồi có tính đặc hiệu cao và chu trình nhiệt dùng trong nghiên cứu là tối ưu cho việc khuếch đại gen.
39
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu cá ngựa. M: marker 1kb (A): đoạn gen 16S mtDNA. Các giếng: 1 - H. trimaculatus, 2,3 - H.kuda,
4 - H. kelloggi, 5 – H. spinosissimus, 6 – H. comes, C - đối chứng âm.
(B): Đoạn gen CO1 mt DNA. Các giếng: 1 - H. trimaculatus, 2 - H. kuda, 3,4 –
H. kelloggi, 5 – H. spinosissimus, 6 – H. histrix, 7 – H. comes.
3.2.2. Mối quan hệ phát sinh loài của các loài cá ngựa (Hippocampus spp.)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng một phần trình tự DNA của cá ngựa
bao gồm các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA) và CO1 mtDNA để (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nghiên cứu mối quan hệ loài của 6 loài cá ngựa thuộc giống Hippocampus tại Việt
Nam (Hippocampus kuda, H. trimaculatus, H. kelloggi, H. comes, H. spinosissimus và H. histrix). Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng trình tự gen của các loài cá ngựa khác lấy
từ ngân hàng gen (Genbank) để khảo sát mối quan hệ tiến hóa.
3.2.2.1. Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA
Phân tích được tiến hành với 6 trình tự CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại Việt
Nam và 20 trình tự gen của các loài cá ngựa khác từ Genbank (trong đó loài
Syngnathiformes sp. được sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup)). Các thông tin về các
trình tự nghiên cứu (loài, mã số Genbank và nguồn tài liệu) được trình bày ở bảng 2.4. Các trình tự gen của 26 loài nói trên được xử lý bằng phần mềm Bioedit, trình tự của các loài có quan hệ gần gũi sẽ có nhiều vị trí gióng hàng tương tự nhau. Độ dài trung bình trình tự đoạn gen CO1 mtDNA sau khi gióng hàng là 651 cặp bazơ (bp) sau khi đã loại bỏ những đoạn trình tự không phù hợp. Mô hình tối ưu và các thông số cơ
B 5
40
bản của phân tích tiến hóa dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.2.
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa bằng 2
phần mềm PAUP 4.0 (với 2 thuật toán MP, ML) và MrBayes 3.1.2 (thuật toán BI) thu được cùng 1 cây phát sinh loài. Ba thuật toán (MP, ML và BI) biểu hiện mức độ chính
xác khác nhau thông qua giá trị bootstrap và giá trị tin cậy trên các nhánh cây. Giá trị
càng cao thì mức độ tin cậy càng lớn.
Trên cây phát sinh loài (Hình 3.8) ta thấy có 2 nhánh lớn A và B được phân
chia rõ rệt (thể hiện ở giá trị bootstrap và độ tin cậy khá cao (88/80/100)), nhánh C có 3 loài, còn lại các nhánh nhỏ nằm rải rác là các loài: H. guttulatus, H. abdominalis, H. barbouri, H. histrix, H. comes, H. subelongatus và H. angustus.
Những loài nào phát sinh cùng một nhánh sẽ có mối quan hệ gần gũi nhau hơn
so với các loài khác nhánh. Do đó, nhánh A gồm 8 loài (H. kuda, H. algiricus, H. fuscus, H. cf. borboniensis, H. reidi, H. ingens, H. fisheri và H. capensis) thì 3 cặp A1
(H. kuda và H. algiricus) A2 (H. fuscus và H. cf. borboniensis) và A3 (H. reidi và H. ingens) thể hiện sự gần gũi di truyền (trong từng cặp) nhiều hơn so với các loài khác cặp và so với các loài H. fisheri, H. capensis. Nhánh A1 thể hiện sự gần gũi với nhánh A2 hơn nhánh A3. Tuy nhiên, mức độ tin cậy đối với vị trí sắp xếp của mỗi cặp là khác nhau. Cặp A3 có mức độ tin cậy (100/90/100) cao hơn hẳn so với cặp A1
(50/50/100). Chứng tỏ vị trí của 2 loài H. kuda và H. algiricus thuộc cặp A1 còn có khả năng thay đổi trong những phân tích khác.
Tương tự như nhánh A, nhánh B gồm có 7 loài (H. kelloggi, H. zosterae, H. patagonicus, H. erectus, H. spinosissimus, H. queenslandicus và H. camelopardalis)
được chia thành các nhánh khác nhau. Từ nhánh lớn B, các loài phân chia thành các nhánh nhỏ B1 (H. kelloggi và H. zosterae), B2 (H. patagonicus và H. erectus) và B3 (H. spinosissimus và H. queenslandicus). B1 gần gũi với B2 hơn là B3 trong khi B1,
B2 và B3 lại tạo thành một nhánh thể hiện sự gần gũi với loài còn lại là H. comelopardalis.
Như vậy, mỗi khi tạo thêm được một nhánh thứ cấp thì mức độ gần gũi của các loài trong nhánh đó lại cao hơn. Các loài trong mỗi cặp B1, B2, B3 gần nhau về mặt di
41
truyền. Cặp B2 và B3 có mức độ tin cậy rất cao, lần lượt là 100/90/100 và
100/100/100. Ngược lại, cặp B1 (H. kelloggi và H. zosterae) lại có giá trị tin cậy rất
thấp (50/60/50), chứng tỏ 2 loài này có thể có vị trí khác thích hợp hơn.
Nhánh C chỉ gồm có 3 loài nhưng giá trị tin cậy là rất cao, từ 90% trở lên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó 2 loài H. trimaculatus và H. biocellatus thuộc cặp C1 có đoạn gen CO1 mtDNA tương đồng hơn so với loài còn lại là H. mohnikei.
Hai loài H. guttulatus và H. abdominalis gần với 2 nhánh A và B hơn nhánh C.
Tuy nhiên, các loài ở gốc cây tiến hóa (H. barbouri, H. histrix, H. comes và H. angustus) có vị trí không xác định nên có thể dễ dàng thay đổi ở các phân tích khác.
Các loài cá ngựa Việt Nam trong nghiên cứu này (H. kuda, H. kelloggi, H. spinosissimus, H. trimaculatus, H. histrix, H. comes) có vị trí trên cây phát sinh xen lẫn với các loài cá ngựa trên thế giới. (Cá ngựa đen H. kuda thuộc cặp A1, gần với loài
H. algiricus; cá ngựa thân trắng H. kelloggi thuộc cặp B1, gần với loài H. zosterae; cá ngựa gai H. spinosissimus thuộc cặp B3, được xếp với loài H. queenslandicus; cá ngựa
ba chấm H. trimaculatus thuộc cặp C1 cùng nhánh với loài H. biocellatus. Ngoài ra, các loài cá ngựa gai nhọn H. histrix và cá ngựa vằn H. comes có vị trí tương đối xa so
với các loài khác). Giá trị tương đồng giữa các trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sự tương đồng dựa trên gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam
H. spinosissimus H. histrix H. kelloggi H. trimaculatus H. kuda H. comes H. spinosissimus ID 0,890 0,933 0,870 0,913 0,887 H. histrix ID 0,887 0,890 0,881 0,917 H. kelloggi ID 0,887 0,923 0,890 H. trimaculatus ID 0,887 0,894 H. kuda ID 0,881
(Số liệu trong bảng là mức độ tương tự về trình tự gen CO1 mtDNA của các loài được so sánh).
Theo bảng 3.2, ta thấy mức độ tương đồng rất cao của các loài H. kelloggi và H. spinosissimus (0,933); H. kuda và H. kelloggi (0,923); H. comes và H. histrix (0,917);
42
gen CO1 mtDNA của các cặp loài này là trên 90% và mức độ khác biệt dưới 10%. Xét trên cây tiến hóa (Hình 3.8), cũng nhận thấy mức độ tương đồng như trên rất phù hợp
với vị trí sắp xếp của các loài cá ngựa này. Hai loài H. kelloggi và H. spinosissimus có mức độ tương đồng cao nhất, cùng nằm trên nhánh B; H. kuda và H. kelloggi, H. spinosissimus nằm trên 2 nhánh gần nhau là A và B. Còn 2 loài H. comes và H. histrix
cùng nằm ở gần gốc cây tiến hóa. Ngược lại, một số loài lại có mức độ tương đồng
thấp. Hai loài H. trimaculatus và H. spinosissimus có mức độ tương đồng thấp nhất
(0,870) nằm trên 2 nhánh riêng biệt là B và C (mức độ gần gũi của nhánh B và C (hay A và C) thấp hơn so với A và B). Một số cặp loài như H. trimaculatus và H. kelloggi; H. kuda và H. trimaculatus; H. comes và H. spinosissimus,...có mức độ tương đồng
(0,887) cũng như mức độ gần gũi trên cây tiến hóa là không cao.
3.2.2.2. Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA
Phân tích mối quan hệ loài được thực hiện với trình tự đoạn gen 16S mtDNA
của 5 loài cá ngựa trong nghiên cứu và 22 loài từ Genbank (trong đó, loài
Syngnathoides biaculeatus được chọn làm nhóm ngoại). Các thông tin về các trình tự
nghiên cứu (loài, mã số Genbank và nguồn tài liệu) được trình bày ở Bảng 2.4. Tương
tự đối với đoạn gen CO1 mtDNA, các trình tự gen của 27 loài nói trên được gióng hàng bằng phần mềm Bioedit. Độ dài trung bình trình tự đoạn gen 16S mtDNA của 27 loài sau khi gióng hàng và cắt bớt những đoạn không cần thiết là 491 cặp bazơ (bp). Mô hình tối ưu và các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa dựa trên trình tự gen 16S
mtDNA của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.2.
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen 16S mtDNA dựa trên 3 phương
pháp MP, ML và BI cho kết quả tương tự về cây phát sinh loài. Kết quả được trình bày
ở hình 3.9. với cây phát sinh loài thu được từ phân tích MP, ML và BI với giá trị
bootstrap (BT) và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán MP, ML và BI được biểu hiện trên các nhánh.
Cây phát sinh được chia thành 6 nhánh chính (D, E, F, G, H, I). Nhánh D và E là 2 nhánh phát sinh song song tạo thành “ngọn” của cây phát sinh. Các nhánh tiếp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
theo F, G, H có mức độ gần “gốc” tăng dần và nhánh I có vị trí tại “gốc cây”. Nhánh D
43
và trình tự trong nghiên cứu hiện tại), H. fuscus, H. capensis thuộc nhóm D1 có mức độ gần gũi di truyền khá cao (với giá trị tin cậy là 95/80/100). Tương tự nhóm D2 (H. reidi và H. ingens) có giá trị tin cậy là 95/85/100.
Phát sinh cùng gốc với nhánh D là nhánh E. Nhánh này chỉ có 3 loài, trong đó,
2 loài H. spinosissimusgb và H. queenlandicus có vị trí tương quan rất chặt chẽ với giá
trị tin cậy cao (99/95/100) và có quan hệ gần gũi với loài H. kelloggi. Cả 3 loài trên
đều xuất hiện tại nhánh B (Hình 3.8) cũng với sự sắp xếp gần gũi của H. spinosissimus
và H. queenlandicus. Còn ở nhánh F: 2 loài H. hippocampus và H. erectus có quan hệ
gần gũi, tiếp đến 2 loài này lại tạo quan hệ gần với loài H. zosterae, cuối cùng 3 loài này lại có quan hệ với loài H. guttulatus.
44
Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại vùng biển Nam Trung Bộ
Syngnathiformes sp. là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (MP, ML) và giá trị tin cậy (BI) được biểu hiện tại các nhánh. Các nhóm loài được hình thành từ
cây phát sinh loài được ký hiệu theo thứ tự.
A B B2 B1 C A1 A3 A2 B3 C1
45
Hình 3.9. Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của cá ngựa thu tại vùng biển Nam Trung Bộ
Loài Syngnathoides biaculeatus là nhóm ngoại. Các giá trị bootstrap (MP, ML) và giá trị tin cậy (BI) được biểu hiện tại các nhánh. Các nhóm loài hình thành từ
cây phát sinh loài được ký hiệu theo thứ tự.
F D H G I D1 E D2
46
Phát sinh cùng gốc với 3 nhánh D, E, F là nhánh G. Nhánh này có 5 loài, được
chia thành 2 nhóm. Nhóm thứ nhất gồm 3 loài H. comes, H. subelongatus và H. whitei, nhóm thứ 2 gồm 2 loài H. spinosissimus và H. barbouri. Các loài trong cùng nhóm có quan hệ gần hơn các loài khác nhóm. Loài H. spinosissimus được xuất hiện 2 lần, lần đầu tại nhánh E (đây là trình tự lấy từ Genbank, cá ngựa có nguồn gốc Thái Lan) và lần 2 tại nhánh G (trình tự của nghiên cứu hiện tại, thu mẫu tại Việt Nam). Cùng một loài nhưng có vị trí trên cây phát sinh cách xa nhau, có thể do sự đa dạng di truyền lớn
hoặc có sự sai khác về hình thái ở loài cá ngựa gai tại Việt Nam.
Nhánh H có cùng gốc với cả 4 nhánh trên và vị trí sắp xếp của 3 loài trong
nhánh này tương tự như nhánh E. Tức là có 2 loài cùng nhánh (H. mohnikei và H. coronatus) có quan hệ với loài còn lại là H. trimaculatus. Nhánh cuối cùng là nhánh I, phát sinh tại gốc. 2 loài trong nhánh I có quan hệ gần gũi với nhau nhưng khác biệt
nhiều so với các loài trong những nhánh khác, đặc biệt là nhánh D và E.
Khi so sánh cây phát sinh dựa trên đoạn gen 16S mtDNA với cây phát sinh dựa trên đoạn gen CO1 mtDNA, có thể dễ dàng nhận thấy tất cả những loài thuộc nhánh D