3.2.1. Khuếch đại DNA cá ngựa
Sản phẩm của đoạn gen 16S mtDNA (được khuếch đại dựa vào đoạn mồi 16SF và 16SR) và đoạn gen CO1 mtDNA (được khuếch đại bằng đoạn mồi LCO và HCO)
được trình bày tại hình 3.7. Kết quả điện di là một băng đậm nét có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (530bp đối với gen 16S và 750bp đối với gen CO1). Điều
này cho thấy cặp mồi có tính đặc hiệu cao và chu trình nhiệt dùng trong nghiên cứu là tối ưu cho việc khuếch đại gen.
39
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu cá ngựa. M: marker 1kb (A): đoạn gen 16S mtDNA. Các giếng: 1 - H. trimaculatus, 2,3 - H.kuda,
4 - H. kelloggi, 5 – H. spinosissimus, 6 – H. comes, C - đối chứng âm.
(B): Đoạn gen CO1 mt DNA. Các giếng: 1 - H. trimaculatus, 2 - H. kuda, 3,4 –
H. kelloggi, 5 – H. spinosissimus, 6 – H. histrix, 7 – H. comes.
3.2.2. Mối quan hệ phát sinh loài của các loài cá ngựa (Hippocampus spp.)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng một phần trình tự DNA của cá ngựa
bao gồm các đoạn gen 16S mtDNA (16S mitochondrial DNA) và CO1 mtDNA để
nghiên cứu mối quan hệ loài của 6 loài cá ngựa thuộc giống Hippocampus tại Việt
Nam (Hippocampus kuda, H. trimaculatus, H. kelloggi, H. comes, H. spinosissimus và H. histrix). Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng trình tự gen của các loài cá ngựa khác lấy
từ ngân hàng gen (Genbank) để khảo sát mối quan hệ tiến hóa.
3.2.2.1. Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA
Phân tích được tiến hành với 6 trình tự CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại Việt
Nam và 20 trình tự gen của các loài cá ngựa khác từ Genbank (trong đó loài
Syngnathiformes sp. được sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup)). Các thông tin về các
trình tự nghiên cứu (loài, mã số Genbank và nguồn tài liệu) được trình bày ở bảng 2.4. Các trình tự gen của 26 loài nói trên được xử lý bằng phần mềm Bioedit, trình tự của các loài có quan hệ gần gũi sẽ có nhiều vị trí gióng hàng tương tự nhau. Độ dài trung bình trình tự đoạn gen CO1 mtDNA sau khi gióng hàng là 651 cặp bazơ (bp) sau khi đã loại bỏ những đoạn trình tự không phù hợp. Mô hình tối ưu và các thông số cơ
B 5
40
bản của phân tích tiến hóa dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.2.
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa bằng 2
phần mềm PAUP 4.0 (với 2 thuật toán MP, ML) và MrBayes 3.1.2 (thuật toán BI) thu được cùng 1 cây phát sinh loài. Ba thuật toán (MP, ML và BI) biểu hiện mức độ chính
xác khác nhau thông qua giá trị bootstrap và giá trị tin cậy trên các nhánh cây. Giá trị
càng cao thì mức độ tin cậy càng lớn.
Trên cây phát sinh loài (Hình 3.8) ta thấy có 2 nhánh lớn A và B được phân
chia rõ rệt (thể hiện ở giá trị bootstrap và độ tin cậy khá cao (88/80/100)), nhánh C có 3 loài, còn lại các nhánh nhỏ nằm rải rác là các loài: H. guttulatus, H. abdominalis, H. barbouri, H. histrix, H. comes, H. subelongatus và H. angustus.
Những loài nào phát sinh cùng một nhánh sẽ có mối quan hệ gần gũi nhau hơn
so với các loài khác nhánh. Do đó, nhánh A gồm 8 loài (H. kuda, H. algiricus, H. fuscus, H. cf. borboniensis, H. reidi, H. ingens, H. fisheri và H. capensis) thì 3 cặp A1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(H. kuda và H. algiricus) A2 (H. fuscus và H. cf. borboniensis) và A3 (H. reidi và H. ingens) thể hiện sự gần gũi di truyền (trong từng cặp) nhiều hơn so với các loài khác cặp và so với các loài H. fisheri, H. capensis. Nhánh A1 thể hiện sự gần gũi với nhánh A2 hơn nhánh A3. Tuy nhiên, mức độ tin cậy đối với vị trí sắp xếp của mỗi cặp là khác nhau. Cặp A3 có mức độ tin cậy (100/90/100) cao hơn hẳn so với cặp A1
(50/50/100). Chứng tỏ vị trí của 2 loài H. kuda và H. algiricus thuộc cặp A1 còn có khả năng thay đổi trong những phân tích khác.
Tương tự như nhánh A, nhánh B gồm có 7 loài (H. kelloggi, H. zosterae, H. patagonicus, H. erectus, H. spinosissimus, H. queenslandicus và H. camelopardalis)
được chia thành các nhánh khác nhau. Từ nhánh lớn B, các loài phân chia thành các nhánh nhỏ B1 (H. kelloggi và H. zosterae), B2 (H. patagonicus và H. erectus) và B3 (H. spinosissimus và H. queenslandicus). B1 gần gũi với B2 hơn là B3 trong khi B1,
B2 và B3 lại tạo thành một nhánh thể hiện sự gần gũi với loài còn lại là H. comelopardalis.
Như vậy, mỗi khi tạo thêm được một nhánh thứ cấp thì mức độ gần gũi của các loài trong nhánh đó lại cao hơn. Các loài trong mỗi cặp B1, B2, B3 gần nhau về mặt di
41
truyền. Cặp B2 và B3 có mức độ tin cậy rất cao, lần lượt là 100/90/100 và
100/100/100. Ngược lại, cặp B1 (H. kelloggi và H. zosterae) lại có giá trị tin cậy rất
thấp (50/60/50), chứng tỏ 2 loài này có thể có vị trí khác thích hợp hơn.
Nhánh C chỉ gồm có 3 loài nhưng giá trị tin cậy là rất cao, từ 90% trở lên.
Trong đó 2 loài H. trimaculatus và H. biocellatus thuộc cặp C1 có đoạn gen CO1 mtDNA tương đồng hơn so với loài còn lại là H. mohnikei.
Hai loài H. guttulatus và H. abdominalis gần với 2 nhánh A và B hơn nhánh C.
Tuy nhiên, các loài ở gốc cây tiến hóa (H. barbouri, H. histrix, H. comes và H. angustus) có vị trí không xác định nên có thể dễ dàng thay đổi ở các phân tích khác.
Các loài cá ngựa Việt Nam trong nghiên cứu này (H. kuda, H. kelloggi, H. spinosissimus, H. trimaculatus, H. histrix, H. comes) có vị trí trên cây phát sinh xen lẫn với các loài cá ngựa trên thế giới. (Cá ngựa đen H. kuda thuộc cặp A1, gần với loài
H. algiricus; cá ngựa thân trắng H. kelloggi thuộc cặp B1, gần với loài H. zosterae; cá ngựa gai H. spinosissimus thuộc cặp B3, được xếp với loài H. queenslandicus; cá ngựa
ba chấm H. trimaculatus thuộc cặp C1 cùng nhánh với loài H. biocellatus. Ngoài ra, các loài cá ngựa gai nhọn H. histrix và cá ngựa vằn H. comes có vị trí tương đối xa so
với các loài khác). Giá trị tương đồng giữa các trình tự gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sự tương đồng dựa trên gen CO1 mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam
H. spinosissimus H. histrix H. kelloggi H. trimaculatus H. kuda H. comes H. spinosissimus ID 0,890 0,933 0,870 0,913 0,887 H. histrix ID 0,887 0,890 0,881 0,917 H. kelloggi ID 0,887 0,923 0,890 H. trimaculatus ID 0,887 0,894 H. kuda ID 0,881
(Số liệu trong bảng là mức độ tương tự về trình tự gen CO1 mtDNA của các loài được so sánh).
Theo bảng 3.2, ta thấy mức độ tương đồng rất cao của các loài H. kelloggi và H. spinosissimus (0,933); H. kuda và H. kelloggi (0,923); H. comes và H. histrix (0,917);
42
gen CO1 mtDNA của các cặp loài này là trên 90% và mức độ khác biệt dưới 10%. Xét trên cây tiến hóa (Hình 3.8), cũng nhận thấy mức độ tương đồng như trên rất phù hợp
với vị trí sắp xếp của các loài cá ngựa này. Hai loài H. kelloggi và H. spinosissimus có mức độ tương đồng cao nhất, cùng nằm trên nhánh B; H. kuda và H. kelloggi, H. spinosissimus nằm trên 2 nhánh gần nhau là A và B. Còn 2 loài H. comes và H. histrix
cùng nằm ở gần gốc cây tiến hóa. Ngược lại, một số loài lại có mức độ tương đồng
thấp. Hai loài H. trimaculatus và H. spinosissimus có mức độ tương đồng thấp nhất
(0,870) nằm trên 2 nhánh riêng biệt là B và C (mức độ gần gũi của nhánh B và C (hay A và C) thấp hơn so với A và B). Một số cặp loài như H. trimaculatus và H. kelloggi; H. kuda và H. trimaculatus; H. comes và H. spinosissimus,...có mức độ tương đồng
(0,887) cũng như mức độ gần gũi trên cây tiến hóa là không cao.
3.2.2.2. Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân tích mối quan hệ loài được thực hiện với trình tự đoạn gen 16S mtDNA
của 5 loài cá ngựa trong nghiên cứu và 22 loài từ Genbank (trong đó, loài
Syngnathoides biaculeatus được chọn làm nhóm ngoại). Các thông tin về các trình tự
nghiên cứu (loài, mã số Genbank và nguồn tài liệu) được trình bày ở Bảng 2.4. Tương
tự đối với đoạn gen CO1 mtDNA, các trình tự gen của 27 loài nói trên được gióng hàng bằng phần mềm Bioedit. Độ dài trung bình trình tự đoạn gen 16S mtDNA của 27 loài sau khi gióng hàng và cắt bớt những đoạn không cần thiết là 491 cặp bazơ (bp). Mô hình tối ưu và các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa dựa trên trình tự gen 16S
mtDNA của các loài cá ngựa được trình bày ở bảng 2.2.
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen 16S mtDNA dựa trên 3 phương
pháp MP, ML và BI cho kết quả tương tự về cây phát sinh loài. Kết quả được trình bày
ở hình 3.9. với cây phát sinh loài thu được từ phân tích MP, ML và BI với giá trị
bootstrap (BT) và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán MP, ML và BI được biểu hiện trên các nhánh.
Cây phát sinh được chia thành 6 nhánh chính (D, E, F, G, H, I). Nhánh D và E là 2 nhánh phát sinh song song tạo thành “ngọn” của cây phát sinh. Các nhánh tiếp
theo F, G, H có mức độ gần “gốc” tăng dần và nhánh I có vị trí tại “gốc cây”. Nhánh D
43
và trình tự trong nghiên cứu hiện tại), H. fuscus, H. capensis thuộc nhóm D1 có mức độ gần gũi di truyền khá cao (với giá trị tin cậy là 95/80/100). Tương tự nhóm D2 (H. reidi và H. ingens) có giá trị tin cậy là 95/85/100.
Phát sinh cùng gốc với nhánh D là nhánh E. Nhánh này chỉ có 3 loài, trong đó,
2 loài H. spinosissimusgb và H. queenlandicus có vị trí tương quan rất chặt chẽ với giá
trị tin cậy cao (99/95/100) và có quan hệ gần gũi với loài H. kelloggi. Cả 3 loài trên
đều xuất hiện tại nhánh B (Hình 3.8) cũng với sự sắp xếp gần gũi của H. spinosissimus
và H. queenlandicus. Còn ở nhánh F: 2 loài H. hippocampus và H. erectus có quan hệ
gần gũi, tiếp đến 2 loài này lại tạo quan hệ gần với loài H. zosterae, cuối cùng 3 loài này lại có quan hệ với loài H. guttulatus.
44
Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của cá ngựa thu tại vùng biển Nam Trung Bộ
Syngnathiformes sp. là nhóm ngoại (outgroup). Các giá trị bootstrap (MP, ML) và giá trị tin cậy (BI) được biểu hiện tại các nhánh. Các nhóm loài được hình thành từ
cây phát sinh loài được ký hiệu theo thứ tự.
A B B2 B1 C A1 A3 A2 B3 C1
45
Hình 3.9. Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA của cá ngựa thu tại vùng biển Nam Trung Bộ
Loài Syngnathoides biaculeatus là nhóm ngoại. Các giá trị bootstrap (MP, ML) và giá trị tin cậy (BI) được biểu hiện tại các nhánh. Các nhóm loài hình thành từ
cây phát sinh loài được ký hiệu theo thứ tự.
F D H G I D1 E D2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
46
Phát sinh cùng gốc với 3 nhánh D, E, F là nhánh G. Nhánh này có 5 loài, được
chia thành 2 nhóm. Nhóm thứ nhất gồm 3 loài H. comes, H. subelongatus và H. whitei, nhóm thứ 2 gồm 2 loài H. spinosissimus và H. barbouri. Các loài trong cùng nhóm có quan hệ gần hơn các loài khác nhóm. Loài H. spinosissimus được xuất hiện 2 lần, lần đầu tại nhánh E (đây là trình tự lấy từ Genbank, cá ngựa có nguồn gốc Thái Lan) và lần 2 tại nhánh G (trình tự của nghiên cứu hiện tại, thu mẫu tại Việt Nam). Cùng một loài nhưng có vị trí trên cây phát sinh cách xa nhau, có thể do sự đa dạng di truyền lớn
hoặc có sự sai khác về hình thái ở loài cá ngựa gai tại Việt Nam.
Nhánh H có cùng gốc với cả 4 nhánh trên và vị trí sắp xếp của 3 loài trong
nhánh này tương tự như nhánh E. Tức là có 2 loài cùng nhánh (H. mohnikei và H. coronatus) có quan hệ với loài còn lại là H. trimaculatus. Nhánh cuối cùng là nhánh I, phát sinh tại gốc. 2 loài trong nhánh I có quan hệ gần gũi với nhau nhưng khác biệt
nhiều so với các loài trong những nhánh khác, đặc biệt là nhánh D và E.
Khi so sánh cây phát sinh dựa trên đoạn gen 16S mtDNA với cây phát sinh dựa trên đoạn gen CO1 mtDNA, có thể dễ dàng nhận thấy tất cả những loài thuộc nhánh D
(Hình 3.9.) đều có mặt tại nhánh A (Hình 3.8).
Năm loài cá ngựa trong nghiên cứu (H. kuda, H. spinosissimus, H. kelloggi, H. comes, H. trimaculatus) nằm rải rác ở các nhánh cây. (Loài H. kuda thuộc nhánh D,
gần với loài H. fuscus; loài H. kelloggi thuộc nhánh E gần với 2 loài H. queenslandicus
và H. spinosissimusgb; H. comes thuộc nhánh G, quan hệ gần gũi với loài H. subelongatus; H. spinosissimus cũng nằm ở nhánh G và có quan hệ với loài H. barbouri; cuối cùng là H. trimaculatus thuộc nhánh H, có đoạn gen 16S tương đồng
với H. mohnikei và H. coronatus). Giá trị tương đồng giữa các trình tự gen 16S
mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Sự tương đồng dựa trên gen 16S mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam
H. spinosissimus H. kelloggi H. trimaculatus H. kuda H. comes H. spinosissimus ID 0,927 0,929 0,909 0,934 H. kelloggi ID 0,917 0,952 0,921 H. trimaculatus ID 0,913 0,931 H. kuda ID 0,923
47
Theo bảng 3.3, mức độ tương đồng giữa các trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá ngựa Việt Nam rất cao (đều trên 90%). Loài H. kuda và H. kelloggi có mức độ tương đồng cao nhất (0,952) thuộc hai nhánh D và E rất gần gũi của cây phát sinh loài (Hình 3.9). Loài H. comes và H. spinosissimus cùng nằm trên nhánh G (Hình 3.9), có sự tương đồng cũng rất cao (0,934). Hai loài có mức độ tương đồng thấp nhất là H. kuda và H. trimaculatus (0,913) thuộc 2 nhánh cây D và G cách xa nhau về mặt di truyền.
3.2.3. Đa dạng di truyền cá ngựa đen Hippocampus kuda
Sau khi phân tích trình tự CO1 mtDNA của 25 cá thể cá ngựa đen
Hippocampus kuda, thu được 7 haplotype. Trong đó, các haplotype thu tại Nha Trang,
Khánh Hòa được ký hiệu từ “H. kuda1” đến “H. kuda5” và haplotype thu tại Sông
Cầu, Phú Yên ký hiệu “H. kuda6”, “H. kuda7” (Hình 3.10).
Chúng tôi sử dụng trình tự gen CO1 mtDNA của 29 haplotype của loài cá ngựa đen H. kuda (trong đó có 7 haplotype từ nghiên cứu hiện tại và 22 haplotype từ
Genbank) với 2 loài H. algiricus và H. fisheri (làm nhóm ngoại). Khi so sánh và gióng hàng các trình tự gen này, chỉ có 648 bp được sử dụng cho phân tích di truyền. Mô hình tối ưu và các thông số cơ bản của phân tích tiến hóa dựa trên trình tự gen CO1
mtDNA của cá ngựa đen được trình bày ở bảng 2.3.
Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự gen CO1 mtDNA dựa trên 3 phương
pháp MP, ML và BI cho kết quả tương tự về cây đa dạng di truyền loài cá ngựa đen H. kuda. Kết quả được trình bày ở hình 3.10 với cây đa dạng di truyền thu được từ phân
tích MP, ML và BI, giá trị bootstrap (BT) và giá trị tin cậy (PP) của thuật toán MP, ML và BI được biểu hiện trên các nhánh.
48 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.10. Cây đa dạng loài dựa trên gen CO1 mtDNA của cá ngựa đen
Hippocampus kuda thu tại vùng biển Nam Trung Bộ;
H. algiricus và H. fisheries là nhóm ngoại. Các giá trị bootstrap (MP, ML) và giá trị tin cậy (BI) được biểu hiện tại các nhánh.
Lineage HK Lineage GU Lineage FJ Lineage GQ (Khánh Hòa) (Khánh Hòa) (Khánh Hòa) (Khánh Hòa) (Khánh Hòa) (Phú Yên) (Việt Nam) (Việt Nam) (Việt Nam)
(Papua New Guinea)
(Ấn Độ) (Ấn Độ) (Ấn Độ) (Ấn Độ) (Ấn Độ) (Ấn Độ) (Ấn Độ) (Ấn Độ) (Ấn Độ) (Indonesia) (Indonesia) (Ấn Độ) (Nam Phi) (Nam Phi) (Nam Phi) (Nam Phi) (Đài Loan) (Phú Yên)
(Papua New Guinea)
FJ 3 FJ 2 FJ 1
49
Cây đa dạng loài từ phân tích trình tự CO1 mtDNA (Hình 3.10) được chia
thành 4 lineage rõ rệt là lineage HK, FJ, GQ và GU. Bốn lineage đó bao gồm chủ yếu
các quần thể cá ngựa đen phân bố ở vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (cụ thể,
lineage HK thu tại Việt Nam, lineage FJ chủ yếu thu tại Ấn Độ, lineage GQ thu tại các nước khác nhau như Indonesia, Papua New Guinea và Ấn Độ, riêng lineage GU thu tại
Nam Phi). Trong lineage HK có 10 haplotype thì 6 haplotype (trong nghiên cứu hiện
tại) từ cá ngựa đen ở vùng biển Việt Nam (5 haplotype ở Khánh Hòa và 1 ở Phú Yên). Bên cạnh đó còn có sự hiện diện của các haplotype với mã số gen FJ583551,
FJ583552 và FJ583553 trong lineage HK. Tuy nhiên, toàn bộ những haplotype này
đều có nguồn gốc từ Việt Nam (Steinke, 2008). Như vậy, tất cả các haplotype có cùng nguồn gốc từ cá ngựa Việt Nam được sắp xếp trên cùng một nhánh (lineage HK) thể
hiện mối quan hệ gần gũi với nhau. Trong lineage này cũng quan sát thấy haplotype
GQ502156 có nguồn gốc từ cá ngựa ở Papua New Guinea.
Trong lineage FJ, đa số các haplotype thuộc về cá ngựa đen ở vùng biển Ấn Độ,
bao gồm các nhánh FJ1, FJ2 và FJ3. Lineage FJ có số lượng haplotype nhiều nhất (11