Là một trong những nước xuất khẩu cá ngựa lớn trên thế giới, mỗi năm nước ta
xuất khoảng 5 tấn cá ngựa ra thị trường (Vincent, 1996). Với giá trị cao và các ứng
dụng rộng rãi trong y học và giải trí, việc khai thác quá mức cho nhu cầu tiêu dùng
trong nước và xuất khẩu đã dẫn đến sự suy giảm nguồn lợi về số lượng và kích thước
cũng như cấu trúc của quần thể trong tự nhiên (Foster và Vincent, 2004; Scales, 2010). Mặt khác, do cá ngựa có khả năng sinh sản thấp, ít di chuyển, hình thức giao phối đặc
biệt khiến chúng dễ dàng là đối tượng của việc khai thác quá mức (Lourie và ctv, 1999). Các công trình nghiên cứu và khảo sát sự đa dạng di truyền của các quần thể cá ngựa H. spinosissimus (Ngô Đăng Nghĩa và Đặng Thúy Bình, 2009) và nhiều quần thể
khác (Lourie và ctv, 1999) góp phần cung cấp cơ sở khoa học cho việc đánh giá nguồn lợi, xác định mức độ đa dạng thành phần loài và các giải pháp bảo tồn và phát triển nghề nuôi cá ngựa.
Họ Syngnathidae cũng phải đối mặt với các thách thức về bảo tồn, trong đó, hệ
sinh thái của nhiều loài thuộc vùng cửa sông hay các rạn san hô thường dễ bị tổn
thương nhất dưới các tác động của con người (Pihl và ctv, 2006; Hughes và ctv, 2009; Shokri và ctv, 2009; Waycott và ctv, 2009; Scales, 2010). May mắn là nhiều loài thuộc họ Syngnathidae phân bố rộng và phong phú ở nhiều khu vực cho nên chúng được xếp vào sự quan tâm ở các mức độ khác nhau (IUCN, 2010; Scales, 2010). Tuy nhiên, một số loài nằm trong danh mục bảo tồn đặc biệt. Chỉ thị phân tử cung cấp cơ sở quan trọng cho việc bảo tồn và quản lý chúng (Lopez và ctv, 2010). Bởi vì DNA có thể được tách chiết từ phần mô nào đó trên cơ thể, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, có thể đánh giá được các thông tin liên quan đến biến dị di truyền, kiểu gen trong quần thể, kích thước quần thể, mức độ gần gũi giữa các quần thể và sự tiến hóa của chúng
22
(Teske và ctv, 2003; L´opez và ctv, 2010; Mobley và ctv, 2010; Saarman và ctv, 2010). Hơn nữa, hiểu biết về các thông số của quần thể có thể giúp xây dựng các chiến
lược quản lý và bảo tồn vốn gen của quần thể (Teske và ctv, 2003; Saarman và ctv, 2010).
Ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử trong bảo tồn các loài cá ngựa có nguy cơ
tuyệt chủng được thực hiện trên loài H. capensis. Teske và ctv (2003) nghiên cứu dòng gen và đa dạng di truyền của loài cá ngựa này tại ba vùng khác nhau ở Nam Phi bằng phân tích DNA ti thể. Kết quả cho thấy 2/3 quần thể có mức độ đa dạng di truyền cao thể hiện ở số lượng haplotype nhiều hơn quần thể còn lại, tuy nhiên chúng cũng
mang những haplotype chung cho cả ba quần thể. Nghiên cứu của Goswami và ctv (2009) trên quần thể cá ngựa Hippocampus kuda và H. trimaculatus ở Ấn Độ cho thấy các quần thểở phía Đông Nam và Tây Nam mang đặc điểm di truyền khác nhau thông qua giải trình tự phân tử cytochrome b. Tác giả cho rằng việc sinh sản hay thả nuôi các quần thể này cần chú ý đến việc bảo tồn sự khác biệt giữa chúng. Nghiên cứu về các ngựa đen được thực hiện ở Thái Lan dựa trên phân tích các quần thể từ biển Andaman và Vịnh Thái Lan (Panithanarak và ctv, 2010) kết quả cho thấy có sự khác biệt di truyền giữa các quần thể.
Các kỹ thuật sinh học phân tử và ứng dụng của chúng đã và đang là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu bảo tồn nhiều loài sinh vật (Avise, 1989; Haig, 1998; Frankham,
2010). Trong tương lai, các nghiên cứu bảo tồn đa dạng di truyền họ Syngnathidae vẫn dựa trên các dữ liệu về DNA ti thể, tuy nhiên, các chỉ thị phân tử khác như
microsatellites có thể giúp xác định mối quan hệ giữa các biến dị di truyền giữa các quần thể cá ngựa có nguy cơ tuyệt chủng (Saarman và ctv, 2010). Sự kết hợp giữa
phương pháp sinh học phân tử và hình thái là hướng đi hiệu quả trong nghiên cứu đa
dạng di truyền cá ngựa (Foster và Vincent, 2004; Scales, 2010). Các tiến bộ trong chỉ thị
phân tử có thể đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp các dữ liệu cho việc nhận dạng một loài cá ngựa nào đó mà chúng được khai thác cho mục đích thương mại.
23
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: mẫu cá ngựa được thu tại Khánh Hòa và Phú Yên. Mẫu sau khi thu mua tại một số cảng cá, được xử lý và phân tích tại Viện Công nghệ sinh học và
Môi trường - Trường Đại học Nha Trang.
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2010 đến tháng 3/2011.
- Đối tượng nghiên cứu: một số loài cá ngựa (Hippocampus spp.) tại vùng biển Nam Trung
Bộ, Việt Nam, với hệ thống phân loại của Vincent, 1996 như sau:
Ngành động vật có xương sống Vertebrata
Lớp có xương Osteichthyes
Bộ cá gai Gasterosteformes
Họ cá chìa vôi Syngnathidae Giống cá ngựa Hippocampus
24
2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Mẫu cá ngựa
Cân, đo, chụp hình, mô tả đặc điểm hình thái, phân loại
Tách chiết DNA, PCR, điện di
Giải trình tự Trình tự gen CO1 mtDNA từ Genbank Trình tự gen CO1 mtDNA Trình tự gen 16S mtDNA Trình tự gen 16S mtDNA từ Genbank
Phân tích mối quan hệ phát sinh loài
Phân tích đa dạng di truyền cá ngựa đen
25
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
2.3.1.1. Phương pháp xác định một số chỉ tiêu hình thái
Các mẫu cá ngựa còn sống hoặc tươi, sau khi thu mua, được bảo quản trong đá
lạnh. Mẫu cá ngựa được rửa bằng nước sạch và đặt lên khay đá để ráo nước. Dùng
thước đo có độ chính xác 1 mm để đo chiều dài cơ thể, chiều dài thân và đuôi, chiều
dài của đầu và mõm của chúng (Hình 2.2). Mẫu cá sau khi đo chiều dài được xác định
khối lượng bằng cân điện tử có độ chính xác là 0,01 g.
Hình 2.2. Đặc điểm hình thái ngoài và các chỉ tiêu phân loại cá ngựa. Chiều dài cơ thể (a), chiều dài thân (b) và đuôi (c), chiều dài đầu (d) và mõm (e) (Lourie và ctv, 1999).
26 B 5 A B D C E 2.1.2. Phương pháp định danh
Hình 2.3. Đặc điểm hình thái phân loại các loài cá ngựa Việt Nam (A) Cá ngựa
gai H. spinosissimus, (B) cá ngựa vằn H. comes, (C) Cá ngựa ba chấm H. trimaculatus, (D) Cá ngựa đen H. kuda, (E) Cá ngựa thân trắng H. kelloggi, (F)
Cá ngựa gai nhọn H. histrix (Lourie và ctv, 1999).
Quan sát trực tiếp mẫu tươi bằng mắt thường và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ
27
(1999), với các đặc điểm phân loại chính bao gồm: hình dạng cơ thể, chiều dài của
mõm, chùm gai đỉnh đầu, số đốt xương vòng ở đuôi, hình dạng, mức độ phát triển của các gai trên thân và đuôi.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu di truyền
2.3.2.1. Tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự
Các mẫu cá ngựa sau khi xác định hình thái và kích thước, được sử dụng cho
các phân tích về di truyền. DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể cá ngựa
bằng bộ Kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega) theo hướng dẫn của
nhà sản xuất. 2 µl của dung dịch tách chiết được dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA) và CO1 mtDNA (Oxidase cytochrom c Subunit 1 mitochondrial DNA). Trình tự các đoạn mồi được trình bày ở
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR Gen Mồi xuôi Mồi ngược Nguồn
16S mtDNA 16SF-5′ CCGGTCTGAACT CAGATCACG T-3′ 16SR-5′GTTTACCAA AAACATGGCTTC - 3′ Espiritu và ctv, 2001 CO1 mtDNA LCO 5'GGTCAACAAATCA TAAAGATATTGG-3' HC0 5'TAAACTTCAGG GTGACCAAAAAATCA-3' Folmer và ctv, 1994
Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 50µl (gồm 2µl khuôn DNA, 5 µl Taq
buffer 1X, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 2 µM mỗi mồi (10mM), 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl) và H20 cho đủ thể tích). Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình nhiệt độ:
Gen 16S mt DNA : Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu
kỳ của 94oC trong 40 giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây, cuối cùng là
bước kéo dài tại 72oC trong 5 phút.
Gen CO1 mtDNA: Biến tính ban đầu tại 95oC trong 5 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 94oC trong 40 giây, 42oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước
28
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide. Kết quả được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel tự động Geldoc và phần mềm Quantity One (Bio-rad).
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) như hướng dẫn của nhà sản xuất. 1-2µl sản phẩm PCR đã tinh sạch được
tiến hành phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây, cuối cùng là 60°C trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI
Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ
thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v. 9.
2.3.2.2. Phân tích đa dạng loài cá ngựa Hippocampus kuda dựa trên haplotype
Các trình tự của cá ngựa được kiểm chứng bằng chương trình BLAST (ancbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Các trình tự được gióng hàng bằng phần mềm BioEdit
7.0.1 (Hall, 1999), sử dụng tính năng Clustax và được kiểm tra lại và chỉnh sửa bằng
mắt thường.
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể được tính bằng tổng số
kiểu đơn - haplotype (k), số lượng của vị trí đa hình - polymorphic sites (s), đa dạng
kiểu đơn - haplotype diversity (d) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity ().
2.3.2.3. So sánh trình tự các loài cá ngựa
Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính
toán theo công thức (số nucleotide khác biệt/tổng số nucleotide gióng hàng x 100%).
2.3.2.4. Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa (phylogenetic analysis)
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen 16S mtDNA và CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên)
trong năm 2010 và 2011, cụ thể như sau:
Dữ liệu gen 16SmtDNA bao gồm 27 trình tự của cá ngựa trong đó 5 trình tự từ
nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự từ Genbank. Trình tự của loài Syngnathoides biaculeatus từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại.
29
Dữ liệu gen CO1 mtDNA bao gồm 26 trình tự trong đó 6 trình tự từ nghiên cứu hiện tại và 20 trình tự từ Genbank. Trình tự của loài Syngnathifomes sp. từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại.
Thông tin về các trình tự, mã số gen của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.4.
2.3.2.5. Phân tích di truyền quần thể loài cá ngựa đen Hippocampus kuda
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen CO1 mtDNA
của cá ngựa đen thu tại Nha Trang (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên) năm 2010 và
2011, bao gồm 31 trình tự trong đó 7 trình tự CO1 mtDNA của Hippocampus kuda từ
nghiên cứu hiện tại và 22 trình tự H. kuda từ Genbank. Trình tự của 2 loài cá ngựa H. algiricus và H. fisheries từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại (mã số gen được trình bày ở bảng 2.4).
Phương pháp phân tích
Phân tích mối quan hệ loài bằng cây tiến hóa và đa dạng di truyền H. kuda được
tiến hành dựa trên 3 thuật toán maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và Bayesain inference (BI). Các phương pháp được phân tích bằng phần mềm PAUP
4.0 (Swofford, 2001) và MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck và Ronquist, 2001). Đối với
thuật toán MP, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng. Tuy nhiên, đối với thuật toán ML, độ lặp lại là 100 vì tổng số trình tự nghiên cứu lớn. Trước khi tiến hành thuật toán
ML và BI, các mô hình tiến hóa đã được kiểm tra bằng phần mềm Modeltest 3.7
(Posada and Crandall, 1998) và MrModeltest 2.2 (Nylander, 2004), mô hình tối ưu và
các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa cá ngựa và đa dạng di truyền cá ngựa đen
30
Bảng 2.2. Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích mối quan hệ phát sinh loài của cá ngựa (Hippocampus spp.) (Modeltest 3.7, Akaike
Information Criterion).
Thông số Dữ liệu 16S Dữ liệu CO1
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony
uninformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony
informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T)
Phân bố gama (Gama distribution)
27 491 329 74 88 GTR+I+G 0.3430, 0.2035 0.1977, 0.2557 0.4620 26 651 442 42 167 HKY+I+G 0.3062, 0.2240 0.1335, 0.3364 1.6729
Bảng 2.3. Các thông số về trình tự và mô hình tiến hóa của phân tích di truyền quần thể Hippocampus kuda (Modeltest 3.7, Akaike Information Criterion)
Thông số Dữ liệu gen CO1
Tổng số trình tự
Tổng số Nucleotide gióng hàng Vị trí không đổi (Constant sites)
Vị trí không mang thông tin (Parsimony
uninformative)
Vị trí mang thông tin (Parsimony informative)
Mô hình tiến hóa (Best fit model)
Tần suất cân bằng Nucleotide (Nucleotide equilibrium frequency µ (A,C,G,T)
Phân bố gama (Gama distribution )
31 648 584 36 28 HKY+G 0.2744, 0.2256 0.1630, 0.3369 0.9619
Đối với thuật toán BI, các mô hình thay thế được tính toán. Chương trình được
chạy trên 4 kênh với 1 triệu thế hệ, với tần suất tính toán trên 100 thế hệ. Phân tích
được lặp lại 2 lần để xác định độ chính xác của phương pháp phân tích. Giá trị tin cậy (posterior probability (PP) được biểu hiện trên các nhánh của cây tiến hóa
31
Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán
MP với độ lặp lại 100 lần. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng trình tự quá lớn,
chúng tôi áp dụng phương pháp successive approximation approach (Sullivan và ctv, 2005) đối với thuật toán ML, xác định cây tiến hóa dựa trên mô hình tiến hóa và so sánh kết quả thu được với phương pháp phân tích MP và BI. Cây đa dạng loài được
biểu hiện và hiệu chỉnh bằng phần mềm TreeView 1.6.6 (Page, 1996).
Bảng 2.4. Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA của các loài cá ngựa
Mã số Genbank Tài liệu tham khảo
Loài
CO1 16S CO1 16S
H. abdominalis GQ502118 AF355013 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. algiricus GQ502119 AY277302 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. angustus GQ502122 Lourie và ctv, 2009
H. barbouri GQ502123 AF354999 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. biocellatus GQ502125 Lourie và ctv, 2009
H. breviceps AY277287 Teske và ctv, 2003
H. camelopardalis GQ502127 AY277295 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. capensis GQ502129 AY277304 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. cf. borboniensis GQ502131 Lourie và ctv, 2009
H. comes* GQ502135 AF355000 Lourie và ctv, 2009 Wilson và ctv, 2001
H. coronatus AY277293 Teske và ctv, 2003
H. erectus GQ502137 DQ288359 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. fisheri GQ502139 DQ288370 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. fuscus GQ502140 DQ288371 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. guttulatus GQ502141 EU770588 Lourie và ctv, 2009 Lopez và ctv, 2008
H. hippocampus GU322416 Lopez và ctv, 2009
H. histrix* GQ502147 Lourie và ctv,2009
H. ingens GQ502148 DQ288365 Lourie và ctv,2009 Teske và ctv, 2005
H. kelloggi* GQ502151 FJ211369 Lourie và ctv,2009 Singh và ctv, 2008
H. kuda* FJ176586 AY277299 Singh và ctv, 2008 Teske và ctv, 2003
H. mohnikei GQ502159 AY277292 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. patagonicus GQ502160 Lourie và ctv, 2009
H. queenslandicus GQ502163 AY277297 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. reidi GQ502165 DQ288362 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
H. spinosissimus* GQ502167 DQ452302 Lourie và ctv, 2009 Sootanan và ctv, 2006
H. subelongatus GQ502170 AY277288 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2003
H. trimaculatus* EU930324 FJ541072 Singh và ctv, 2008 Singh và ctv, 2008
H. whitei AY277290 Teske và ctv, 2003
H. zosterae GQ502176 DQ288361 Lourie và ctv, 2009 Teske và ctv, 2005
Syngnathiformes sp. HQ956421 Direct Submission,
2011
Syngnathoides
32 FJ583553 Steinke và ctv, 2008 FJ583551 Steinke và ctv, 2008 FJ583552 Steinke và ctv, 2008 GU805017 Steinke, D, 2010 GU805016 Steinke, D, 2010 GU805015 Steinke, D, 2010 GU805014 Steinke, D, 2010 GQ502154 Lourie và ctv, 2009 GQ502155 Lourie và ctv, 2009 GQ502156 Lourie và ctv, 2009 GQ502153 Lourie và ctv, 2009 GQ502152 Lourie và ctv, 2009 FJ541047 Singh và ctv, 2008 FJ541042 Singh và ctv, 2008 FJ176590 Singh và ctv, 2008 FJ176589 Singh và ctv, 2008 FJ176582 Singh và ctv, 2008 FJ176583 Singh và ctv, 2008 FJ176584 Singh và ctv, 2008 FJ176585 Singh và ctv, 2008 FJ176586 Singh và ctv, 2008 H. kuda