Nghiên Cứu Sàng Lọc Và Thu Nhận Aptamer Đặc Hiệu Kháng Sinh Streptomycin Và Ứng Dụng Để Xác Định

GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - ĐẶNG THỊ THU PHƯƠNG NGHIÊN CỨU, SÀNG LỌC VÀ THU NHẬN APTAMER ĐẶC HIỆU KHÁNG SINH STREPTOMYCIN VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn:PGS.TS LÊ QUANG HUẤN Viện Công nghệ sinh học Hà Nội – 12/2015 Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn MỞ ĐẦU *** Kháng sinh có vai trị quan trọng chăn nuôi giúp tăng hiệu quả, thúc đẩy tăng trưởng, ngăn ngừa bệnh tật Streptomycin kháng sinh aminoglycoside có tác dụng diệt khuẩn cách ngăn cản trình tổng hợp bình thường protein vi khuẩn, thường xuyên bổ sung vào thức ăn chăn ni để phịng chống bệnh cho gia súc Phổ kháng khuẩn streptomycin bao gồm vi khuẩn Gram âm hiếu khí số vi khuẩn Gram dương; streptomycin khơng có tác dụng với vi khuẩn yếm khí Streptomycin có hoạt tính đặc biệt chống M.tuberculosis M.bovis Streptomycin có hoạt tính chống số vi khuẩn Gram dương Gram âm hiếu khí : Brucella, Francisellatularensis, Yersinia pestis, Escherichia coli,… Tuy nhiên bên cạnh mặt có lợi, streptomycin gây nhiều tác hại gây dị ứng, rối loạn quan chức thần kinh, thính giác, tạo máu,…Thêm vào đó, việc sử dụng streptomycin nơng nghiệp có liên quan đến gia tăng tượng kháng kháng sinh nguy tiềm tàng tác động đến sức khỏe người Do đó, tồn dư kháng sinh môi trường thực phẩm vấn đề quan tâm Hiện nay, có ba phương pháp chủ yếu để xác định dư lượng kháng sinh Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LCMS/MS đáp ứng yêu cầu quan thẩm quyền nước nhập chấp nhận Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi đầu tư chi phí cao thiết bị, chi phí vận hành, kỹ trình độ kiểm nghiệm viên Do vậy, khơng phù hợp với phịng kiểm nghiệm quy mơ nhỏ hay phịng kiểm nghiệm địa phương Vài năm gần đây, cách tiếp cận phương pháp phân tích dựa phản ứng kháng nguyên-kháng thể (enzyme linked immunosorbent assay ELISA) trở thành công cụ hữu hiệu quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method) Liên minh châu Âu (quyết định Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA phân tích dư lượng chất kháng sinh cấm, nhiên có yêu cầu khắt khe giới hạn phát độ không đảm bảo đo, tỷ lệ dương tính giả âm tính giả xét nghiệm Một phương pháp tập trung nghiên cứu để xác định dư lượng kháng sinh phương pháp aptasensor (sử dụng aptamer tham gia cấu tạo sensor) điện hóa Aptamer oligonucleotide (các acid ribonucleoic, RNA sợi đơn acid deoxyribonucleic, ssDNA) phân tử peptide có cấu hình khơng gian đặc trưng có khả nhận biết gắn kết với phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng Aptamer trở thành lớp chất có nhiều tiềm hy vọng để tạo KIT chẩn đốn thuốc điều trị hướng đích, Với ưu điểm vượt trội, tiến hành nghiên cứu khả sử dụng aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin nhằm tạo KIT xác định nhanh kháng sinh thực phẩm Aptasensor Biosensor, thiết bị phân tích có khả chuyển tín hiệu sinh học thành tín hiệu quang tín hiệu điện Đối với aptasensor điện hóa bao gồm yếu tố thành phần: (1) Phần nhận biết sinh học aptasensor aptamer; (2) Phần chuyển đổi khuếch đại tín hiệu nhận biết thành tín hiệu điện định lượng; (3) Phần xác định cường độ tín hiệu điện Từ kết liên quan tới tín hiệu điện suy lượng chất phân tích cần xác định Biosensor theo nguyên lý điện hóa hoạt động theo nguyên lý chuyển hóa trực tiếp tượng sinh học thành tín hiệu điện để đo thiết bị điện Trong khuôn khổ luận văn, tiến hành đề tài: “nghiên cứu sàng lọc thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh sữa” Mục tiêu đề tài : Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn - Xây dựng quy trình sàng lọc aptamer (có chất DNA) có khả nhận biết gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Tách dòng chọn dòng aptamer gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Xác định trình tự xây dựng cấu trúc bậc aptamer thu nhận - Xây dựng quy trình ELISA phát dư lượng streptomycin sữa Nội dung nghiên cứu: - Chuẩn bị thư viện DNA có độ đa dạng khoảng 1015 phân tử - Sàng lọc Aptamer đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Tách dòng chọn dịng aptamer thu có lực cao với kháng sinh đích - Sử dụng phương pháp ELISA để phát dư lượng kháng sinh streptomycin CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU *** Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn 1.1.Tổng quan streptomycin 1.1.1 Kháng sinh streptomycin Kháng sinh gọi trụ sinh chất có khả tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm phát triển vi khuẩn cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn cấp độ phân tử, thường vị trí quan trọng vi khuẩn hay phản ứng trình phát triển vi khuẩn Từ “antibiotics” (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ “antibiosis” “anti” có nghĩa “chống lại” “biosis” có nghĩa “cuộc sống” Chất kháng sinh tác động, chống lại số loại vi khuẩn Thật vậy, chất kháng sinh chất hoá học lấy từ thể vi sinh vật vi khuẩn, nấm mốc, vài thực vật Streptomycin aminoglycoside sản xuất thương mại phân lập từ chủng Streptomyces griseus năm 1944 sử dụng hiệu điều trị bệnh lao Các streptomycin tạo muối với acid vô Các loại muối kháng sinh thường gặp sunfat, clohydrat, photphat có phức canxi clorua streptomycin clohydrat Các muối hồ tan nước, khơng tan clorofooc, cồn ethel Tên quốc tế : Streptomycine Loại thuốc: kháng sinh nhóm aminoglycoside Streptomycin kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng diệt khuẩn cách ngăn cản trình tổng hợp bình thường protein vi khuẩn Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Hình 1.1 Cấu trúc streptomycin dihydrostreptomycin Họ thuốc penicillins Chất hoạt động n amoxicillin ampicillin benzylpenicillin Họ thuốc Chất hoạt động n chlortetracycline oxytetracycline dihydrostreptomycin cloxacillin gentamycin nafcillin kanamycin penethamate neomycin streptomycin tetracyclines aminoglycosides Bảng 1.1 Phân loại (n : loại nhóm) hợp chất hoạt động có thuốc thú y đăng ký Bỉ áp dụng để quản lý q trình sản xuất sữa bị ( 5/8/2010 - Anon.) Trong thú y thường dùng streptomycin sulfat Trong hàm lượng Dihydro streptomycin chiếm 79,87%  Tác dụng: Tác dụng cầu khuẩn gram (+) kháng penicilin, tụ cầu khuẩn, đóng dấu, nhiệt thán, phế cầu, liên cầu (có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh nhóm β lactam) Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Tác dụng chủ yếu vi khuẩn gram (-) Đặc biệt nhạy cảm là: vi khuẩn tụ huyết trùng, E.coli, shigella (lỵ), pseudomonas, salmonella (vi khuẩn thương hàn), Haemophilus, Brucella Đặc biệt tác dụng trực khuẩn lao, brucella xoắn khuẩn (leptospira) Vi khuẩn kháng streptomycin: khuẩn kỵ khí, trực khuẩn mủ xanh số nấm bệnh Hấp thu nhanh qua mao mạch thải trừ qua thận sau tiêm nồng độ streptomycin cao máu vào thứ Thải trừ nhanh qua thận 50-70% sau 12 thải trừ hết Ứng dụng điều trị: Người ta thường kết hợp streptomycin với sulfamid hay với thuốc khác để trị bệnh viêm nhiễm vi khuẩn gây Theo thị Y tế, khơng dùng streptomycin cho đường tiêu hóa Streptomycin gây phản ứng mẫn cảm da thường xuất vào tuần thứ Hết sức thận trọng để chọn liều thích hợp với người bệnh suy thận Với người tăng ure huyết trầm trọng, liều đơn tạo nồng độ thuốc cao máu vài ngày tích luỹ gây độc tai Khi điều trị dài ngày Streptomycin, kiềm hoá nước tiểu giảm thiểu ngăn ngừa kích ứng thận Trẻ em không dùng Streptomycin vượt liều khuyến cáo gặp hội chứng ức chế thần kinh trung ương trẻ dùng liều.[2,3,12,13] Kháng sinh streptomycin đồng phân nó, dihydrostreptomycin sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh nhiễm khuẩn gia súc, cừu, lợn gia cầm Chúng nhóm aminoglycoside chủ yếu hoạt động chống lại vi khuẩn gram âm tác động chủ yếu vào trình tổng hợp protein vi khuẩn qua việc gắn vào ribosome nhân sơ Các chủng mẫn cảm gồm Actinomyces bovis, Pasturella spp., E.coli, Salmonella spp., Campylobacter fetus, Leptospira spp., Brucella spp., Mycobacterium tuberculosis Streptomycin sử dụng để trị bệnh vi khuẩn ong mật, bệnh European foulbrood gây Melissococcus pluton, Streptococcus apis Bacillus olvei Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Mục đích sử dụng khác streptomycin kiểm soát Fireblight, bệnh tàn phá vi khuẩn, gây Erwina amylovora, ảnh hưởng đến ăn mùa hoa.[18] 1.1.2 Cơ chế tác động kháng sinh streptomycin lên vi khuẩn Streptomycin thuốc diệt khuẩn, ức chế tổng hợp protein vi khuẩn mức ribosom Streptomycin gắn đặc hiệu vào tiểu phần 30s ribosom vị trí P10 Do vậy, mã bị đọc sai, gây tổng hợp tích lũy protein sai lạc, kìm hãm vi khuẩn phát triển Streptomycin gây rối loạn trình tổng hợp khâu khởi đầu, kéo dài đến kết thúc, P8 P11 gắn vào Streptomycin Ngoài cịn có chế khác như: thay đổi tính thấm màng, hô hấp tế bào, đến DNA vi khuẩn Hình 1.2 Kháng sinh tác động đến tổng hợp protein 1.1.3 Kháng sinh chăn nuôi 1.1.3.1 Tác dụng việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Trong chăn nuôi nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh phổ biến Nó sử dụng với mục đích: điều trị bệnh, phịng bệnh dùng chất kích thích sinh trưởng đem lại lợi ích sau: - Tăng suất sinh trưởng sinh sản gia súc, gia cầm - Tăng hiệu sử dụng thức ăn, làm cho vật ni thích ứng nhanh chóng với thay đổi bất thường cấu chủng loại nguyên liệu phần ăn - Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho thịt trở nên mềm khơng nhiễm mầm bệnh - Phịng bệnh mạn tính ngăn chặn xảy dịch bệnh vi trùng - Tăng hiệu kinh tế chăn nuôi [16] Thuốc kháng sinh sử dụng ngành công nghiệp sữa thập kỷ Chúng dùng chủ yếu để điều trị bệnh lây nhiễm bầu vú (bò, cừu,…, dùng để điều trị bệnh khác (STEAD et al 2008) Sự điều trị cho kháng khuẩn cho động vật tiết sữa dẫn đến tồn dư thuốc sản phẩm sữa Sự tồn dư lượng kháng sinh thành phần sữa mối nguy hại tiềm ẩn người tiêu dùng phản ứng dị ứng, ảnh hưởng xấu cho đường ruột nguy kháng khuẩn cộng đồng (LINGE et al 2007) Những thiệt hại lớn kinh tế xuất sản phẩm lên men kìm hãm hoạt động vi khuẩn (ALTHAU et al 2003) Bởi dư lượng kháng sinh sản phẩm có nguồn gốc động vật đặt mối nguy tiềm ẩn cho người tiêu dùng, theo quy định châu Âu the Commission Regulation No.37/2010 quy định giới hạn (MRL) cho sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc động vật MRL nồng độ tối đa dư lượng chất có hoạt tính dược học cho phép tồn thực phẩm Dư lượng thuốc thực phẩm kiểm soát điều chỉnh theo the Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996, định lượng chất động vật sống sản phẩm từ động vật 1.1.3.2 Tình hình sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi số quốc gia Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn * Trên giới Mỹ, hàng năm có khoảng triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh dùng chăn nuôi Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn, 70% bị sữa 60% thịt bị Mỹ ni dưỡng thức ăn có bổ sung kháng sinh USD chi phí cho kháng sinh dùng thức ăn, người chăn nuôi thu lợi tức – USD Theo số liệu viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh sử dụng chăn nuôi Mỹ năm 1999 khoảng 20,42 triệu pao (9270 tấn), kháng sinh nhóm ionophore arsen chiếm nhiều (47,5%), tetracycline (15,67%), penicillin (4,26%) loại khác (32,57%) Trong số 20,42 triệu pao, có khoảng 2,8 triệu pao (13,7%) dùng chất kích thích sinh trưởng Theo số liệu Ghislain Follet, năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng nhân y chăn nuôi nước châu Âu 10.500 (quy theo mức 100% tinh khiết thành phần hoạt tính), 52% sử dụng nhân y, 33% điều trị thú y 15% chất bổ sung thức ăn chăn nuôi *Tại Việt Nam Theo tổng hợp việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi thú y Việt Nam – TS Nguyễn Quốc Ân – Phó trưởng phịng Quản lý thuốc, Cục thú y, Bộ phát triển nông nghiệp nông thôn.Kết khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi số trang trại chăn nuôi tập trung địa bàn tỉnh Hưng Yên, Hà Tây 30 trang trại chăn nuôi lợn thịt 30 trang trại chăn nuôi gà thịt cho thấy: - 100% trang trại chăn ni có sử dụng kháng sinh, với mục đích chủ yếu để trị bệnh (63,3% với lợn thịt, 50% với gà thịt); với mục đích phịng trị bệnh (13,3% với lợn thịt, 46,7% với gà thịt) - 60,3% mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt, 70,3% mẫu thức ăn chăn ni gà thịt phát có số loại kháng sinh thuộc nhóm tetracycline tylosin có mẫu thức ăn chăn ni lợn thịt có hàm lượng tylosin vượt giới hạn cho phép Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 10 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn vector primer thư viện aptamer, chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp chứa aptamer (Hình 3.3) 100 bp Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc chọn dòng aptamer sau gắn vào vector tách dòng pCR2.1 với cặp mồi M13F/ApR2.; M: Marker 100bp; 1-8: Sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng với cặp mồi M13F/ApR2; Các dòng khuẩn lạc chọn ni cấy mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin tách chiết DNA plasmid để phục vụ cho nghiên cứu 3.3.Xác định lực aptamer với streptomycin Để thu ssDNA (sợi sence), sử dụng kỹ thuật PCR với mồi lệch Mồi ApF2 biotin hóa đầu 5’ có nồng độ gấp 100 lần so với mồi ApR2.Kết sản phẩm PCR có lượng sợi biotin hóa (sợi Sence) cao gấp nhiều lần so với sợi không biotin hóa (antisence).Sau sản phẩm xử lý với lamda exonuclesase để loại bỏ hoàn toàn sợi antisence sản phẩm PCR.Sản phẩm ssDNA sau đo nồng độ máy Nano Drop, đưa nồng độ trước tiến hành phản ứng ELISA Các ssDNA có đầu 5’-Biotin liên kết đặc hiệu với kháng thể cộng hợp StreptavidinPeroxidase Enzyme Peroxidase với xúc tác H2O2 thuỷ phân chất TMB thành sản phẩm có màu, dừng phản ứng H2SO4 1N đo OD bước sóng 450 nm 630 nm Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 39 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Hình 3.4.Biểu đồ thể khả gắn kết aptamer đặc hiệu streptomycin Thơng qua biểu đồ trên, ta nhận thấy, khả liên kết aptamer số cao nhất, với giá trị OD tương ứng 0,356 Aptamer dịng số xác định trình tự xây dựng cấu trúc không gian phần mềm Mfold (đây cơng cụ hỗ trợ tính tốn phân tử sinh học Đại học Washing of Medicine, Mỹ xây dựng đưa vào sử dụng năm 1995) Kết giải trình tự dịng có kích thước 88 bp Strept4: 5,- ATCCGTCACACCTGCTCTCATATGAGGCGGCCAAGAAGGCCTGGTGGAG GATCGGGCGGCAGGGAAGCTTTGGTGTTGGCTCCCGTAT -3’ Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 40 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Hình 3.5 Cấu trúc khơng gian aptamer số dự đốn cơng cụ Mfold Cấu trúc bậc với nhiều stemloop chứa motif tương tự motif GNANNUG aptamer liên kết với streptomycin công bố Uri Laserson et al., 2005 Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 41 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Aptamer sau sàng lọc được, xác định trình tự cấu trúc gắn với chip nano vàng tạo aptasensor Khởi đầu khảo sát mẫu kháng sinh pha buffer Kết thể hình 3.6 Hinh 3.6: Giãn đồ Nyquist thể biến thiên aptasensor thay đổi bề mặt điện cực Au-ap strep 50 200 1000 3000 Hình 3.7 Biểu đồ thể thay đổi tổng trở aptasensor tiếp xúc với mẫu kháng sinh Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 42 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Hình ảnh cho thấy, giản đồ Nyquist điện cực vàng trần gần đường thẳng Sau aptamer phủ bề mặt điện cực vàng, trở kháng tăng lên đáng kể (2902 Ω) Sau ủ aptasensor với nồng độ kháng sinh streptomycin khác nhau, Hình ảnh cho thấy xu hướng biến động aptasensor tương ứng với nồng độ streptomycin có đệm Như thể đồ thị, trở kháng lại giảm tăng nồng độ streptomycin từ 50-3000 ng/mL Điều định hướng aptamer bề mặt điện cực thay đổi tử ngang sang thẳng đứng, hình thành liên kết streptomycin với aptamer Các định hướng thẳng đứng liên kết aptamer- streptomycin làm tăng tính dẫn [Fe(CN)6]3-/4 với điện cực vàng đótrở kháng (Ret) giảm y = -0,582x + 2492, R² = 0,948 Hình 3.8 Hình ảnh xây dựng đường chuẩn dựa giá trị trở kháng thu Giá trị trở kháng Ret so với nồng độ kháng sinh streptomycin tuyến tính khoảng 50-3000 ng/ml Với phương trình tuyến Ret (Ω) = -0.582[C] + 2492, R2= 0,948 3.4 Xác định giới hạn phát LOD Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 43 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Tiến hành đo mẫu trắng, lặp lại 10 lần, xác định LOD công thức : LOD =3 X SD (trong SD độ lệch chuẩn) Tính giới hạn phát hiện; LOD = 45 ng/ml 3.5.Đánh giá tính đặc hiệu aptasensor streptomycin Để đánh giá tính đặc hiệu aptasensor với kháng sinh streptomycin, tiến hành bổ sung kháng sinh neomycin, penicillin, tetracycline vào đệm, đồng thời hỗn hợp khác, kháng sinh bổ sung streptomycin Nồng độ kháng sinh hỗn hợp bổ sung sau: Bảng 3.1 Nồng độ kháng sinh hỗn hợp Tên Nồng độ kháng sinh hỗn hợp ( ng/ml) Tetracycline 10 Penicillin 0,4 Streptomycin 200 Neomycin 150 Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 44 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Thực đo EIS Kết thể hình: Hình 3.9: Giản đồ Nyquist kiểm tra tính đặc hiệu aptasensor Streptomycin Kết kiểm tra nhận thấy, đệm có chứa kháng sinh neomycin, peniciline, tetracycline tín hiệu điện hóa khơng thay đổi sơ với tín hiệu điện hóa aptasensor (điện cực Au-ap streptomycin) Tuy nhiên, streptomycin thêm vào với nồng độ 200ng/ml, tín hiệu thay đổi, trở kháng giảm đáng kể Như vậy, aptasensor chế tạo, sử dụng để phát kháng sinh streptomycin với độ đặc hiệu cao 3.6.Phát streptomycin mẫu sữa Mẫu sữa sau thu nhận, bổ sung kháng sinh với nồng độ 150 ng/ml, 700 ng/ml, 2000 ng/ml Tiếp theo, xử lý sữa theo quy trình trình bày mục phương pháp Xác định streptomycin mẫu sữa aptasesor, đồng thời xác định phần trăm kháng sinh bị sau xử lý mẫu sữa Kết thể bảng sau: Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 45 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Bảng 3.2: Phát Streptomycin mẫu sữa phần trăm kháng sinh thu hồi sau xử lý mẫu Nồng độ streptomycin Nồng độ streptomycin Phần trăm kháng sinh thu bổ sung (ng/ml) phát apt hồi (%) sensor (ng/ml) 150 124 82,67 700 641 91,57 2000 1876 93,80 Như vậy, sau xử lí mẫu sữa, khả thu hồi lại kháng sinh 82,67 -93,8% Hình 3.10: Giản đồ nyquist xác định số mẫu kháng sinh aptasensor Streptomycin KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ *** Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 46 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn  KẾT LUẬN - Sàng lọc aptamer có khả gắn kết với streptomycin có kích thước 59 bp có khả gắn kết với streptomycin thực phản ứng ELISA Cấu trúc không gian aptamer xác định phần mềm Mfold - Đã xây dựng quy trình chế tạo aptasensor điện hóa sở sử dụng aptamer đặc hiệu streptomycin có độ đặc hiệu cao - Ngưỡng xác định biosensor kháng sinh streptomycin 45 ng/ml  KIẾN NGHỊ - Thực đánh giá giá trị sử dụng aptasensor - Hoàn thiện sản phẩm thương mại thuận lợi cho thực tiễn sử dụng TÀI LIỆU THAM KHẢO *** Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 47 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn Tài liệu tiếng Việt http://sukien.vast.vn/40nam/index.php/tap-the-ca-nhan/1707-phong-cong-nghe-te-baodong-vat-vien-cong-nghe-sinh-hoc http://www.dieutri.vn/s/14-6-2011/S804/Streptomycin.htm TS Lã Thị Huyền: Nghiên cứu chế tạo sử dụng KIT phát kháng sinh sữa kỹ thuật nano 2015 QCVN 5-1:2010/BYT : Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm sữa dạng lỏng National technical regulation for fluid milk products QCVN 5-2:2010/BYT : Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm sữa dạng bột National technical regulation for powder milk products QCVN 5-3:2010/BYT : Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm phomat National technical regulation for cheese products QCVN 5-4:2010/BYT : Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm chất béo từ sữa National technical regulation for dairy fat products QCVN 5-5:2010/BYT : Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm sữa lên men National technical regulation for fermented milk products Phạm Kim Đăng, Nguyễn Tú Nam, Bùi Thị Tho, Phạm Hồng Ngân (2012) Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni gà Hải Phịng Tạp chí khoa học Kỹ thuật thú y, Hội thú y Việt Nam 19(5): 92-98 10 Phạm Kim Đăng, Vũ Thị Ngân, Phạm Hồng Ngân Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh chloramphenicol (CAP), florphenicol (FF), thiamphenicol (TAP) số sản phẩm động vật phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Tạp chí khoa học phát triển 2014, tập 12, số 2: 165-176 11 PGS.TS.Lã Văn Kính cộng Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu sản xuất thịt lợn an toàn chất lượng cao Tháng 03/2007 12 GS.TS.Chu Phạm Ngọc Sơn cộng Xu hướng công nghệ phát dư lượng kháng sinh thủy sản – Phương pháp phát nhanh Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 48 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn 13 TS.Nguyễn Quốc Ân – Phòng Quản lý thuốc, cục thú y Sử dụng kháng sinh chăn nuôi thú y Việt Nam 14 Nguyễn Thanh Thủy Luận văn thạc sỹ khoa học: Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 Năm 2013 15 Nguyễn Như Hoa Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu sàng lọc thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh penicillin 16 http://chrisal.vn/index.php/ung-dung/probiotic-lam-sach-trong-chan-nuoi/81-su-dungkhang-sinh-trong-thuc-an-chan-nuoi-va-van-de-ve-sinh-an-toan-thuc-pham.html Tài liệu tiếng Anh 17 Aarestrup, F.M (1999) Association between the consumption of antimicrobial agents in animal husbandry and the occurrence of resistant bacteria among food animals.International Journal of Antimicrobial Agents, số 12, tr 279-285 18 Suzy Kedzierski, Makan Khoshnejad, and G.Thomas Caltagirone Synthetic antibodies: the emerging field of aptamers Winter 2012/2013 BioProcessing Journal 19 Julie Ferguson, Andrew Baxter, XenoSense Ltd, Belfast, Northern Ireland The measurement of streptomycin concentration in food products Biacore Jounal – Number 2001 20 Jian-xiang Wu, Shao-en Zhang, Xue-ping Zhou Monoclone antibody-based ELISA and colloidal gold-based immunochromatographic assay for streptomycin residue detection in milk and swine urine 5/2013 21 Kyung-Mi Song, Seonghwan Lee and Changill Ban Aptamers and their biological applications Sensors 2012, 12, 612-631 ISSN 1424-8220 22 Camille L.A Hamula, Jeffrey W.Guthrie, Hongquan Zhang, Xing-Fang Li, X.Chris Le Selection and analytical application of aptamers Trends in Analytical Chemistry, Vol.25, No.7, 2006 23 Sumedha D.Jayasena Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics Clinical Chemistry 45:9, 1628-1650 (1999) Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 49 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn 24 Nadia Nikolaus and Beate Strehlitz DNA-Aptamers binding aminoglycoside antibiotics Sensors 2014, 14, 3737-3755 25 Regina Stoltenburg, Nadia Nikolaus, and Beate Strehlitz Capture-SELEX: Selection of DNA aptamer for aminoglycoside antibiotics Journal of analytical methods in chemistry Volume 2012, aricle ID 415679 26 Mohammad Hosein Movassagh Study of antibiotics residues in cow raw milk by Copan milk test in Parsabad region, Ardabil province, Iran 27 A.V.Kulbachinskiy Methods for selection of aptamers to protein targets ISSN 00062979, Biochemistry (Moscow), 2007, Vol.72, No.13, pp.1505-1518 28 Tara A.McGlinchey, Paul A.Rafter, Fiona Regan, Gillian P.McMahon A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matrices Analytica chimica ACTA 624 (2008) 1-15 29 M Bachler, R Schroeder and U von Ahsen StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins RNA 1999 5: 1509-1516 30 Valentina Tereshko, Eugene Skripkin, and Dinshaw J.Patel Encapsulating Streptomycin within a small 40-mer RNA Chemistry & Biology, Vol.10, 175-187, February, 2003 31 Bogaard, A.E.V.D., Stobberingh, E.E (2000) Epidemiology of resistance to antibiotics links between animals and humans International Journal of Antimicrobial Agents, số 14, tr 327-335 32 Pena, A., Serrano, C., Reu, C., Baeta, L., Calderon, V., Silveira, I., Sousa, J C., (2004) Antibiotic residues in edible tissues and antibiotic resistance of faecal Escherichia coli in pigs from Portugal Food Additives and Contaminats, số 21, tr 749 – 755 33 Communauté Européenne (1990) Règlement (CEE) n02377/90 du Conseil du 26 juin 1990 établissant une procédure communautaire pour la fixation des limites maximales de résidus de médicaments vétérinaires dans les aliments d’origine animale J Off Comm Eur., L 224, trl Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 50 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn 34 Communauté Européenne (2002) Décision N02002/657/CE du 12 aout 2002 portant modalités d’application de la directive 96/23/CE du Conseil en ce qui concerne les performances des méthodes d’analyse et l’interprétation des resultats (Texte présentant de l’intérêt pour l’EEE) [notifiée sous le numéro C(2002) 3044] J Off Comm Eur., L 221, tr 8-36 35 European Union (EU) (1996) Directive 96/23/CE du Conseil, du 29 avril 1996, relative aux mesures de contrôle mettre en oeuvre l’égard de certaines substances et de leurs résidus dans les animaux vivants et leurs produits etabrogeant les directives 85/358/CEE et 86/469/CEE et les décisions 89/187/CEE et 96/664/CEE Off J Eur Communities., L 125, tr 10-32 36 M.H.Movassagh, Annals of Biological Research, 2011, (2) : 95 – 98 37 Ceyhan, M.Bozkurt, Turk Hij Den Biyol Derg, B1987, 44, – 38 S.Ergin kaya, A.Filazi, Kafkas Univ Vet Fak Derg, 2010,16, S31-S3 39 N.Aydmn, M.Cambazoglu, H.Ayhan, Etlik Vet Mikrobiyol Derg, 1989, 6, 11-22 40 A.A.Adesiyun, L.A.Webb, Journal of Food safety, 1977, 16, 301 – 310 41 Shitandi, Journal of Food Safety, 2001, 21, 205 – 214 42 http://www.cfsan.fda.gov/ear/mi02-1.html Milk Safety Branch, HFF-346, Center for Food Safety and Applied Nutrition,06 March 1992 Site visited 22 September 2005 43 M.Khaskheli, R.S.Malik, M.A.Arain, A.H.Soomro, H.H.Arain, Pakistan Journal of Nutrition, 2008, 7(5): 682 – 685 44 Heeschen, W.H (1993) The EEC approach In: International Dairy Federation (IDF) Workshop on residues of antibiotics and other antibiotics and other antimicrobial inhibitors in raw and heat-treated milk: Significance, detection and development of