Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA và CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên)
trong năm 2010 và 2011, cụ thể như sau:
Dữ liệu gen 16SmtDNA bao gồm 27 trình tự của cá ngựa trong đó 5 trình tự từ
nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự từ Genbank. Trình tự của loài Syngnathoides biaculeatus từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại.
29
Dữ liệu gen CO1 mtDNA bao gồm 26 trình tự trong đó 6 trình tự từ nghiên cứu hiện tại và 20 trình tự từ Genbank. Trình tự của loài Syngnathifomes sp. từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại.
Thông tin về các trình tự, mã số gen của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.4.
2.3.2.5. Phân tích di truyền quần thể loài cá ngựa đen Hippocampus kuda
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen CO1 mtDNA
của cá ngựa đen thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên) năm 2010 và
2011, bao gồm 31 trình tự trong đó 7 trình tự CO1 mtDNA của Hippocampus kuda từ
nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự H. kuda từ Genbank. Trình tự của 2 loài cá ngựa H. algiricus và H. fisheries từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại (mã số gen được trình bày ở bảng 2.4).
Phương pháp phân tích
Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa và đa dạng di truyền H. kuda được
tiến hành dựa trên 3 thuật toán maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Bayesain inference (BI). Các phương pháp được phân tích bằng phần mềm PAUP
4.0 (Swofford, 2001) và MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck và Ronquist, 2001). Đối với
thuật toán MP, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng. Tuy nhiên, đối với thuật toán ML, độ lặp lại là 100 vì tổng số trình tự nghiên cứu lớn. Trước khi tiến hành thuật toán
ML và BI, các mô hình tiến hóa đã được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7
(Posada and Crandall, 1998) và MrModeltest 2.2 (Nylander, 2004), mô hình tối ưu và
các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa cá ngựa và đa dạng di truyền cá ngựa đen
30
Bảng 2.2. Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích mối quan hệ phát sinh loài của cá ngựa (Hippocampus spp.) (Modeltest 3.7, Akaike
Information Criterion).
Thông số Dữ liệu 16S Dữ liệu CO1
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony
uninformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony
informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T)
Phân bố gama (Gama distribution)
27 491 329 74 88 GTR+I+G 0.3430, 0.2035 0.1977, 0.2557 0.4620 26 651 442 42 167 HKY+I+G 0.3062, 0.2240 0.1335, 0.3364 1.6729
Bảng 2.3. Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích di truyền quần thể Hippocampus kuda (Modeltest 3.7, Akaike Information Criterion)
Thông số Dữ liệu gen CO1
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony
uninformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T)
Phân bố gama (Gama distribution )
31 648 584 36 28 HKY+G 0.2744, 0.2256 0.1630, 0.3369 0.9619
Đối với thuật toán BI, các mô hình thay thế được tính toán. Chương trình được
chạy trên 4 kênh với 1 triệu thế hệ, với tần suất tính toán trên 100 thế hệ. Phân tích
được lặp lại 2 lần để xác định độ chính xác của phương pháp phân tích. Giá trị tin cậy (posterior probability (PP) được biểu hiện trên các nhánh của cây tiến hóa
31
Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán
MP với độ lặp lại 100 lần. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn,
chúng tôi áp dụng phương pháp successive approximation approach (Sullivan và ctv, 2005) đối với thuật toán ML, xác định cây tiến hóa dựa trên mô hình tiến hóa và so sánh kết quả thu được với phương pháp phân tích MP và BI. Cây đa dạng loài được
biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView 1.6.6 (Page, 1996).
Bảng 2.4. Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA của các loài cá ngựa
Mã số Genbank Tài liệu tham khảo
Loài
CO1 16S CO1 16S
H. abdominalis GQ502118 AF355013 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. algiricus GQ502119 AY277302 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. angustus GQ502122 Lourie và ctv, 2009
H. barbouri GQ502123 AF354999 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. biocellatus GQ502125 Lourie và ctv, 2009
H. breviceps AY277287 Teske và ctv, 2003
H. camelopardalis GQ502127 AY277295 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. capensis GQ502129 AY277304 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. cf. borboniensis GQ502131 Lourie và ctv, 2009
H. comes* GQ502135 AF355000 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. coronatus AY277293 Teske và ctv, 2003
H. erectus GQ502137 DQ288359 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. fisheri GQ502139 DQ288370 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. fuscus GQ502140 DQ288371 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. guttulatus GQ502141 EU770588 Lourie và ctv, 2009 Lopez và ctv, 2008
H. hippocampus GU322416 Lopez và ctv, 2009
H. histrix* GQ502147 Lourie và ctv,2009
H. ingens GQ502148 DQ288365 Lourie và ctv,2009 Teske và ctv, 2005
H. kelloggi* GQ502151 FJ211369 Lourie và ctv,2009 Singh và ctv, 2008
H. kuda* FJ176586 AY277299 Singh và ctv, 2008 Teske và ctv, 2003
H. mohnikei GQ502159 AY277292 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. patagonicus GQ502160 Lourie và ctv, 2009
H. queenslandicus GQ502163 AY277297 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. reidi GQ502165 DQ288362 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. spinosissimus* GQ502167 DQ452302 Lourie và ctv, 2009 Sootanan và ctv, 2006
H. subelongatus GQ502170 AY277288 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. trimaculatus* EU930324 FJ541072 Singh và ctv, 2008 Singh và ctv, 2008
H. whitei AY277290 Teske và ctv, 2003
H. zosterae GQ502176 DQ288361 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
Syngnathiformes sp. HQ956421 Direct Submission,
2011
Syngnathoides
32 FJ583553 Steinke và ctv, 2008 FJ583551 Steinke và ctv, 2008 FJ583552 Steinke và ctv, 2008 GU805017 Steinke, D, 2010 GU805016 Steinke, D, 2010 GU805015 Steinke, D, 2010 GU805014 Steinke, D, 2010 GQ502154 Lourie và ctv, 2009 GQ502155 Lourie và ctv, 2009 GQ502156 Lourie và ctv, 2009 GQ502153 Lourie và ctv, 2009 GQ502152 Lourie và ctv, 2009 FJ541047 Singh và ctv, 2008 FJ541042 Singh và ctv, 2008 FJ176590 Singh và ctv, 2008 FJ176589 Singh và ctv, 2008 FJ176582 Singh và ctv, 2008 FJ176583 Singh và ctv, 2008 FJ176584 Singh và ctv, 2008 FJ176585 Singh và ctv, 2008 FJ176586 Singh và ctv, 2008 H. kuda FJ176587 Singh và ctv, 2008
33
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN