PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA TRÌNH TỰ 16S RNA, CYTOCHROME B TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI CỦA HEO RỪNG VIỆT NAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Y Z LÊ NGỌC CHÂU PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA TRÌNH TỰ 16S RNA, CYTOCHROME B TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI CỦA HEO RỪNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số chuyên ngành: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HỒNG NGHĨA SƠN Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2012 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ, người sinh thành dưỡng dục nên người Ba Mẹ chỗ dựa vững chắc, nguồn động viên, cho nghị lực mạnh mẽ vượt qua khó khăn, thử thách sống Và với tất lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến: Thầy Hồng Nghĩa Sơn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tinh thần vật chất tốt cho em học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Anh Lê Thành Long dạy tận tình, cho em lời khuyên bổ ích giúp đỡ em tháo gỡ khó khăn suốt thời gian làm luận văn Cô Vân, chị Phương Thảo, anh Phúc Chiến bạn Khánh Thanh thuộc phịng Cơng nghệ sinh học động vật, viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, quan tâm tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành luận văn Mục lục Phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ii Danh mục bảng iii Danh mục hình iv Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Giới thiệu heo rừng 1.2 Tiến hóa phân tử phát sinh loài phân tử 1.3 Khái niệm loài 1.4 Các khái niệm phát sinh loài 1.5 Một số marker phân tử 15 1.6 Các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài phân tử heo rừng 21 Chương 2: Vật liệu – Phương pháp 2.1 Vật liệu 24 2.2 Phương pháp 27 Chương 3: Kết ‒ Biện luận 3.1 Mối quan hệ phát sinh loài dựa trình tự gen cytochrome b 35 3.2 Mối quan hệ phát sinh lồi dựa trình tự 16S 44 3.3 Xây dựng phát sinh loài dựa mối quan hệ với gen cytochrome b gen 16S 53 Kết luận 57 Danh mục cơng trình tác giả 58 Tài liệu tham khảo 59 Phụ lục i Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Lê Ngọc Châu Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt A Adenine C Cytosine CI Consistency Index CSB Conserved Sequence Block DNA Deoxyribonucleic Acid EN Endangered G Guanine HSP H-Strand Promoter IUCN International Union for Conservation of Nature LSP Light-Strand Promoter ME Minimum Evolution ML Maximum Likelihood MP Maximum Parsimony mRNA messenger Ribonucleic Acid NCBI National Center for Biotechnology Information NIH National Institutes of Health NJ Neighbor - Joining PCR Polymerase Chain Reaction PKCi Protein Kinase C iota rRNA ribosomal Ribonucleic Acid SNP Single-Nucleotide Polymorphism T Thymine TAE Tris-Acetate-EDTA TAS Termination Associated Sequence tRNA transfer Ribonucleic Acid UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic mean ii Danh mục bảng Lê Ngọc Châu Danh mục bảng Bảng 1: Một số thiết bị sử dụng đề tài 24 Bảng 2: Một số dụng cụ sử dụng đề tài 25 Bảng 3: Một số hóa chất sử dụng đề tài 26 Bảng 4: Địa điểm thu nhận mẫu heo rừng 28 Bảng 5: Trình tự mồi sử dụng PCR giải trình tự 32 Bảng 6: Nhiệt độ phản ứng đoạn mồi 33 Bảng 7: Vùng phân bố cá thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên dùng phân tích trình tự cytochrome b 36 Bảng 8: Thơng tin trình tự cytochrome b cá thể heo rừng nước ngồi dùng phân tích 37 Bảng 9: Mức độ tương đồng vùng trình tự gen cytochrome b chuỗi polypeptide cytochrome