Các mẫu cá ngựa sau khi xác định hình thái và kích thước, được sử dụng cho
các phân tích về di truyền. DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể cá ngựa
bằng bộ Kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của
nhà sản xuất. 2 µl của dung dịch tách chiết được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA) và CO1 mtDNA (Oxidase cytochrom c Subunit 1 mitochondrial DNA). Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR Gen Mồi xuôi Mồi ngược Nguồn
16S mtDNA 16SF-5′ CCGGTCTGAACT CAGATCACG T-3′ 16SR-5′GTTTACCAA AAACATGGCTTC - 3′ Espiritu và ctv, 2001 CO1 mtDNA LCO 5'GGTCAACAAATCA TAAAGATATTGG-3' HC0 5'TAAACTTCAGG GTGACCAAAAAATCA-3' Folmer và ctv, 1994
Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 50µl (gồm 2µl khuôn DNA, 5 µl Taq
buffer 1X, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 2 µM mỗi mồi (10mM), 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl) và H20 cho đủ thể tích). Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ:
Gen 16S mt DNA : Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu
kỳ của 94oC trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là
bước kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 95oC trong 5 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94oC trong 40 giây, 42oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước
28
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide. Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-rad).
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất. 1-2µl sản phẩm PCR đã tinh sạch được
tiến hành phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây, cuối cùng là 60°C trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI
Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ
thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v. 9.