Các mẫu cá ngựa còn sống hoặc tươi, sau khi thu mua, được bảo quản trong đá
lạnh. Mẫu cá ngựa được rửa bằng nước sạch và đặt lên khay đá để ráo nước. Dùng
thước đo có độ chính xác 1 mm để đo chiều dài cơ thể, chiều dài thân và đuôi, chiều
dài của đầu và mõm của chúng (Hình 2.2). Mẫu cá sau khi đo chiều dài được xác định
khối lượng bằng cân điện tử có độ chính xác là 0,01 g.
Hình 2.2. Đặc điểm hình thái ngoài và các chỉ tiêu phân loại cá ngựa. Chiều dài cơ thể (a), chiều dài thân (b) và đuôi (c), chiều dài đầu (d) và mõm (e) (Lourie và ctv, 1999).
26 B 5 A B D C E 2.1.2. Phương pháp định danh
Hình 2.3. Đặc điểm hình thái phân loại các loài cá ngựa Việt Nam (A) Cá ngựa
gai H. spinosissimus, (B) cá ngựa vằn H. comes, (C) Cá ngựa ba chấm H. trimaculatus, (D) Cá ngựa đen H. kuda, (E) Cá ngựa thân trắng H. kelloggi, (F)
Cá ngựa gai nhọn H. histrix (Lourie và ctv, 1999).
Quan sát trực tiếp mẫu tươi bằng mắt thường và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ
27
(1999), với các đặc điểm phân loại chính bao gồm: hình dạng cơ thể, chiều dài của
mõm, chùm gai đỉnh đầu, số đốt xương vòng ở đuôi, hình dạng, mức độ phát triển của các gai trên thân và đuôi.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu di truyền
2.3.2.1. Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự
Các mẫu cá ngựa sau khi xác định hình thái và kích thước, được sử dụng cho
các phân tích về di truyền. DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể cá ngựa
bằng bộ Kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của
nhà sản xuất. 2 µl của dung dịch tách chiết được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA) và CO1 mtDNA (Oxidase cytochrom c Subunit 1 mitochondrial DNA). Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR Gen Mồi xuôi Mồi ngược Nguồn
16S mtDNA 16SF-5′ CCGGTCTGAACT CAGATCACG T-3′ 16SR-5′GTTTACCAA AAACATGGCTTC - 3′ Espiritu và ctv, 2001 CO1 mtDNA LCO 5'GGTCAACAAATCA TAAAGATATTGG-3' HC0 5'TAAACTTCAGG GTGACCAAAAAATCA-3' Folmer và ctv, 1994
Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 50µl (gồm 2µl khuôn DNA, 5 µl Taq
buffer 1X, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 2 µM mỗi mồi (10mM), 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl) và H20 cho đủ thể tích). Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ:
Gen 16S mt DNA : Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu
kỳ của 94oC trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là
bước kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 95oC trong 5 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94oC trong 40 giây, 42oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước
28
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide. Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-rad).
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất. 1-2µl sản phẩm PCR đã tinh sạch được
tiến hành phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây, cuối cùng là 60°C trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI
Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ
thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v. 9.
2.3.2.2. Phân tích đa dạng loài cá ngựa Hippocampus kuda dựa trên haplotype
Các trình tự của cá ngựa được kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ancbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Các trình tự được gióng hàng bằng phần mềm BioEdit
7.0.1 (Hall, 1999), sử dụng tính năng Clustax và được kiểm tra lại và chỉnh sửa bằng
mắt thường.
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể được tính bằng tổng số
kiểu đơn - haplotype (k), số lượng của vị trí đa hình - polymorphic sites (s), đa dạng
kiểu đơn - haplotype diversity (d) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity ().
2.3.2.3. So sánh trình tự các loài cá ngựa
Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính
toán theo công thức (số nucleotide khác biệt/tổng số nucleotide gióng hàng x 100%).
2.3.2.4. Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analysis)
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA và CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên)
trong năm 2010 và 2011, cụ thể như sau:
Dữ liệu gen 16SmtDNA bao gồm 27 trình tự của cá ngựa trong đó 5 trình tự từ
nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự từ Genbank. Trình tự của loài Syngnathoides biaculeatus từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại.
29
Dữ liệu gen CO1 mtDNA bao gồm 26 trình tự trong đó 6 trình tự từ nghiên cứu hiện tại và 20 trình tự từ Genbank. Trình tự của loài Syngnathifomes sp. từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại.
Thông tin về các trình tự, mã số gen của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.4.
2.3.2.5. Phân tích di truyền quần thể loài cá ngựa đen Hippocampus kuda
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen CO1 mtDNA
của cá ngựa đen thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên) năm 2010 và
2011, bao gồm 31 trình tự trong đó 7 trình tự CO1 mtDNA của Hippocampus kuda từ
nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự H. kuda từ Genbank. Trình tự của 2 loài cá ngựa H. algiricus và H. fisheries từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại (mã số gen được trình bày ở bảng 2.4).
Phương pháp phân tích
Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa và đa dạng di truyền H. kuda được
tiến hành dựa trên 3 thuật toán maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Bayesain inference (BI). Các phương pháp được phân tích bằng phần mềm PAUP
4.0 (Swofford, 2001) và MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck và Ronquist, 2001). Đối với
thuật toán MP, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng. Tuy nhiên, đối với thuật toán ML, độ lặp lại là 100 vì tổng số trình tự nghiên cứu lớn. Trước khi tiến hành thuật toán
ML và BI, các mô hình tiến hóa đã được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7
(Posada and Crandall, 1998) và MrModeltest 2.2 (Nylander, 2004), mô hình tối ưu và
các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa cá ngựa và đa dạng di truyền cá ngựa đen
30
Bảng 2.2. Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích mối quan hệ phát sinh loài của cá ngựa (Hippocampus spp.) (Modeltest 3.7, Akaike
Information Criterion).
Thông số Dữ liệu 16S Dữ liệu CO1
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony
uninformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony
informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T)
Phân bố gama (Gama distribution)
27 491 329 74 88 GTR+I+G 0.3430, 0.2035 0.1977, 0.2557 0.4620 26 651 442 42 167 HKY+I+G 0.3062, 0.2240 0.1335, 0.3364 1.6729
Bảng 2.3. Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích di truyền quần thể Hippocampus kuda (Modeltest 3.7, Akaike Information Criterion)
Thông số Dữ liệu gen CO1
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony
uninformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T)
Phân bố gama (Gama distribution )
31 648 584 36 28 HKY+G 0.2744, 0.2256 0.1630, 0.3369 0.9619
Đối với thuật toán BI, các mô hình thay thế được tính toán. Chương trình được
chạy trên 4 kênh với 1 triệu thế hệ, với tần suất tính toán trên 100 thế hệ. Phân tích
được lặp lại 2 lần để xác định độ chính xác của phương pháp phân tích. Giá trị tin cậy (posterior probability (PP) được biểu hiện trên các nhánh của cây tiến hóa
31
Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán
MP với độ lặp lại 100 lần. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn,
chúng tôi áp dụng phương pháp successive approximation approach (Sullivan và ctv, 2005) đối với thuật toán ML, xác định cây tiến hóa dựa trên mô hình tiến hóa và so sánh kết quả thu được với phương pháp phân tích MP và BI. Cây đa dạng loài được
biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView 1.6.6 (Page, 1996).
Bảng 2.4. Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA của các loài cá ngựa
Mã số Genbank Tài liệu tham khảo
Loài
CO1 16S CO1 16S
H. abdominalis GQ502118 AF355013 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. algiricus GQ502119 AY277302 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. angustus GQ502122 Lourie và ctv, 2009
H. barbouri GQ502123 AF354999 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. biocellatus GQ502125 Lourie và ctv, 2009
H. breviceps AY277287 Teske và ctv, 2003
H. camelopardalis GQ502127 AY277295 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. capensis GQ502129 AY277304 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. cf. borboniensis GQ502131 Lourie và ctv, 2009
H. comes* GQ502135 AF355000 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. coronatus AY277293 Teske và ctv, 2003
H. erectus GQ502137 DQ288359 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. fisheri GQ502139 DQ288370 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. fuscus GQ502140 DQ288371 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. guttulatus GQ502141 EU770588 Lourie và ctv, 2009 Lopez và ctv, 2008
H. hippocampus GU322416 Lopez và ctv, 2009
H. histrix* GQ502147 Lourie và ctv,2009
H. ingens GQ502148 DQ288365 Lourie và ctv,2009 Teske và ctv, 2005
H. kelloggi* GQ502151 FJ211369 Lourie và ctv,2009 Singh và ctv, 2008
H. kuda* FJ176586 AY277299 Singh và ctv, 2008 Teske và ctv, 2003
H. mohnikei GQ502159 AY277292 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. patagonicus GQ502160 Lourie và ctv, 2009
H. queenslandicus GQ502163 AY277297 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. reidi GQ502165 DQ288362 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. spinosissimus* GQ502167 DQ452302 Lourie và ctv, 2009 Sootanan và ctv, 2006
H. subelongatus GQ502170 AY277288 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. trimaculatus* EU930324 FJ541072 Singh và ctv, 2008 Singh và ctv, 2008
H. whitei AY277290 Teske và ctv, 2003
H. zosterae GQ502176 DQ288361 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
Syngnathiformes sp. HQ956421 Direct Submission,
2011
Syngnathoides
32 FJ583553 Steinke và ctv, 2008 FJ583551 Steinke và ctv, 2008 FJ583552 Steinke và ctv, 2008 GU805017 Steinke, D, 2010 GU805016 Steinke, D, 2010 GU805015 Steinke, D, 2010 GU805014 Steinke, D, 2010 GQ502154 Lourie và ctv, 2009 GQ502155 Lourie và ctv, 2009 GQ502156 Lourie và ctv, 2009 GQ502153 Lourie và ctv, 2009 GQ502152 Lourie và ctv, 2009 FJ541047 Singh và ctv, 2008 FJ541042 Singh và ctv, 2008 FJ176590 Singh và ctv, 2008 FJ176589 Singh và ctv, 2008 FJ176582 Singh và ctv, 2008 FJ176583 Singh và ctv, 2008 FJ176584 Singh và ctv, 2008 FJ176585 Singh và ctv, 2008 FJ176586 Singh và ctv, 2008 H. kuda FJ176587 Singh và ctv, 2008
33
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm hình thái các loài cá ngựa thuộc giống Hippocampus tại vùng biển Khánh Hòa và Phú Yên Khánh Hòa và Phú Yên
3.1.1. Cá ngựa đen (Hippocampus kuda Bleeker, 1852)
Ngành động vật có xương sống Vertebrata
Lớp có xương Osteichthyes
Bộ cá gai Gasterosteformes
Họ cá chìa vôi Syngnathidae Giống cá ngựa Hippocampus
Loài cá ngựa đen H. kuda Bleeker, 1852 Tên tiếng Anh: Sportted seahorse.
Cá ngựa đen thường dễ nhận dạng thông qua màu đen đặc trưng với các chấm
nhỏ li ti. Tuy nhiên, đôi khi chúng cũng mang một số màu khác như màu vàng, màu
nâu đỏ nhạt, màu cát, hoặc màu kem với các chấm tối màu tùy điều kiện môi trường và giới tính (con cái). Sự biến đổi màu sắc này giúp cá ngựa đen dễ dàng thích nghi với môi trường sống, để tránh kẻ thù hoặc bắt mồi. Lớp da của chúng không có nhiều gai
mà chỉ là dạng sần. Chùm gai đỉnh đầu khoảng 4-5 gai nhô lên có dạng tù, không dài và sắc nhọn. Tuy nhiên, một số cá thể cá ngựa đen có gai phát triển nên dễ nhầm lẫn
thành cá ngựa gai (H. spinosissimus) (Hình 3.1).
Hình 3.1. Cá ngựa đen (Hippocampus kuda). A-Cá thể thu tại Phú Yên; B-Cá thể thu ở Khánh Hòa.
B 5
34
Toàn thân có 47 đốt xương vòng, trong đó phần thân là 11 đốt và đuôi là 36 đốt.
Chiều dài mõm tương đối ngắn (khoảng 12 mm). Chiều dài chuẩn của cá ngựa đen trưởng thành thường là 13 - 16 cm (Kích thước cụ thể được trình bày ở bảng 3.1). Cá ngựa đen thường phân bố ở Huế, Khánh Hòa, Phú Yên (Lourie và ctv, 1999).
3.1.2. Cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus Leach, 1814)
Loài cá ngựa ba chấm H. trimaculatus Leach, 1814
Tên tiếng Anh: Flat-faced seahorse, low-crowned seahorse, hoặc three-spot seahorse.
Đặc điểm dễ nhận biết ở cá ngựa ba chấm là trên phần gốc các gai phía lưng
của các đốt thân thứ 1, 4, 7 có các chấm đen lớn (con đực thấy rõ hơn con cái). Tuy
nhiên, cũng rất dễ nhầm lẫn loài này với loài cá ngựa đen vì đôi khi các chấm đen này không xuất hiện rõ ràng và tất cả các gai trên thân đều thấp, tù, có dạng sần.
Hình 3.3. Cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus)
Chiều dài chuẩn khoảng 11 - 15 cm. Phần đầu của loài này khá ngắn, chiếm ít hơn 1/5 chiều dài chuẩn, trong khi đó các loài cá ngựa khác (như cá ngựa đen, cá ngựa
vằn, cá ngựa thân trắng,...) có phần đầu chiếm trên 1/5 chiều dài chuẩn. Chính vì thế
loài cá ngựa ba chấm còn được gọi là “cá ngựa đầu bẹt”. Gai đỉnh đầu ngắn, gần như
bằng phẳng. Tuy nhiên, loài này lại có đuôi dài nhất trong số các loài cá ngựa được tìm thấy tại vùng biển Nam Trung Bộ nói riêng và Việt Nam nói chung với phần thân chỉ
có 11 đốt và phần đuôi chiếm tới 40 - 41 đốt (Bảng 3.1). Trên vây lưng có 20 - 21 tia và vây ngực có 17 - 18 tia vây. Chúng thường có màu đen toàn thân hay màu vàng
35
cam. Cá ngựa ba chấm thường phân bố rộng rãi tại Hải Phòng, Huế, Khánh Hòa và Phú Yên (Lourie và ctv, 1999).
3.1.3. Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus Weber, 1913)
Loài cá ngựa gai H. spinosissimus Weber, 1913 Tên tiếng Anh: Hedgehog seahorse.
Giống như tên gọi, cá ngựa gai có đặc trưng trên cơ thể có khá nhiều gai. Những
gai ở vị trí đốt thân số 1, 4, 7, 11 thường dài hơn những gai dài trên phần đuôi. Trên mũi
không có gai hoặc gai rất nhỏ. Gai nằm trước chùm gai đỉnh đầu (coronet) ngắn. Chiều
dài chuẩn của cá ngựa gai trưởng thành vào khoảng 11 - 16 cm. Số lượng đốt xương vòng
trên cơ thể là 47 - 48 đốt, số lượng đốt đuôi là 36 - 37 đốt. Các vây lưng và vây ngực với
số lượng tia vây lần lượt là: 17 - 18; 16 - 19 (Hình 3.3). Các số liệu đo đạc của cá ngựa gai được trình bày ở bảng 3.1. Cá ngựa gai thường phân bố ở Hải Phòng, Khánh Hòa, Kiên Giang và Cà Mau (Lourie và ctv, 1999).
Hình 3.3. Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) 3.1.4. Cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix Kaup, 1856)
Loài cá ngựa gai nhọn Hippocampus histrix Kaup, 1856 Tên tiếng Anh: Thorny seahorse.
Cá ngựa gai nhọn có những đặc điểm dễ nhận dạng như: đỉnh đầu có chùm gai cao, các góc của đốt thân có gai dài và nhọn. Vây lưng và vây ngực đều có 18 tia vây.
Vây hậu môn rất nhỏ, chỉ có 4 tia vây. Cá ngựa gai nhọn cũng có nhiều màu sắc, các cá thể thu trong nghiên cứu này có màu nâu trên toàn bộ cơ thể nhưng phần lưng màu sậm
36
hơn phần bụng. Các cá thể khác có thể có màu hồng, đỏ, vàng... rất sặc sỡ. Chiều dài của
chúng có thể đạt 17 cm [http://en.wikipedia.org] nhưng trong nghiên cứu này các cá thể
thu được chỉ có kích thước 9 - 13 cm. Phần đuôi khá ngắn (khoảng 5 - 5,5 cm), chưa
bằng một nửa chiều dài chuẩn và chỉ có 35 đốt xương vòng (Hình 3.4). Cá ngựa gai
nhọn chủ yếu phân bố ở Khánh Hòa và Phú Yên (Lourie và ctv, 1999).
Hình 3.4. Cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix)
3.1.5. Cá ngựa thân trắng (Hippocampus kelloggi Jordan & Snyder, 1902)
Loài cá ngựa thân trắng H. kelloggi Jordan & Snyder, 1902
Tên tiếng Anh: Great seahorse, Kellogg’s Seahorse, Offshore Seahorse.
Cá ngựa thân trắng (H. kelloggi) là loài cá ngựa lớn nhất ở Việt Nam cũng như
trên thế giới, chúng có thể đạt chiều dài tới 30 cm. Cá ngựa thân trắng trong nghiên cứu này thường có chiều dài khoảng 15 - 25 cm.
37
Ngoài kích thước lớn hơn các loài cá ngựa khác, cá ngựa thân trắng còn dễ nhận
thấy thông qua màu trắng, kem hay vàng nhạt đặc trưng của cơ thể. Chùm gai đỉnh đầu nhô lên tương đối cao, tương đương với chùm gai của cá ngựa gai (H. spinosissimus).