Tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết từ 20 mg mẫu cơ của từng cá thể cá bằng bộ kit Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 1). Bảo quản DNA trong tủ đông – 400.
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Đoạn gen 16S của DNA ty thể được khuếch đại với cặp mồi 16SF (5’- CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) và 16SR (5’-CCGGTCTGAACTCAGATC ACGT-3’) (Palumbi và cs, 1991).
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µL bao gồm 2,5 µL Buffer (1X), 5 µL mẫu DNA, 1 µL mỗi mồi (10µM), 0,5 µL dNTP (10µM), 0,125 µL Dream Taq Polymerase (5U/µL) và H2O cho đủ thể tích. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút; sau đó là 38 chu kỳ của 94oC trong 30 giây, nhiệt độ lai 48oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút; cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 7 phút (Hình 2.6).
Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Điện di kiểm tra kết quả
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,7% nhuộm Ethidium bromide
Chuẩn bị gel agarose 1,7% : Cân 0,68 g agarose rồi cho vào 40mL đệm SB 1X chứa trong bình tam giác 100 mL, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 – 700C rồi chuyển qua bình tam giác 100 mL thứ hai. Thêm 1,5 µL Ethidium bromide, lắc nhẹ tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác). Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược (lược 8 giếng hoặc lược 15 giếng). Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra theo phương thẳng đứng để tránh rách các giếng.
Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di và thêm đệm SB 1X cho đến khi ngập bản gel. Dùng micropipette mix đều 4 µL mẫu với 2 µL loading dye 6X, rồi load vào các giếng của gel. Hút 5 µL DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng. Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 500A trong 20 phút.
Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator và xem các band DNA dưới tia cực tím, sản phẩm của quá trình khuếch đại là các band có kích thước vào khoảng 560 bp.
Giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được gửi đến công ty THNHH Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh giải trình tự. Phản ứng giải trình tự được tiến hành theo nguyên tắc Dye – labelles dideoxy terminator (Big Dye Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 96oC trong 20 giây, 50oC trong 20 giây, cuối cùng là 60oC trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems).