Sàng Lọc Và Định Danh Các Chủng Vi Khuẩn Quang Hợp Có Khả Năng Hấp Thu Muối Và Định Hướng Ứng Dụng Giảm Nhiễm Mặn

Chính vì thế, mà những năm gần đây đã và đang có những nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn quang dưỡng có khả năng loại bỏ muối như nghiên cứu mới nhất và hiệu quả nhất là công bố của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG HẤP THU MUỐI VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG GIẢM NHIỄM MẶN

Ngành : Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: TS Hoàng Quốc Khánh

HVCH Ngô Đức Duy

Sinh viên thực hiện: Châu Thị Thùy Linh

MSSV: 1411100757 Lớp: 14DSH01

TP Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS Hoàng Quốc Khánh và HVCH Ngô Đức Duy, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới Những số liệu và kết quả phân tích trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kì nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của

Châu Thị Thùy Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

3 Mục đích nghiên cứu 6

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 6

5 Phương pháp nghiên cứu 6

6 Các kết quả đạt được 6

7 Kết cấu đồ án tốt nghiệp 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam và các hướng giải quyết hiện nay 8

1.1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam 8

1.1.2 Nguyên nhân gây ra xâm nhập mặn 9

1.1.3 Các cách khắc phục xâm nhập mặn hiện nay 10

1.2 Các cơ chế khử muối 12

1.2.1 Cơ chế khử muối trong tự nhiên 12

1.2.2 Cơ chế khử muối của thực vật 12

1.2.3 Cơ chế khử muối của động vật 13

1.2.4 Cơ chế khử muối của vi sinh vật 14

1.3 Giới thiệu về nhóm vi khuẩn quang hợp 15

1.4 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 17

1.4.1 Nguyên tắc 17

1.4.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật 17

1.4.3 PCR trong định danh vi sinh vật 18

1.4.4 Xây dựng cây phát sinh loài 21

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 22

2.2.2 Giống vi khuẩn 22

2.2.3 Hóa chất 22

2.2.4 Các phần mềm sử dụng 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 24

2.3.2 Thu mẫu 25

2.3.3 Tăng sinh 27

2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn quang hợp 27

2.3.5 Bảo quản 28

2.3.6 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn 28

2.3.7 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng hấp thu mặn 28

2.3.8 Định danh các chủng vi khuẩn 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

3.1 Kết quả tăng sinh của vi khuẩn 32

3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn 33

3.3 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn 36

3.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn 39

3.5 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ mặn 42

3.6 Định danh 45

3.6.1 Ly trích, thu nhận DNA 44

3.6.2 Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR 45

3.6.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI 46

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 53

ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cơ chế dung nạp muối trong thực vật: sự hình thành tinh thể trên lá của

Avicennia germinans (A) và lá Atriplex (B) 13

Hình 1.2 Giải thích nguyên nhân sự hấp thu Na+ thông qua hệ thống bơm ion màng (Halorhodopsin) do tác động của ánh sáng là đặc trưng của Cl- 14

Hình 2.1 Mô phỏng vệ tinh khu vực lấy mẫu, xã Hựu Thạnh thuộc huyện Đức Hòa nằm ở

vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc, 106o41’85” Kinh độ Đông 25

Hình 2.2 Một góc bản đồ Liên tiểu khu 104 – xã Viên An Đông, rừng phòng hộ Nhưng

Miên và vị trí lấy mẫu 26

Hình 2.3 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 30 Hình 3.1 Kết quả mẫu RL19 và mẫu RL6 tăng sinh thành công 32 Hình 3.2 Kết quả phân lập sau 7 ngày trên môi trường thạch BIM của chủng CM24 (hình

trái) và kết quả làm thuần của chủng CM24 đang chuyển dần sang đỏ sau 5 – 7 ngày (hình phải) 35

Hình 3.3 Kết quả phân lập trên môi trường thạch BIM của một số chủng vi khuẩn 35 Hình 3.4 Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn quang hợp phân lập

được dưới vật kính 100X 37

Hình 3.5 Chủng RL1 có thể phát triển ở mọi nồng độ muối Nhưng ở nồng độ muối

20‰ thì sự phát triển vượt trội hơn ở các nồng độ muối khác, giá trị OD660 đạt 0,504 sau

7 ngày khảo sát 39

Hình 3.6 Chủng RL8.1 phát tốt ở mọi nồng độ nhưng ở nồng độ muối 10, 15, 20‰ có sự

phát triển cao hơn hẳn, giá trị OD660 ở nồng độ 10‰ đạt 0,824 sau 7 ngày khảo sát 39

Hình 3.7 Chủng 34.3 phát triển tốt ở mọi nồng độ, chúng phát triển tốt nhất ở nồng độ

muối 5‰, giá trị OD660 đạt 0,666 sau 4 ngày và ở nồng độ muối 20%, giá trị OD660 đạt 0,658 sau 7 ngày khảo sát 40

iii

Hình 3.8 Chủng 24.1 phát triển tốt ở mọi nồng đồ muối, chúng phát triển ổn định và tốt

nhất, ờ nồng độ 5‰ giá trị OD660 đạt 0,868, nồng độ 20% giá trị OD660 đạt 0,585 sau 7

ngày khảo sát 40

Hình 3.9 Nồng độ muối của các chủng vi khuẩn (‰) sau khi kiểm tra 43

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn 44

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gene DNA trên gel agarose 1% 45

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gene DNA trên gel agarose 1% sau khi tinh sạch 45

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các tính chất của vi khuẩn quang hợp 16

Bảng 1.2 Các trình tự gene đoạn mồi 16S rRNA 20

Bảng 3.1 Giá trị pH của các mẫu tăng sinh thành công ở tỉnh Long An và tỉnh Cà Mau 31

Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn đã phân lập được 33

Bảng 3.3 Kết quả nhuộm Gram của các chủng 36

Bảng 3.4 Giá trị OD660nm của các chủng ở độ mặn 20‰ sau 7 ngày 41

Bảng 3.5 Giá trị OD660 và mật độ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn sau 48 giờ 42

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Theo báo cáo của Tổ chức Phát triển Nước Thế giới của Liên Hiệp Quốc (The United Nations World Water Development) có khoảng 22% nước dùng cho công nghiệp, 8% nước dùng cho sinh hoạt của con người và 70% nước dùng cho nông nghiệp Nhưng

có tới trên 90% nước dùng cho nông nghiệp phần lớn ở các nước kém phát triển nhất (FAO, 2011a) mà không có các biện pháp sử dụng hiệu quả hay tiết kiệm, bên cạnh đó dự kiến tiêu thụ nước cho nông nghiệp sẽ tăng khoảng 20% toàn cầu vào năm 2050 (WWAP, 2012) Rất nhiều nguyên nhân gây ra sự ô nhiễm nước nông nghiệp ngày càng gia tăng, trong đó ô nhiễm trầm trọng nhất hiện nay là sự xâm nhiễm mặn do biến đổi khí hậu và nước biển dâng Với số liệu thống kê hiện nay cho thấy rằng, có ba phần tư bề mặt Trái đất được bao phủ bởi nước, hơn 97% lượng nước ở dạng nước mặn không thể sử dụng trực tiếp cho ăn uống hoặc nông nghiệp Trong 3% nước ngọt còn lại thì chỉ có khoảng 0,5% là có sẵn dưới dạng nước ngọt nhưng không phân bố đều trên toàn thế giới Thêm vào đó là dân số tăng nhanh, sản xuất nông nghiệp, công nghiệp phát triển ồ ạt và biến đổi khí hậu đã gây ra nhiều vấn đề về môi trường

Một trong những vấn đề môi trường phổ biến nhất xảy ra là xâm nhập mặn vào vùng đất sản xuất nông nghiệp (Freeze và Cherry 1979; Fang 1997; Todd and Mays 2005)

Sự xâm nhập từ nước biển là một mối quan tâm toàn cầu nghiêm trọng gặp phải hiện nay tại các vùng lãnh thổ ven biển như Bắc Phi, Trung Đông, Bờ biển Địa Trung Hải, Trung Quốc, Mexico, Đại Tây Dương, Hoa Kỳ và Việt Nam

Trong hàng triệu năm qua, các vi sinh vật – bậc thầy thích ứng, đã sống sót trên trái đất mà không phải sử dụng quá nhiều năng lượng và tài nguyên cũng như không ảnh hưởng đến môi trường sống Cụ thể, khử muối bằng năng lượng mặt trời thông qua các vi khuẩn quang hợp là một cơ hội có tiềm năng để khai thác mục đích này Các vi khuẩn

quang hợp đặc biệt có thể sinh ra một lượng sinh khối lớn trong nước lợ, nước biển và được sử dụng như một bộ trao đổi ion thông qua các kênh protein màng

Để giải quyết bài toán làm sao giảm mặn trong đất và nước nông nghiệp là rất quan trọng và cần thiết Do vậy, việc đầu tiên là phải có bộ sưu tập chủng vi sinh nói chung

và chủng vi khuẩn quang hợp nói riêng Cho nên đồ án này sẽ bước đầu “Sàng lọc, định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn”

2 Tình hình nghiên cứu

2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Khác với các chất gây ô nhiễm hữu cơ khác, các kim loại nặng nguy hại đa số không thể phá hủy, vì chúng không thể bị suy thoái hóa học hoặc sinh học Thậm chí tệ hơn là một số kim loại nặng có thể tích tụ dọc theo chuỗi thức ăn và cuối cùng tích lũy trong cơ thể con người D.E Crowley và cs (1991), M.M Lasat và cs (1996) Do đó, các nghiên cứu tập trung nhiều vào những năm qua để khắc phục các loại đất bị ô nhiễm, trong đó việc sử dụng thực vật và vi khuẩn để loại bỏ các ion kim loại độc hại đặc biệt có kích thước lớn N.S Pence và cs (2000), R.K Mehra và ca (1991) và D.R Winge và cs (1985) Thông thường nếu một cây có thể tích lũy hơn 1000 mg/kg (hoặc 1000 ppm) Cu, Co, Cr,

Ni hoặc Pb, hoặc hơn 10.000 mg/kg (hoặc 10.000 ppm) của Mn hoặc Zn, nó được xem là nhiễm kim loại nặng quá cao S Loeffler và cs (1989) Vi khuẩn có diện tích bề mặt riêng lớn hơn và hiệu quả hơn để kích hoạt và loại bỏ kim loại nặng

Tuy nhiên, hiện nay hiện tượng nhiễm mặn hay stress muối là một trong những yếu

tố nghiêm trọng nhất làm hạn chế năng suất lúa vì nó ảnh hưởng xấu đến số lượng và chất lượng của cây trồng (Sahi et al 2006) Muối ảnh hưởng đến hầu như tất cả các phần của sinh lý học thực vật ở cả cấp độ thực vật và tế bào thông qua áp suất thẩm thấu và ion (Khalid et al 2010) Do đó, độ mặn có hại cho tất cả các giai đoạn của cây trồng từ nảy mầm hạt giống, tăng trưởng cây con, phát triển, ra hoa và hoa quả và cuối cùng nó làm giảm sản lượng kinh tế và chất lượng của sản phẩm (Nakhoda et al 2012)

Chính vì thế, mà những năm gần đây đã và đang có những nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn quang dưỡng có khả năng loại bỏ muối như nghiên cứu mới nhất và hiệu quả nhất là công bố của Kei Sasaki và cs (2017), việc ứng dụng vi sinh hấp thu độ mặn, kết quả đạt được từ nghiên cứu này là việc loại bỏ Na từ nước biển bằng cách sử dụng hai

chủng vi khuẩn quang hợp Rhodobacter sphaeroides SSI và Rhodovulum sp đều phát triển tốt trong môi trường GM (Glutamate-Malate ) có 3% NaCl Trong đó chủng Rhodobacter

sphaeroides SSI được chứng minh là tăng trưởng tốt, khả năng loại bỏ Na tối đa là 39,3%

trong điều kiện có ánh sáng và 36,7% trong điều kiện tối Còn chủng Rhodovulum sp được chứng minh là phát triển tốt có tỷ lệ loại bỏ Na tối đa là 64,9% bởi Rhodovulum sp

cả hai điều kiện sáng và tối sau hai ngày nuôi cấy Tuy nhiên, vấn đề lớn xảy ra là sau khoảng 2 đến 3 ngày nuôi cấy tiếp theo thì hiện tượng Na quay trở lại môi trường do quá trinh chuyển điện tử và trao đổi chất Còn trong môi trường bổ sung dinh dưỡng khác là môi trường NSSW (Nutrient Supplemented SeaWater) có 5.0g/l Glucose và 2.0g/l Peptone thí nghiệm trong 8 ngày cho thấy rằng Giai đoạn 4 ngày đầu thì cho thấy chủng

Rhodobacter sphaeroides SSI loại bỏ tới 30,3% Na sau 4 ngày nuôi cấy trong điều kiện

có ánh sáng và Rhodovulum sp lên tới 48,9%, trong cả hai trường hợp này hầu như Na

được hấp thụ hoàn toàn mà không có trường hợp trả lại môi trường và kết quả tương tự

đã được quan sát dưới các điều kiện tối Giai đoạn 4 ngày tiếp theo thì dịch nuôi cấy được

li tâm và tách Rhodovulum sp tách ra khỏi dịch nuôi, sau đó cấy chủng Rhodobacter

sphaeroides SSI vào dịch trên nuôi tiếp trong điều kiện tối thì lượng Na cũng sẽ hấp thu

thêm.[13]

Nghiên cứu của Panwichian và cs (2010) về tỷ lệ loại bỏ các kim loại nặng và natri

từ những chủng vi khuẩn quang dưỡng được phân lập mới từ những ao nuôi tôm nhiễm kim loại nặng ở 3 tỉnh phía Nam của Thailand như tỉnh Nakhon Si Thammarat, Patthalung

và Songkhla xung quanh khu vực hồ Basin (Songkhla Lake Basin) Kết quả đa số cho thấy

từ 120 chủng được phân lập ở 31 ao nuôi tôm cho thấy việc loại bỏ kim loại nặng như Pb,

Cu, Cd, Zn không cao lắm Tuy nhiên, có được hai chủng NW16 và KMS24 có khả năng làm giảm nhóm kim loại nặng và Na như sau: 39% Pb, 20% Cu, 7% Cd, 5% Zn và 31%

Na từ nước có nồng độ kim loại nặng cao và khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường 3% NaCl có ánh sáng và trong tối Tuy nhiên, chủng NW16 loại bỏ kim loại nặng tốt hơn chủng KMS24, nhưng ngược lại chủng KMS24 sinh trưởng tốt trong cả hai điều kiện môi trường.[26]

Theo khảo sát ứng dụng chủng Rhodopseudomonas palustris TK103,

Rhodopseudomonas palustris PP803 và Rhodopseudomonas palustris P1 của Thanawan

Kantha và cs (2015), kết quả họ đề xuất sử dụng và phối trộn với rơm và than trấu để làm phân bón cho ruộng lúa với nồng độ gây stress muối khoảng 0,25 % NaCl và làm giảm khí gây hiệu ứng nhà kính như CH4 và CO2 sinh ra từ ruộng lúa Kết quả cho thấy chủng

Rhodopseudomonas palustris PP803 làm cho hạt gạo nẩy mần phát triển tốt như sinh khối

và độ dài của rể trong môi trường đất bị stress muối so với mẫu đối chúng là chỉ có nước Ngoài ra trong mô hình nghiên cứu đồng ruộng dưới điều kiện ánh sáng 10 ngày ước

lượng nồng độ tế bào chủng Rhodopseudomonas palustris PP803 dao động từ 6,7 – 6,8

CFU/ ml và làm giảm 100% CH4 và 47% CO2.[25]

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam và khu vực ĐBSCL được thế giới đánh giá là một trong những nơi bị ảnh hưởng của biến đổi khí hậu dẫn tới xâm nhiễm mặn vào trong vùng đất sản xuất nông nghiệp và sẽ ảnh hưởng to lớn trong tương lai vùng lúa gạo của thế giới Điều này dẫn đến ảnh hưởng không nhỏ tới an ninh lương thực trong nước và toàn cầu Tuy nhiên, hiện nay

đa số những nghiên cứu thích ứng tới hiện tượng nhiễm mặn là chủ động chọn lọc giống cây trồng, chuyển đổi vật nuôi và thay đổi mục đích sử dụng đất Trong đó đã có một số kết quả nghiên cứu về lúa và giống cây trồng chịu mặn như nghiên cứu chọn tạo được các giống lúa mới đạt tiêu chuẩn chịu mặn và phẩm chất tốt sau như giống lúa OM5464, OM5166 được công nhận sản xuất thử nghiệm (Trần Thị Cúc Hòa và cs (2000))

Một nghiên cứu khác cũng được tiến hành để kiểm tra khả năng chịu mặn theo phương pháp của IRRI, 1997 Kết quả đánh giá cấp chống chịu mặn của 5 giống lúa sau

16 ngày thử mặn, giống Đốc Phụng, Lúa Sỏi, Nàng Quớt Biển có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, giống Một Bụi Hồng có khả năng chịu

mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 10‰ khi giống chuẩn nhiễm IR28 ở cấp 9 (rất nhiễm) Giống CTUS1 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, hàm lượng amylose là 20,43%, hàm lượng protein 7,33% Giống CTUS17

có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, hàm lượng amylose là 26,20%, hàm lượng protein là 7,3% CTUS4 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 10‰, hàm lượng amylose 18,00%, hàm lượng protein

là 9,05% (Quan Thị Ái Liên 2012)

Kết quả công bố của Điêu Thị Mai Hoa và cs Giống lúa OM6976- Saltol có khả năng chịu mặn NaCl 150mM ở mức khá (điểm 3) trong khi giống gốc OM6976 mẫn cảm mặn (điểm 7) Giống lúa OM6976-Saltol có khả năng sinh trưởng ở cả giai đoạn nảy mầm và cây con trong điều kiện mặn tốt hơn hẳn so với giống OM6979 Ở nồng độ muối cao (NaCl 150 mM), dòng lúa mang gen chịu mặn OM6976-Saltol có khả năng sinh trưởng mầm, sinh trưởng cây con tốt hơn hẳn so với giống gốc OM6976 không mang gen Saltol Theo tiêu chuẩn của IRIR1997, dòng OM6976-Saltol thể hiện khả năng chịu mặn mức khá ở nồng độ NaCl 150 mM

Tuy có nhiều nghiên cứu về giống lúa chịu mặn để thích ứng kịp thời trong sản xuất lúa gạo phù hợp với sự biến đổi khí hậu dẫn đến xâm nhiễm mặn trong vùng đất sản xuất nông nghiệp Nhưng hiện nay chưa có một công bố khoa học nào liên quan tới quá trình loại muối từ nhóm vi sinh vật nói chung và nhóm vi khuẩn quang dưỡng nói riêng được phân lập và nghiên cứu tại Việt Nam nhằm hướng tới úng dụng trong việc giảm mặn cho những vùng đất và nước bị xâm nhiễm mặn Chính vì thế, trước tiên, nhóm nghiên cứu bước đầu mong muốn phân lập, sàn lọc để tìm ra những chủng vi khuẩn quang dưỡng

phù hợp với điều kiện nhiệt đới của nước ta, cho nên định hướng Đề tài KHCN “Sàng lọc

và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng xử lý giảm mặn” nhằm góp phần vào định hướng phát triển nông nghiệp bền

vững và chủ động ứng phó giải quyết được một phần nào bài toán xâm nhiễm mặn do biến đổi khi hậu ngày càng khóc liệt ở ĐBSCL nói riêng và Việt Nam nói chung

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu

muối và định hướng ứng dụng xử lý giảm mặn

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập một số vi khuẩn quang hợp tại Long An và Cà Mau

Định danh vi khuẩn quang hợp dựa theo hình thái học và sinh học phân tử

Khảo sát khả năng chịu mặn và hấp thu mặn của vi khuẩn quang hợp

4 Phương pháp nghiên cứu

- Thu mẫu nước tại xã Nhị Thành, huyện Thủ Thừa, Long An, huyện Đức Hòa - Long

An và rừng ngập mặn Nhưng Miên, huyện Ngọc Hiển, Cà Mau

- Phân lập vi khuẩn trên môi trường BIM thông qua việc quan sát hình thái tế bào, khuẩn lạc

- Khảo sát khả năng chịu mặn bằng phương pháp đo OD660nm

- Khảo sát khả năng khử mặn bằng phương pháp màng sinh học

- Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB)

- Phương pháp PCR dựa trên cặp mồi 27F và 1492R

- Gửi mẫu giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa

- Đề tài sử dụng các phần mềm như ChromasPro 1.5.0.0, Mega5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0

- Ngân hàng gen https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

- Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam và các hướng giải quyết hiện nay

1.1.1 Tình hình xâm nhập ở Việt Nam

Theo dữ liệu đánh giá trong năm 2015 so với 2016 của Viện Khoa học Thủy lợi Miền Nam (VKHTLMN/2017) cho thấy rằng hiện trạng xâm nhập mặn vùng cửa sông Cửu Long như sau: Khu vực sông Vàm Cỏ: Độ mặn năm 2016 lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,7 - 7,4 g/l, xâm nhập mặn sâu vào đất liền khoảng 90 - 93 km Khu vực các cửa sông thuộc sông Tiền: Năm 2016 có độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm

2015 cao hơn từ 1,5 - 8,2 g/l, sự xâm mặn vào khoảng 45 - 65km Khu vực các cửa sông thuộc sông Hậu: Độ mặn lớn nhất nhất so với cùng kỳ năm 2015, cao hơn từ 2,8 - 6,4 g/l,

dộ nhiễm mặn sâu vào khoảng 55 - 60 km Khu vực trên sông Cái Lớn: Độ mặn lớn nhất

so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,8 - 7,6 g/l, chiều sâu xâm nhập mặn lớn nhất khoảng 60-65 km Trong năm 2017 tại một số trạm điển hình vùng cửa sông Cửu Long như dưới đây: Tại Vàm Kênh, Vàm Giồng và Xuân Hòa trên sông Cửa Tiểu có độ mặn 23,5g/l, 3,6g/l và 0,6g/l thất hơn một chút so với cùng kỳ năm 2016 từ 0,1- 3,9g/L Tại Bình Đại, Lộc Thuận và Giao Hòa trên sông Cửa Đại có độ mặn 25,6g/l, 14,2g/l và 3,2 g/l thấp hơn

so với năm 2016 từ 1,4 - 2,6g/l Tại Bến Trại, Trà Vinh trên sông Cổ Chiên có độ mặn 25,2g/l, 9,6g/l Tại An Thuận, Sơn Đốc trên sông Hàm Luông có độ mặn là 29,0g/l, 13,1g/l Tại Trần Đề, Đại Ngãi trên sông Hậu có độ mặn 20,3g/l và so với cùng kỳ năm

2016 thấp hơn 7,0g/l, 7,2g/l Đa số độ mặn so với cùng kỳ 2016 điều có giảm chút ít, cũng

do một phần năm 2017 lượng mưa trong năm nhiều so với năm 2016 (VKHTLNM 2017) Cho nên dư lượng độ mặn đã để lại trong vùng đất sản xuất nông nghiệp và ăn sâu vào trong đất liền từ các sông như: Sông Vàm Cỏ, sông Tiền, sông Cửa Tiểu, sông Cửa Đại, sông Hàm Luông, sông Cổ Chiên, sông Hậu và sông Cái Lớn đã ảnh hưởng cực kỳ to lớn tới đời sống sinh hoạt của người dân và đặc biệt là vùng sản xuất cây ăn trái và lúa gạo của Việt Nam là rất nghiêm trọng Bên cạnh đó những kết quả đã công bố cũng như dự báo cho thấy tỷ lệ dân số nông thôn bị ảnh hưởng bởi xâm nhập mặn tăng từ 39.5% tại

thời điểm 2012 lên 41.4, 45.3 và 47.6% vào các năm 2020, 2030 và 2050 ( Đoàn Như Hà, 2014)

1.1.2 Nguyên nhân gây ra xâm nhập mặn

Trước tiên, xem sơ lược tiêu chuẩn gọi là nước mặn và một số giải pháp xử lý khử nước mặn thành nước ngọt hiện nay trên thế giới Nước biển chứa khoảng 35g muối trong một lít (tức 35‰) và theo tiêu chuẩn độ mặn trong nước uống là < 0,25‰ Trong đó nước

có độ mặn 0,14‰ thì không ảnh hưởng xấu tới hoa màu Có vài loại hoa màu chịu đựng được nước có độ mặn 0,36‰ Trên mức này, thực vật thông thường có dấu hiệu suy thoái hay bị chết Tuy nhiên, có khoảng 3.500 loài thực vật chịu đựng được nước mặn - gọi là nhóm họ halophytes, trong số này thực vật trong rừng ngập mặn, đứng đầu chịu mặn là

cây Mấm (Avicennia alba) Lúa thông thường không thể canh tác khi nước có độ mặn quá

4‰

Việc Trái Đất ngày càng nóng lên bởi hàng loạt các khí gây hiệu ứng nhà kính phát sinh từ các hoạt động công nghiệp, giao thông và sinh hoạt của con người (trong đó nguyên nhân đến từ hoạt động của tự nhiên chiếm phần nhỏ (bao gồm hoạt động của núi lửa, cháy rừng ) đã khiến băng ở hai cực và nhiều khu vực khác trên thế giới tan chảy mạnh, gây nên đại nạn nước biển dâng

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học đăng tải trên Tạp chí Scientific Reports, biến

đổi khí hậu đang khiến mực nước biển dâng trung bình 4mm mỗi năm

Việc nước biển dâng cao tác động trực tiếp đến các quốc gia ven biển Không chỉ khiến các quốc gia này hứng chịu nhiều cơn bão mạnh, nước biển xâm lấn còn khiến đất ngập mặn trên quy mô lớn

Theo các chuyên gia đánh giá, Việt Nam là quốc gia có mực nước dâng cao hơn mức trung bình toàn cầu Điều này đồng nghĩa với việc mức độ phì nhiêu của vùng châu thổ lớn nhất nước (ĐBSCL) sẽ giảm dần diện tích

Theo số liệu thống kê của Viện Quy hoạch Thủy lợi miền Nam, hiện tượng sạt lở đã

và đang xảy ra ngày một nghiêm trọng ở hai bên bờ sông Tiền và sông Hậu (vùng thượng

và hạ châu thổ), nhất là vào khoảng thời gian đầu và cuối mùa mưa lũ, tác động đến đời sống và sản xuất của khoảng 19 triệu dân tại đây

Cà Mau được xem là một trong những tỉnh chịu tác động nặng nề nhất do biến đổi khí hậu và nước biển dâng (Có nơi, nước biển cách con lộ ở Cà Mau chỉ vài chục mét) Mỗi năm, biển lấn sâu vào Cà Mau 15m, có khu vực lên đến 50m

Bên cạnh nguyên nhân nước biển dâng cao, thì các hoạt động khai thác tự nhiên (như khai thác cát ở sông và khai thác nước ngầm) một cách tràn lan của con người cũng là những nguyên nhân khiến cho những thách thức mà ĐBSCL đang đối mặt thêm nặng nề

1.1.3 Các cách khắc phục xâm nhập mặn hiện nay

Quyết định số 1397/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ về Quy hoạch phát triển thủy lợi ĐBSCL giai đoạn 2012 - 2020 và định hướng đến 2050 trong điều kiện biến đổi khí hậu, nước biển dâng đã đặt mục tiêu đến năm 2050 cần đảm bảo an toàn dân sinh, sản xuất, cơ sở hạ tầng cho khoảng 32 triệu dân và chủ động ứng phó với các tác động của biến đổi khí hậu như nước biển dâng, xâm nhập mặn Để làm rõ thực trạng xâm nhập mặn

và những giải pháp phát triển bền vững nhằm hạn chế xâm nhập mặn tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là những nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất của hiện tượng này

Từ đó có nhiều đề xuất giải pháp để ứng phó với xâm nhập mặn ở ĐBSCL như sau: Thứ 1: Tăng cường quan trắc, giám sát, nâng cao năng lực dự báo mặn Thứ 2: Tăng cường hợp tác quốc tế với các nước trong hội Mekong và Trung Quốc; phải hợp tác chặt chẽ với các nước trong lưu vực sông Mekong Thứ 3: Điều chỉnh quy hoạch tổng thể và sản xuất nông nghiệp cho khu vực Thứ 4: Lựa chọn cây trồng vật nuôi thích nghi với điều kiện khô hạn và môi trường nước mặn, nước lợ Thứ 5: Kiện toàn hệ thống đê và thành lập nhiều khu tứ giác trước hết cần nhân rộng mô hình thành công ở Tứ giác Long Xuyên và ngọt hoá Gò Công Thứ 6: Xây dựng và hoàn thiện hệ thống công trình giữ nước ngọt trong đồng bằng đòi hỏi phải xây dựng và hoàn thiện một hệ thống công trình giữ nước ngọt cho toàn đồng bằng Thứ 7: Xây dựng đập ngầm như đập Ba Lai, trên tất cả các cửa sông ở ĐBSCL có các hạn chế Thứ 8: Xây dựng hệ thống đê biển, đê sông Đây là một

dự án lâu dài, bền vững dọc theo biển Đông và biển Tây để ứng phó với mực nước biển dâng cao Thứ 9: Quản lý tổng hợp tài nguyên nước khu vực ĐBSCL và lưu vực sông Mekong

Từ những giải pháp trên đã ít nhiều đem lại hiệu quả ngăn chặn sự nhiễm mặn trong thời gian qua Tuy nhiên, đa số điều bị động và phục thuộc vào nhiều về yếu tố tự nhiên

và điều kiện từ các nước láng giềng như là tích trữ nước, chờ mưa rửa trôi độ mặn và chờ

sự kết hợp điều tiết từ Biển Hồ của Campuchia, các đập thủy lợi trên sông Mekong và cả nguồn nước từ thượng nguồn từ Trung Quốc (BKHCN 2016)

Nhờ tiến bộ công nghệ trong ngành khử mặn nước biển trong những thập kỷ qua đã đưa ra nhiều giải pháp cho vấn đề này và những nước phát triển mạnh hàng đầu như Israel, Singapo và Mỹ các phương pháp được ứng dụng cho khử mặn từ nước biển như: chưng cất nhanh nhiều tầng (MSF/multistage flash distillation), chưng cất nén hơi (VCD/vapor compression distillation), thẩm thấu ngược (RO/reverse osmosis), thẩm thấu tới (FO/forward osmosis), trao đổi ion (IC/Ion exchange) và điện thẩm tách (ED/electrodialysis) [19] Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm của mình, nhưng hiện nay phương pháp thẩm thấu ngược (RO) được sử dụng nhiều nhất, vì trang thiết bị dễ thực hiện và ít tiêu hao năng lượng nhất Nhà máy khử mặn Sorek của Israel ở phía bắc Palmachim được dự đoán sẽ cung cấp tới khoảng 228 triệu m³/ năm, nhà máy Hadera (SWRO) là nhà máy khử muối lớn nhất trên thế giới Chỉ riêng trong năm 2015, hơn 50% lượng nước cho các hộ gia đình, nông nghiệp và công nghiệp của Israel được sản xuất nhân tạo Dự kiến trong tương lại không xa thì chương trình khử muối của Israel cung cấp khoảng 35% lượng nước uống của Israel và 70% vào năm 2050 [27] Còn ở Singapore có

kế hoạch để đáp ứng 30% nhu cầu nước trong tương lai vào năm 2060, còn hiện tại thì đáp ứng được 25% nhu cầu nước 2017 của Singapore theo thống kế Các nhà máy như SingSpring, Tuas (2005) cung cấp 13.000m3/ngày, nhà máy Marina East (2020) 130.000 m3/ngày và Jurong (2020) 130.000 m3/ngày [26] Tuy nhiên, đa số các phương pháp và ứng dụng trong việc sử lý nước mặn thành nước ngọt điều nhằm mục đích phục vụ cho sinh hoạt ăn uống của con người.Vì giá thành xử lý nước rất cao, đó cũng là một vấn đề khó khăn trong việc ứng dụng cho trồng trọt và nông nghiệp

Do vậy, những nghiên cứu về khả năng loại bỏ Na ra khỏi nước mặn từ các nhóm

vi sinh vật rất cần được ưu tiên nhiều hơn cho các nghiên cứu hiện nay Điều này đã mở

ra một hướng đi mới trong việc “biến” nước mặn thành nước ngọt Do đó đề tài “Phân

lập và định danh chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu mặn” được thực hiện

1.2 Các cơ chế khử muối

Ý tưởng sử dụng trực tiếp sinh vật sống như thực vật thủy sinh, tảo, động vật phù du

và vi khuẩn để khử mặn nước biển gần đây đã được nghiên cứu như là một lựa chọn hấp dẫn cho hấp thu mặn nước biển Trong đó, sử dụng màng sinh học để khử muối được xem như là một phương pháp tiếp cận bền vững mới nổi trong quá trình khử sinh học

1.2.2 Cơ chế khử muối trong tự nhiên

Natri và clorua là các ion hòa tan nhiều nhất trong nước và đất mặn [4] Chúng đóng vai trò sinh lý quan trọng trong hầu hết các sinh vật sống Tuy nhiên, nồng độ natri cao trong các tế bào có thể dẫn đến tổn thương protein và cản trở sự trao đổi chất [7] Do đó, các sinh vật sống đã sử dụng các cách khác nhau để cân bằng nồng độ natri [21], trong đó bao gồm:

- Sự tắc nghẽn Na+ xâm nhập vào không bào (kháng muối)

- Giảm nồng độ Na+ trong không bào (dung nạp muối) qua hệ thống vận chuyển phức tạp qua màng tế bào

1.2.3 Cơ chế khử muối của thực vật

Độ mặn cực cao là một vấn đề nghiêm trọng đối với cây trồng vì nó hạn chế sự hấp thu nước, làm biến tính các enzyme và làm suy giảm cấu tr9úc của đất Do đó, thực vật dựa vào các cơ chế phức tạp để chống lại các điều kiện mặn [21] Các cơ chế này thường

được phân loại thành tiết muối (ví dụ: Avicennia sp.), tích tụ muối (Atriplex sp.) và loại

Cơ chế loại trừ muối dựa trên sự tắc nghẽn muối [13] sử dụng các tính năng cụ thể

như antiporters Vi tảo xanh Dunaliella salina là một ví dụ điển hình của các loại cây

không bao gồm muối vì nó có thể tồn tại ở mức cao như 3M NaCl [22] do khả năng ngăn chặn muối cực cao của nó Khả năng này là do sự hiện diện của một antiporter Na+/H+trên màng không bào (tonoplast) và H+/ATPase bơm trên màng plasma

Hình 1.1 Cơ chế dung nạp muối trong thực vật: sự hình thành tinh thể trên lá của

Avicennia germinans (A) và lá Atriplex (B)

1.2.4 Cơ chế khử muối của động vật

Cá biển (ví dụ: Heterodontus portusjacksoni), chim biển (ví dụ: Larus marinus) và một số loài bò sát (ví dụ: Amblyrhynchus cristatus) sử dụng thận và tuyến muối để khử

muối [17] Có rất nhiều ống tiết ở các tuyến muối có đường kính và chiều dài thay đổi tùy thuộc vào sự hấp thu muối của loài này [5] Tuyến muối cho phép các loài bò sát và chim biển tiết ra một cách hiệu quả độ mặn Những động vật này sử dụng một loạt các phản ứng phức tạp bao gồm các ion clorua tạo thành một gradient điện, cho phép natri đi qua các điểm nối chặt của các tế bào tiết vào ống dẫn với một lượng nước không đáng kể [9]

1.2.5 Cơ chế khử muối của vi sinh vật

Hình 1.2 Giải thích nguyên nhân sự hấp thu Na+ thông qua hệ thống bơm ion màng

(Halorhodopsin) do tác động của ánh sáng là đặc trưng của Cl-

Cơ chế liên quan tới quá trình hấp thu độ mặn hay còn gọi là hấp thu Na+, có liên quan tới vi sinh vật cơ chế khử muối đối với các sinh vật đơn bào như vi khuẩn, áp lực thẩm thấu cần được kiểm soát khi sống trong điều kiện nước mặn Do đó, các cơ chế tự nhiên có liên quan nhất trong vi khuẩn halophilic là quá trình điều hòa giữa các kênh

Na+ và K+, chủng Halobacillus halophilus, sử dụng điều tiết thích nghi độc đáo với

những thay đổi về độ mặn môi trường Chúng có khả năng tích tụ Cl- nhờ ánh sáng mặt trời kích hoạt làm bơm ion âm Cl- trên màng tế bào mở ra và ion Cl- đi vào trong tế bào chất, từ đó dẫn đến sự chênh lệch điện thế trong màng mang nhiều điện tích âm hơn và ngoài màng mang nhiều điện tích dương hơn xem hình 1.2 Khi điện thế màng chênh lệch trong âm hơn thì lúc ngày kênh ion Na+ sẽ mở ra làm cho quá trình vận chuyển Na+cũng từ ngoài vào trong màng để cân bằng điện thế màn, sự di chuyển và tích tụ Na+

trong tế bào chất sẽ làm giảm Na+ ngoài màng dẫn đến muối sẽ giảm trong dung dịch, việc giữ Na+ trong màng không cho ra khỏi tế bào để quay lại môi trường sẽ bị được ngăn chặn thông qua sự ức chế sản sinh ATP từ quang hợp.

1.3 Giới thiệu về nhóm vi khuẩn quang hợp

Về mặt phân loại, vi khuẩn quang hợp thuộc ngành vi khuẩn, lớp chân khuẩn, bộ khuẩn ốc hồng Hiện đã biết vi khuẩn quang hợp của bộ khuẩn này gồm hai bộ phụ, bốn

họ, mười chín giống, khoảng 49 loài Hiện nay, vi khuẩn quang hợp, sử dụng trong nuôi thuỷ sản thông thường phần lớn là một loại vi khuẩn trong họ khuẩn ốc hồng, nhất là khuẩn giả đơn bào hồng ở ao đầm có nhiều

Vi khuẩn quang hợp là loại vi sinh vật trong thuỷ quyển, phân bố rộng rãi ở ruộng nước ao hồ, sông ngòi, hồ, biển và trong đất, đặc biệt là trong đất bùn dưới nước bị vật hữu

cơ ô nhiễm số lượng tương đối nhiều

Vi khuẩn quang hợp do sự khác nhau về giống loài, và môi trường mà hình dạng không như nhau, có loại hình que, hình lưỡi liềm, hình tròn, hình cầu…Vật bồi dưỡng dịch thể của chúng vì chứa sắc tố khác nhau mà có nhiều màu đỏ, nâu, vàng…Ðặc điểm của loại

vi khuẩn này là tính thích ứng mạnh, bất kể là trong nước biển hay trong nước ngọt, trong những điều kiện khác nhau có ánh sáng mà không có oxy hoặc tối tăm mà có oxy đều có thể lơị dụng chất hữu cơ (acid béo cấp thấp, amino acid, đường) để phát triển Trong điều kiện không có oxy, có ánh sáng, có thể lợi dụng các sunfit, phân tử H hoặc vật hữu cơ khác làm thành dioxide carbon CO2 cố định tiến hành tác dụng quang hợp; trong điều kiện có oxy và tối tăm, chúng có thể lợi dụng vật hữu cơ như acid béo cấp thấp tạo nguồn carbon

để tiến hành tác dụng quang hợp [2]

Nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố lục Chất diệp lục của vi khuẩn khác với chất diệp lục của thực vật VKQH không sử dụng nước là nguồn hidro như thực vật và không tạo sản phẩm cuối cùng là oxi Chúng sử dụng nguồn hidro là sulfide thiosulfate, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa

Có ba nhóm lớn gồm năm nhóm vi khuẩn quang hợp Theo đó, vi khuẩn lam khác về

cơ bản với bốn nhóm còn lại ở chỗ chúng có sản sinh oxi, bằng cách dùng nước làm chất cho điện tử Về phần các vi khuẩn tía và vi khuẩn lục thì chúng quang hợp không sản sinh oxi do sử dụng các chất khử như hidro sulfur, lưu huỳnh, hydro và các chất hữu cơ làm

nguồn điện tử để tái tạo NADH và NADPH Kết quả là chúng không sinh oxi nhưng sinh

ra các hạt lưu huỳnh, ở bên trong tế bào (vi khuẩn tía, lưu huỳnh) hoặc bên ngoài tế bào

(vi khuẩn lục, lưu huỳnh) Ngoài ra là những khác biệt về các sắc tố quang hợp, nhu cầu dinh dưỡng, quan hệ với oxi…[1]

Bảng 1.1 Các tính chất của vi khuẩn quang hợp [28]

Như cột bên trái Các màng được phủ

H, HS, S Hữu cơ và vô cơ: đường,

aicd amin, acid hữu cơ,

H, S

H, HS, S Thường là chất hữu cơ,

các hợp chất lưu huỳnh khử hoặc H

Không sinh oxi Không sinh oxi Không sinh oxi Không sinh oxi Sinh oxi (đôi khi

không sinh oxi tùy tiện)

Quang tự dưỡng vô cơ, hiếu khí bắt buộc

Thường quang dị dưỡng hữu cơ kị khí, một số quang tự dưỡng vô cơ tùy tiện (trong bóng tối, hóa dị dưỡng hữu cơ)

Quang tự dưỡng vô cơ hiếu khí

1.4 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

1.4.1 Nguyên tắc

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy

do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng

ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease và ribonuclease)

1.4.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật Sự phức tạp tính di truyền của cộng động vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gene hiếm

và những vi sinh vật chưa được khám phá Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục

vu cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết Quy trình ly trích DNA cần phải đảm bảo

về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu tiếp theo

Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp

Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật tự nhiên thường được sử dụng:

Chuyển động nhờ tiên mao ở đỉnh hoặc không chuyển động; một số có bóng khí

Không chuyển động hoặc chuyển động trượt, một số có bóng khí

Phần

trăm G

+ C

- Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo Phương pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao (1.5M NaCl) và

ủ mẫu trong 2 – 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammoniumbromide

và proteinase K

dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò chính trong tách chiết acid nucleic Ly trích DNA cần phải có cà hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết

quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến 65oC Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao

và tan băng ở -65oC trong ba chu kì nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNAt tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên

1.4.3 PCR trong định danh vi sinh vật

1.4.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Đây là một kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống Hiện nay, PCR đã trở thành một kỹ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene

PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài

để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA

polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [21]

143.3.2 Ribosome DNA (rDNA)

Ribosome DNA (rDNA) là nhóm gene mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài Ribosome DNA được quan tâm đến nghiên cứu vì nó là một gene có nhiều bản sao và đặc biệt là không mã hóa cho một loại protein nào Các bản sao của gene nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa Phần lớn phân tử ribosome DNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở

để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều primer

và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện

và định danh vi sinh vật

Ribosome DNA (rDNA) được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm Bằng cách tách gene, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA

1.4.3.2 Mồi

Gene 16S rRNA được sử dụng cho các nghiên cứu phát sinh loài do nó bảo tồn cao giữa các loài vi khuẩn và archaea khác nhau [3] Carl Woese đi tiên phong trong việc sử dụng rRNA 16S [25] Một số loài cổ vật nhiệt đới (như Thermoproteales đặt hàng) chứa các intron rRNA 16S nằm trong các khu vực được bảo tồn cao và có thể ảnh hưởng đến quá trình ủ các primer “phổ biến” [11] Chloroplastic và rRNA ti thể cũng được khuếch đại

Cặp primer phổ biến nhát được phát minh bởi Weisburg et al và hiện đang được gọi

là 27F và 1492R [25]

Tuy nhiên, đối với một số ứng dụng, amplicon ngắn hơn có thể là cần thiết, ví dụ như cho 454 trình tự hóa học Titanium (500-ish là lý tưởng) cặp primer 27F – 534R phủ V1 đến V3 [27] Thường 8F được sử dụng thay vì 27F Hai mồi gần giống nhau, nhưng

27F có M thay vì C, AGAGTTTGATC M TGGCTCAG so với 8F [20]

Bảng 1.2 Các trình tự gene đoạn mồi 16S rRNA

1.4.3.4 Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật

Hoàng Quốc Khánh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Phạm Thị Lan Thanh thuộc Trường Đại học Lạc Hồng với đề tài “Phân lập,

định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ con người”

L V, K Hatai và T Aoki 2004, “Fusarium incarnatum isolated from black tiger

shrimp, Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease culture in VietNam”

Nguyễn Thị Thanh Thủy, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên với đề tài “Thiết lập

phương pháp PCR để xác định vi khuẩn Verotoxigenic e.coli (vtec) trong thịt” với phương

pháp PCR phức với 3 loại cặp mồi (VT1, VT2 và eae), các điều kiện phản ứng như đã được thiết lập và chuẩn hóa trong nghiên cứu này có thể được áp dụng để xác định vi

khuẩn Verotoxigenic e.coli (VTEC)

M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, Evensen, P van West và I Skaar

2015, “Saprolegnia diclina IIIA and S.parasitica employ different infection stategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L”

Văn Hồng Cẩm, Phan Thị Thảo, Đặng Thúy Bình với đề tài “Phân lập và định danh

vi khuẩn phát sáng gây bệnh trên cá ngựa đen (Hippocampus kuda)”

1.4.4 Xây dựng cây phát sinh loài

Các phương pháp giải trình tự đoạn gene 16S rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học và tin học (sinh tin học) Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa Một cây phát sinh loài gồm các thành phần như sau:

bắt nguồn từ tổ tiên chung Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài

- Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gene được

sử dụng phổ biến trong định danh phân loại

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian bắt đầu nghiên cứu: ngày 27/02/2018 đến ngày 07/2018

Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi

sinh, thuộc phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP6, P.Linh Trung, quận Thủ Đức, TP.Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị

2.2.2.Giống vi khuẩn

Vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn từ ruộng lúa từ xã Nhị Thành, huyện Thủ Thừa, Long An, huyện Đức Hòa - Long An và Liên tiểu khu 167, rừng phòng hộ Nhưng Miên, xã Viên An Đông, huyện Ngọc Hiển, Cà Mau

2.2.3 Hóa chất

2.2.3.1 Môi trường tăng sinh và nuôi cấy vi sinh vật

Glycerol 1,5 g

Điều chỉnh pH = 7.0

2.2.3.2 Môi trường khảo sát khả năng sinh trưởng ở các độ mặn khác nhau

❖ Môi trường BIM trong đó NaCl được bổ sung để có nồng độ 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40‰

2.2.3.3 Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử

- Đệm CTAB: Tris-Cl 0.2M pH 7.5, NaCl 2M, EDTA 0.05M, CTAB 2%

- P:C:I (25:24:1): Polyphenol – Chloroform – Isoamyl – alcohol

dựng cây phát sinh loài

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Thu mẫu nước ruộng/ao nuôi tôm

Cấy trang trực tiếp trên

môi trường BIM agar

Tăng sinh trong môi trường BIM từ 10 – 20 ngày

Cấy trang trên môi trường

Khảo sát khả năng hấp thu mặn

Giữ giống trong thạch nghiêng, glycerol lạnh đông

mặn

2.3.2 Thu mẫu

2.3.2.1 Địa điểm thu mẫu

Các mẫu nước được thu nhận từ ao ruộng, rừng ngập mặn ở huyện Đức Hòa, thuộc tỉnh Long An và huyện Ngọc Hiển, thuộc tỉnh Cà Mau Tổng cộng thu được 22 mẫu nước ruộng ở Long An, 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn ở Ngọc Hiển, Cà Mau

Các mẫu nước từ ao ruộng thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc,

106o41’85” Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ớ ấp 2 và ấp 4, xã Hựu Thạnh

Hình 2.1 Mô phỏng vệ tinh khu vực lấy mẫu, xã Hựu Thạnh thuộc huyện Đức Hòa

nằm ở vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc, 106o41’85” Kinh độ Đông Các mẫu từ rừng phòng hộ Nhưng Miên, liên tiểu khu 167 - Viên An Đông, huyện Ngọc Hiển, Cà Mau nằm ở vị trí 8o66’65” vĩ độ Bắc, 105o00’28” Kinh độ Đông

Hình 2.2 Một góc bản đồ Liên tiểu khu 104 – xã Viên An Đông, rừng phòng hộ

Nhưng Miên và vị trí lấy mẫu

2.3.2.2 Thời gian thu mẫu

- Buổi sáng để xác định hướng ánh sáng rọi trực tiếp

2.3.2.3 Phương pháp lấy mẫu

Thu mẫu nước ruộng lúa nơi có ánh sáng mặt trời rọi trực tiếp

Lấy nước và một ít bùn ở mặt nước nông

2.3.3 Tăng sinh

2.3.3.1 Cấy trang mẫu

• Đối với mẫu trực tiếp

- Lắc đều mẫu Hút 1 ml dịch mẫu cho vào eppendorf, tiến hành ly tâm 1000 rpm trong vòng 1 phút Sau đó, hút 100μl dịch lỏng cho vào đĩa thạch môi trường BIM, tiến hành cấy trang Đặt các đĩa đã trang ở nơi có ánh sáng

- Sau 7 – 10 ngày, chọn 1 – 2 khuẩn lạc đặc trưng, có ít nhất một đặc điểm khác nhau

về kích thước hoặc màu sắc Tiến hành cấy ria khuẩn lạc đã chọn ra môi trường thạch BIM và đặt nơi có ánh sáng

• Đối với mẫu tăng sinh

- Lắc đều mẫu Hút đầy tới vạch ống nghiệm chứa 20ml môi trường BIM Sau đó, đặt các ống nghiệm ở nơi có ánh sáng trong vòng 10 – 20 ngày Tiếp theo, pha loãng bằng nước cất ra nồng độ 10-4 và 10-5 Cấy trang các nồng độ pha loãng lên đĩa thạch môi trường BIM

- Sau 7 – 10 ngày, chọn 1 – 2 khuẩn lạc đặc trưng, có ít nhất một đặc điểm khác nhau

về kích thước hoặc màu sắc Tiến hành cấy ria khuẩn lạc đã chọn ra môi trường thạch BIM và đặt nơi có ánh sáng

2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn quang hợp

Tiến hành xác định hình thái tế bào, nhuộm Gram, khảo sát khả năng chịu mặn

2.3.5 Bảo quản

• Giống thạch nghiêng: Cấy ria giống từ đĩa thạch sang các ống thạch nghiêng BIM

Đặt nơi có ánh sáng Khi thấy đường sinh khối mọc đều dày đặc thì bảo quản ở 10oC

để sử dụng cho các khảo sát sau Thời gian bảo quản 1 – 2 tháng

• Giống lạnh đông: hút 500μl dịch nuôi cấy 48h (môi trường BIM) của các chủng cho

vào eppendorf 1.5ml vô trùng Tiếp tục cho vào 500μl glycerol 40% (v/v) Vortex trong 5 giây Bảo quản ở -80oC Thời gian bảo quản 1 – 2 năm

2.3.6 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn

Nuôi cấy các chủng vi khuẩn đã sàng lọc sơ bộ trong môi trường lỏng BIM có nồng

độ NaCl từ 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40 ‰ đặt nơi có ánh sáng Khả năng tích lũy sinh khối của chủng vi khuẩn được xác định hàng ngày bằng phương pháp đo độ hấp thụ

Từ các ống nghiệm nuôi cấy, hút ra 200 μl dịch bơm vào các giếng nuôi cấy trên đĩa

96

Tiến hành đo OD660

Quan sát trong vòng 8 ngày và lập biểu đồ tăng trưởng