b số loài động vật 41 Bảng 10: Vùng phân bố cá thể heo rừng Việt Nam dùng phân tích trình tự 16S 45 Bảng 11: Thơng tin trình tự 16S cá thể heo rừng nước ngồi dùng phân tích 46 Bảng 12: Mức độ tương đồng vùng trình tự gen 16S số lồi động vật 50 Bảng 13: Mã số cá thể heo rừng nước sử dụng so sánh trình tự kết hợp gen cytochrome b 16S 53 Bảng 14: Khoảng cách di truyền nhóm heo rừng 54 Bảng 15: Khoảng cách di truyền trung bình cá thể nhóm heo rừng 55 iii Danh mục hình Lê Ngọc Châu Danh mục hình Hình 1: Heo rừng mơi trường tự nhiên Hình 2: Heo rừng non Hình 3: Phân loại phát sinh loài theo Page Holmes (1998) 10 Hình 4: Những mối quan hệ loài tổ tiên loài 12 Hình 5: Cấu trúc DNA ty thể người 16 Hình 6: Cấu trúc protein cytochrome b 18 Hình 7: Cấu trúc vùng kiểm soát ty thể động vật có vú 19 Hình 8: Một số thiết bị sử dụng 24 Hình 9: Một số dụng cụ sử dụng 25 Hình 10: Kit PureLinkTM Spin Column 26 Hình 11: Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm 27 Hình 12: Một cá thể heo rừng lai thu nhận khu vực Lâm Đồng 29 Hình 13: Sơ đồ tóm tắt quy trình tách chiết 30 Hình 14: Hình đại diện kết khuếch đại vùng gen CY2 mẫu heo rừng 35 Hình 15: Vị trí điểm đột biến điểm đa hình vùng trình tự cytochrome b (1140 bp) cá thể heo rừng 39 Hình 16: Vùng trình tự polypeptide cytochrome b gồm 336 amino acid dịch mã từ đoạn gen cytochrome b dài 1140 bp 41 Hình 17: Cây phát sinh lồi NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ cá thể heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha, Trung Quốc Rumani dựa trình tự 1140 bp gen cytochrome b 43 Hình 18: Hình đại diện kết khuếch đại vùng gen S1 mẫu heo rừng 44 Hình 19: Vị trí điểm đột biến điểm đa hình vùng trình tự 16S (997 bp) cá thể heo rừng 48 iv Danh mục hình Lê Ngọc Châu Hình 20: Cây phát sinh lồi NJ (Neighbor‒Joining) mơ tả mối quan hệ cá thể heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha Đài Loan dựa trình tự 997 bp gen 16S 52 Hình 21: Cây phát sinh lồi NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ cá thể heo rừng Việt Nam, heo lai Việt Nam, heo rừng Châu Âu, heo rừng Châu Á dựa trình tự 2100 bp gen cytochrome b 16S 56 v Mở đầu Lê Ngọc Châu Mở đầu Heo vật nuôi quan trọng mang lại hiệu kinh tế cao mà cịn mơ hình thí nghiệm người nghiên cứu sinh hóa y sinh Trong đó, heo rừng (Sus scrofa) với nhiều tiềm mà người chưa khám phá hết Việc nghiên cứu lồi heo cịn quan tâm cịn nhiều bỏ ngỏ Định danh lồi xác có vai trị quan trọng khoa học pháp y, an tồn thực phẩm nhiều lĩnh vực khác Ý tưởng sử dụng trình tự DNA đặc hiệu lồi để định danh loài đưa năm đầu thập niên 70 Việc giải tồn trình tự DNA ty thể giải trình tự số vùng DNA ty thể vùng kiểm soát (J Koji Lum, 2006), cytochrome b (Y N Jiang, 2008),… giúp xác định biến dị phát sinh loài lồi heo địa giới, từ xác định mức độ đa dạng nguồn gốc loài heo giới (E Giuffra, 2000) Hiện số nghiên cứu heo rừng Việt Nam tiến hành Vùng D‒loop DNA heo rừng Việt Nam số tỉnh miền Bắc giải trình tự xác định biến dị loài heo địa so sánh loài heo Việt Nam với loài heo Nhật Bản (Naotaka Ishiguro, 2008) hay việc sử dụng microsatellites để đánh giá so sánh tính đa mức độ đa dạng di truyền số loài heo rừng miền Bắc với châu Âu (N.T.D Thuy, 2006) Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng heo rừng khu vực miền Trung, miền Nam trình tự cytochrome b 16S đánh giá biến dị đa dạng di truyền chưa quan tâm nghiên cứu đầy đủ Trong đề tài này, tiến hành giải trình tự vùng cytochrome b 16S DNA ty thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên phân tích điểm đa khác biệt di truyền heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên so với số loài heo rừng nước khác Kết nghiên cứu sở cho nghiên cứu bảo tồn hay sử dụng nguồn gen heo rừng Tây Nguyên công tác lai tạo giống Mở đầu Lê Ngọc Châu Mục tiêu đề tài Giải trình tự gen cytochrom b gen 16S Xác định SNP (single nucleotide polymorphism) thiết lập đa hình đặc trưng heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên Xác định phát sinh loài heo rừng Việt Nam với số lồi heo rừng giới Tóm tắt nội dung đề tài Gen cytochrome b 16S sử dụng nhiều nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài Sau thu nhận DNA tổng từ mẫu mơ tai heo rừng, chúng tơi khuếch đại trình tự gen mục tiêu phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết điện di gel 1% agarose cho thấy có diện sản phẩm khuếch đại gen cytochrome b 16S 20 mẫu mơ Sản phẩm khuếch đại giải trình tự, loại bỏ đoạn trùng lắp đoạn nhiễu hai đầu 5’ 3’ Các trình tự vùng gen cytochrome b 16S heo rừng Việt Nam phân tích điểm đa hình so sánh với trình tự tương ứng heo rừng nước ngồi GenBank Kết phân tích riêng gen cho thấy heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên có đa hình đặc trưng, phân biệt với heo rừng lai heo rừng nước Kết phân tích dựa trình tự kết hợp hai gen củng cố đặc điểm riêng heo rừng Việt Nam khu vực Tây Ngun Ngồi ra, trình tự nucleotide gen chuỗi polypeptide (chỉ gen cytochrome b) heo rừng Việt Nam so sánh với trình tự tương ứng số lồi khác khẳng định tính bảo tồn cao động vật có vú Như vậy, phương pháp PCR giải trình tự, chúng tơi bước đầu xác định đa hình đặc trưng cho heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên; phân biệt heo rừng lai heo rừng Việt Nam dựa nguồn trình tự cytochrome b 16S CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tài liệu tham khảo Lê Ngọc Châu 36 Page R D M and Holmes E C (1998) Molecular evolution: A phylogenetic approach Blackwell Science Ltd., London, chapter 2, 3, 5, 6, 37 Ramayo Y., Shemeret I N., Pérez E M (2011) Mitochondrial DNA diversity in wild boar from the Primorsky Krai Region (East Russia) Animal Genetics, Volume 42, Issue 1, pp 96–99 38 Romano S L., Palumbi S R (1997) Molecular evolution of a portion of the mitochondrial 16S ribosomal gene region in Scleractinian Corals J Mol Evol, 45, pp 397–411 39 Ruokonen M (2001) Phylogeography and conservation genetics of the lesser white-fronted goose (anser erythropus) Academic Dissertation to be presented with the assent of the Faculty of Science, University of Oulu, Finland 40 Scotti M L., Bamlet W R., Smyrk T C., Fields A P and Murray N R (2010) Protein Kinase C Iota is required for pancreatic cancer cell transformed growth and tumorigenesis Cancer Res, 70(5), pp 2064–2074 41 Shouche Y S and Patole M S (2000) Sequence analysis of mitochondrial 16S ribosomal RNA gene fragment from seven mosquito species J Biosci, vol 25 No 4, pp 361–366 42 Talor P J Evolution and the species concept Biological science fundamentals and systematic, vol 43 Tamura K and Nei M (1993) Estimation of the number of nucleotide substitutions in the Control Region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Mol Biol Evol, 10(3), pp 512-526 44 Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M and Kumar S (2011) MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods Mol Biol Evol, 28(10), pp 2731–2739 63 Tài liệu tham khảo Lê Ngọc Châu 45 Thuy N T D., Melchinger W E., Kuss A W., Cuong N V., Bartenschlager H and Geldermann H (2006) Comparison of Vietnamese and European pig breeds using microsatellites J Anim Sci, 84, pp 2601–2608 46 Watanobe T, Ishiguro N, Nakano M (2003) Phylogeography and population structure of the Japanese wild boar Sus scrofa leucomystax : mitochondrial DNA variation Zoolog Sci, 20, pp 1477-1489 47 WatanobeT, Okumura N, Ishiguro N, Nakano M, Matsui A, Sahara M, Komatsu M (1999) Genetic relationship and distribution of the Japanese wild boar (Sus scrofa leucomystax) and Ryukyu wild boar (Sus scrofa riukiuanus) analysed by mitochondrial DNA Mol Ecol., 8(9), pp 1509-1512 48 Wilson D E., Reeder D M (2005) Mammal Species of the World (3rd ed.) Baltimore: Johns Hopkins University Press, vol Tài liệu từ Internet Thiennhien.net (http://www.thiennhien.net/2007/02/19/lon-rung-o-vuon-quoc- gia-pu-mat/) 64 PHỤ LỤC File: S11-S1F.ab1 Sample: S11_S1F Run Ended: 2012/3/21 22:36:1 Signal G:671 A:1206 C:866 T:789 Lane: 92 Base spacing: 15.318771 693 bases in 8253 scans Page of File: S11-S1F.ab1 Sample: S11_S1F Run Ended: 2012/3/21 22:36:1 Signal G:671 A:1206 C:866 T:789 Lane: 92 Base spacing: 15.318771 693 bases in 8253 scans Page of File: S21-S2F.ab1 Sample: S21_S2F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:1643 A:2432 C:2145 T:1926 Lane: Base spacing: 14.753835 521 bases in 6250 scans Page of File: S118-S1F.ab1 Sample: S118_S1F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:2337 A:4685 C:4066 T:3147 Lane: 10 Base spacing: 14.651432 697 bases in 8233 scans Page of File: S118-S1F.ab1 Sample: S118_S1F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:2337 A:4685 C:4066 T:3147 Lane: 10 Base spacing: 14.651432 697 bases in 8233 scans Page of File: S218-S2F.ab1 Sample: S218_S2F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:4866 A:7632 C:6951 T:6400 Lane: 18 Base spacing: 14.695243 525 bases in 6279 scans Page of File: Y11-Y1F.ab1 Sample: Y11_Y1F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:3412 A:6411 C:8718 T:6272 Lane: 43 Base spacing: 14.638278 616 bases in 7378 scans Page of File: Y21-Y2F.ab1 Sample: Y21_Y2F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:1462 A:4077 C:4757 T:3346 Lane: 51 Base spacing: 14.684321 638 bases in 7560 scans Page of File: Y21-Y2F.ab1 Sample: Y21_Y2F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:1462 A:4077 C:4757 T:3346 Lane: 51 Base spacing: 14.684321 638 bases in 7560 scans Page of File: Y118-Y1F.ab1 Sample: Y118_Y1F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:3084 A:5633 C:7896 T:5521 Lane: 57 Base spacing: 14.71439 611 bases in 7346 scans Page of File: Y218-Y2F.ab1 Sample: Y218_Y2F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:542 A:1313 C:1569 T:1018 Lane: 65 Base spacing: 14.778873 662 bases in 7804 scans Page of File: Y218-Y2F.ab1 Sample: Y218_Y2F Run Ended: 2012/3/22 0:34:1 Signal G:542 A:1313 C:1569 T:1018 Lane: 65 Base spacing: 14.778873 662 bases in 7804 scans Page of ... Kết ‒ Biện luận 3.1 Mối quan hệ phát sinh loài dựa trình tự gen cytochrome b 35 3.2 Mối quan hệ phát sinh lồi dựa trình tự 16S 44 3.3 Xây dựng phát sinh loài dựa mối quan hệ với gen cytochrome. .. Heo lai Việt Nam Heo rừng Việt Nam Heo rừng Rumani Trình tự tương đồng RU1 RU2 RU3 RU4 RU5 RU6 RU7 Hình 15: Vị trí điểm đột biến điểm đa hình vùng trình tự cytochrome b (1140 bp) cá thể heo rừng. .. mối quan hệ cá thể heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha Đài Loan dựa trình tự 997 bp gen 16S 52 Hình 21: Cây phát sinh lồi NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