an integrated detection system, Copenhagen, Denmark: IDF 45 Suhren, G., Heeschen, W (1996) Detection of inhibitors in milk by microbial tests A review Food/ Nahrung, số 40, tr 1-7 Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 51 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn 46 Sýkorová Goffová Z., Kozárová I., Máté D., Marcincák S., Gondová D (2012): Comparison of detection sensitivity of five microbial inhibition tests for the screening of aminoglycoside residues in fortified milk Czech J.Food Sci., 30: 314-320) 47 Althaus R.L., Torres A., Montero A., Balash S., Molina M.P (2003): detection limits of antimicrobials in ewe milk by Delvotest-photometric measurements Journal of Diary Science, 86: 457-463 48 Stead S.L., Ashwin H., Richmond S.F., Sharman M., Langeveld P.C., Barendse J.P., Stark J., Keely B.J (2008): Evaluation and validation according to international standard of the Delvotest SP-NT screening assay for antimicrobial drugs in milk International Dairy Journal, 18: 3-11 49 Linge B., Gonzalo C., Carriedo J.A., Asensio J.A., Blanco M.A., De la fuente L.F., San Primitivo F (2007): performance of blue-yellow screening test for antimicrobial detection in ovine milk American Dairy Science Association, 90: 5374-5379 50 https://en.wikipedia.org/wiki/Aptamer 51 http://aptamerstbc2013.wix.com/aptamers#!how-do-aptamers-work/c1phj 52 http://www.aptagen.com/home.aspx 53 http://www.aptamergroup.co.uk/Aptamer-Group/Aptamers/Aptamers-vs-Antibodies 54 https://en.wikipedia.org/wiki/Streptomycin 55 Kusser W (2005) Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution J Biotechnol 74, 27–38 56 Kuwahara M, Hanawa K, Ohsawa K, Kitagata R, Ozaki H & Sawai H (2006) Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: convenient preparation of DNA libraries with high–potential activities for in vitro selection Bioorg Med Chem 14, 2518–2526 57 Kyung-Mi Song, Seonghwan Lee, and Changill Ban (2012), “Aptamer and their biological applications”, Sensors (Basel) 2012; 12(1): 612–631 Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 52 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS Lê Quang Huấn 58 Liu M., T.Kagahara, H.Abe(2009),“Direct In Vitro Selection of Hemin-Binding DNA Aptamer with Peroxidase Activity”, Bulletin of the Chemical Society of Japan: 99–104 59 Long S., M Long, R White, B Sullenger (2008), “Crystal structure of an RNA Aptamer bound to thrombin” RNA 14 (2): 2504–2512 60 Marco M.P., Adrian J., Ramon J., et al., (2008) New techniques in residue analysis Proceedings of the EuroResidue VI: conference on residues of veterinary drugs in food Van Ginkel, L.A., Bergwerff, A.A (Eds.), Egmond aan Zee, the Netherlands: 181-185 61 McGlinchey TA., Rafter PA., Regan F., McMahon GP, 2008 A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matries.J Analytica chemica acta 624:pp.1-15 62 Uri Laserson et al, 2005 Predicting candidate genomic sequences that correspond to synthetic fuctional RNA motifs Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 53 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... tượng sinh học thành tín hiệu điện để đo thiết bị điện Trong khuôn khổ luận văn, tiến hành đề tài: ? ?nghiên cứu sàng lọc thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin ứng dụng để xác định dư... quy trình sàng lọc aptamer (có chất DNA) có khả nhận biết gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Tách dòng chọn dòng aptamer gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Xác định trình... ssDNA sau sử dụng để tiến hành trình sàng lọc SELEX 2.3.4 Phƣơng pháp sàng lọc aptamer đặc hiệu streptomycin Quá trình sàng lọc aptamer đặc hiệu streptomycin thực cột có chứa hạt agarose-streptomycin