Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và ứng dụng phẩm màu cây lá Cẩm

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ THỊ HỒNG CẨM NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ỨNG DỤNG PHẨM MÀU TỪ CÂY LÁ CẨM Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số : 831 06 30 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC ĐÀ NẴNG, NĂM 2018 Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC SƯ PHẠM – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG Phản biện 1: PGS.TS LÊ THỊ LIÊN THANH Phản biện 2: TS NGUYỄN MINH HIỀN Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Hóa học Đại học Sư phạm Đà Nẵng vào ngày 31 tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại Học Đà Nẵng MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, với phát triển kinh tế - xã hội, tính thẩm mỹ người tăng đặc biệt lĩnh vực công nghệ thực phẩm Tuy nhiên, người lạm dụng chất màu tổng hợp chế biến thực phẩm dẫn đến nguy ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, việc tìm kiếm chiết tách chất màu tự nhiên từ thực vật hay động vật sử dụng công nghiệp thực phẩm để thay cho chất màu tổng hợp xu hướng giới Ở Việt Nam, Cây Cẩm - Peristrophe roxburghiana (Schult) Bremek (P tincloria (Roxb) Ness), thuộc họ Ơ rơ Acanthaceae Cây trồng cho màu tím tía dùng nhuộm bánh, xơi làm mỹ phẩm Cây Cẩm thu hái quanh năm, rửa sạch, dùng tươi hay phơi khô để dùng Mặt khác, Cẩm loại dược liệu sử dụng để chữa nhiều loại bệnh dân gian Cây có vị nhạt, tính mát có tác dụng phế nhiệt khái (giảm ho) huyết ( cầm máu) Nếu phối hợp với vị thuốc khác trị chứng viêm phế quản nhiều đờm, tiêu lỏng, xuất huyết, chấn thương gân bị bầm dập Thành phần hoá học Cây Lá Cẩm mà cho màu anthocyanin (theo tiếng Hy Lạp: Anthos = hoa; Cyanos = màu xanh) Anthocyanin tinh khiết dạng tinh thể vơ định Hình hợp chất phân cực nên tan tốt dung môi phân cực Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH, chất màu có mặt nhiều yếu tố khác, nhiên màu sắc anthocyanin thay đổi mạnh phụ thuộc vào pH mơi trường Ngồi tác dụng chất màu thiên nhiên sử dụng an toàn thực phẩm, tạo nhiều màu sắc hấp dẫn cho sản phẩm, anthocyanin hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học q như: khả chống oxy hóa cao nên sử dụng để chống lão hóa, chống oxy hóa sản phẩm thực phẩm, hạn chế suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế phát triển tế bào ung thư; tác dụng chống tia phóng xạ Những đặc tính q báu anthocyanin mà chất màu hóa học, chất màu khác Hình thành q trình gia cơng kỹ thuật khơng có mở hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào đời sống hàng ngày, đặc biệt cơng nghệ chế biến thực phẩm Điều hồn tồn phù hợp với xu hướng nước giới nghiên cứu khai thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng thực phẩm, chúng có tính an tồn cao cho người sử dụng Mặc dầu cẩm có nhiều cơng dụng, đặc biệt khả tạo màu sắc cho loại thực phẩm an toàn Việt Nam gần chưa có cơng trình nghiên cứu loại Đây vấn đề nghiên cứu cần quan tâm nhằm góp phần quy hoạch, khai thác, chế biến ứng dụng sản phẩm cẩm cách có hiệu quả, khoa học Với lý trên, chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học ứng dụng phẩm màu Cẩm” Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình chiết tách thu nhận phẩm màu Cẩm; - Định danh thành phần cấu tử phẩm màu Cẩm; - Xây dựng quy trình ứng dụng phẩm màu Cẩm vào sản xuất số sản phẩm thực phẩm Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cây Cẩm thu mua chợ Thiết , Quận 11 thành phố Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu Để thực đề tài sử dụng phương pháp sau: - Lấy mẫu, xử lý, sơ chế mẫu; - Xác định số tiêu hóa lý; - Chiết tách thu phẩm màu dịch chiết; - Phương pháp sắc ký khí (GC-MS) để định danh thành phần hóa học; - Phương pháp UV-Vis , HPLC để định danh, xác định chất màu; - Phương pháp AAS để xác định kim loại nặng - Phương pháp sản xuất thực phẩm Bố cục đề tài Ngoài phần mở đầu, danh mục Bảng, Hình, đồ thị, sơ đồ, kết luận kiến nghị, tài liệu tham khảo Trong luận văn chia làm chương sau: Chương 1: Tổng quan (26 trang) Chương 2: Phương pháp đối tượng nghiên cứu (15 trang) Chương 3: Kết bàn luận (37 trang) Ý nghĩa đề tài - Cung cấp thơng tin khoa học quy trình chiết tách thành phần chất Cẩm - Cung cấp số liệu thực nghiệm cho nghiên cứu sâu Cẩm đề tài - Cung cấp thông tin khoa học thành phần hóa học số hợp chất Cẩm - Cung cấp tư liệu ứng dụng sản phẩm màu chiết từ Cẩm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY LÁ CẨM 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHẤT MÀU THỰC PHẨM 1.2.1 Tầm quan trọng việc sử dụng chất màu chế biến thực phẩm 1.2.2 Vai trò chất màu thực phẩm 1.2.3 Phân loại chất màu thực phẩm 1.2.4 Nguyên tắc sử dụng chất màu thực phẩm 1.3 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT MÀU ANTHOCYANIN 1.3.1 Cấu trúc anthocyanin 1.3.2 Sự phân bố anthocyanin tự nhiên 1.3.3 Đặc tính quang phổ anthocyanin 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền màu anthocyanin 1.3.5 Hoạt tính sinh học anthocyanin 1.3.6 Ứng dụng anthocyanin chế biến thực phẩm 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 1.4.1 Các khái niệm trình chiết 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết 1.4.3 Các phương pháp chiết 1.5 LÝ THUYẾT CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SO MÀU CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp trọng lượng 2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 2.2.3 Phương pháp so màu 2.3 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.3.1 Sơ đồ thực nghiệm a Chiết dung mơi hữa Q trình thực nghiệm mơ tả theo sơ đồ thể Hình 2.1 Cây Cẩm Xử lý Xác định hàm lượng tro Xác định hàm kim loại nặng Dịch chiết Bột Cẩm (Nguyên liệu) Xác định độ ẩm Chiết soxhlet n- hexan Chiết với cồn thực phẩm để thu phẩm màu Cẩm clorofom Đo GC-MS, HPLC, LC-MS Dịch chiết etyl axetat Dịch chiết etanol Dịch chiết etanol Hình Quy trình thực nghiệm Đánh giá độ an tồn ứng dụng phẩm màu Cẩm tạo số sản phẩm thực phẩm 2.3.2 Xử lý nguyên liệu 2.3.3 Xác định thơng số hóa lí ngun liệu a Xác định độ ẩm b Xác định hàm lượng tro c Xác định hàm lượng số kim loại nặng d Đo tỉ trọng dịch chiết etanol 2.3.4 Xác định tiêu vi sinh 2.3.5 Chiết tách xác định thành phần hóa học dịch chiết từ Cẩm Cho m (g) nguyên liệu bột Cẩm vào V (ml) C2H5OH vào bình cầu đáy tròn, lắp sinh hàn hồi lưu đun nóng nhiệt độ toc với thời gian t (phút) Để nguội hỗn hợp dịch chiết đến nhiệt độ phòng thu dịch chiết vải lọc, sau lọc dịch chiết qua giấy lọc thu dịch chiết Để xác định hàm lượng chất màu lấy mẫu dịch chiết đo UV- VIS bước sóng 664nm 2.3.6 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết chưng ninh etanol a Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ rắn lỏng b Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ c Khảo sát thời gian chiết CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ 3.1.1 Độ ẩm mẫu nguyên liệu: Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm mẫu nguyên liệu Cẩm xác định tổng hợp Bảng 3.1 Bảng Kết xác định độ ẩm mẫu nguyên liệu Cẩm STT G (g) G1 (g) G2 (g) %H2O 3,1504 32,8506 32,5243 10,3574 3,3732 34,7674 34,4193 10,3196 3,6086 31,4023 31,0325 10,2477 Độ ẩm trung bình (%) 10,3082 Kết Bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình bột mẫu nguyên liệu Cẩm 10,3082 % Với độ ẩm nằm khoảng tiêu chuẩn bảo quản mẫu nguyên liệu dược liệu 10 – 14% Do nguyên liệu bảo quản thời gian dài nguyên liệu sử dụng chiết tách có tính ổn định 3.1.2 Xác định hàm lượng tro Bằng phương pháp định lượng, hàm lượng tro nguyên liệu xác định trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết xác định hàm lượng tro mẫu nguyên liệu Cẩm STT mo (g) m1 (g) m2 (g) %Htro 5.018 35,502 35,990 9,725 5.027 36,280 36,763 9,608 5.021 34,760 35,252 9,799 Hàm lượng tro trung bình (%) 9,711 Kết Bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro bột mẫu nguyên liệu Cẩm 9,711 % hàm lượng trung bình mẫu thực vật (15- 20 %) Với hàm lượng dự báo hàm lượng kim loại nặng có Cẩm không lớn 3.1.3 Xác định hàm lượng kim loại nặng Hàm lượng số kim loại nặng Cẩm xác định phương pháp AAS Kết thể Bảng 3.3 Bảng 3.3 Hàm lượng kim loại Cẩm STT Kim loại Phương pháp thử (AAS) Kết (μg/l) Kết (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) Pb TCVN 8126:2009 0,502 0,05 ≤ 2,00 As AOAC 986.15 KPH KPH ≤ 1,00 (LOD=0,021) TCVN 0,422 0,04 ≤ 2,00 8126:2009 KPH TCVN Hg KPH ≤ 0,05 7993:2009 (LOD=0,013) Bảng 3.3 thấy thành phần kim loại nặng Pb, As, Cr, Hg có Cẩm tương đối thấp Đây số quan Cr trọng để đánh giá việc sử dụng cẩm làm dược liệu an tồn Vì ta nhận thấy sử dụng Cẩm hàm lượng kim loại nặng không ảnh hưởng đến sức khoẻ người 3.1.4 Xác định tỉ trọng dịch chiết etanol Bảng 3.4 Tỉ trọng dịch chiết theo thời gian Thời gian m1 (gam) m2 (gam) Tỉ trọng(g/mL) 70 phút 24,60 24,67 0,007 90 phút 24,60 24,67 0,007 110 phút 24,60 24,68 0,008 130 phút 24,60 24,68 0,008 Qua bảng 3.4 cho thấy với thời gian 110 phút tỉ trọng không thay đổi, chất chiết xem hoàn toàn Sau thời gian chiết 110 phút tỉ trọng 0,008 Tương đương có có 0,008 gam cao chiết mL dịch chiết 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ 3.2.1 Kết nghiên cứu thu dịch chiết dung môi n-hexan a Dịch chiết n-hexan Cẩm Điều kiện tiến hành: Bột Cẩm 10 g, thể tích dung mơi 200 ml n-hexan; thời gian chiết: 2, 4, 6, Tiến hành chiết soxhlet bếp cách thủy nhiệt độ từ khoảng 68oC - 78oC Sau đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết Khối lượng cao chiết trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu Thời gian chiết (giờ) Khối lượng cao chiết (g) 0,20 0,24 0,29 0,29 Bảng 3.5 ta thấy, thời gian chiết từ đến khối lượng cao chiết thu có tăng theo thời gian từ đến khối lượng cao có tăng khơng đáng kể Điều giải thích tăng thời gian chiết chất Cẩm khơng hòa tan thêm Vậy thời gian chiết tốt b Định danh thành phần hóa học dịch n-hexan Cẩm GC-MS Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết nhexan trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết nhexan Cẩm STT Thời gian lưu 6.047 6.45 7.569 13.28 14.442 15.891 16.181 Diện tích peak (%) 6.094 5.303 0.972 6.231 1.083 15.002 0.842 Tên gọi Benzen, 1,2,3,5-tetramethylNaphthalene Naphthalene, 2-methyl2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyln-Hexadecanoic acid Phytol Z-(13,14-Epoxy)tetradec-11-en-1-ol acetate 16.801 0.863 E-8-Methyl-9-tetradecen-1-ol aceate 18.008 1.412 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4olide 10 18.405 1.043 Tetracosane 11 19.209 1.681 Heneicosane 12 19.48 36.87 Di-n-octyl phthalate 13 19.984 1.773 Pentacosane 14 20.73 1.659 Octacosane 15 21.447 0.947 Squalene 16 21.564 7.338 Heptacosane 17 22.184 0.763 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether 18 25.633 2.740 Campesterol 19 25.953 3.610 Stigmasterol 20 26.815 3.776 y-Sitosterol Từ kết Bảng 3.6 cho ta thấy phương pháp GC – MS định danh 20 cấu tử Các cấu tử có hàm lượng cao như: Di-noctyl phthalate chiếm 36,9%, thích hợp để làm mỹ phẩm, đồ chơi trẻ em khơng độc hại Phytol chiếm 15 %, chất tiền chất sản xuất loại vitamin E K1, thích hợp để làm mỹ phẩm, 10 STT Thời gian lưu 13.28 14.776 15.891 17.572 Diện tích peak (%) 3.066 0.685 2.699 2.049 18.012 0.631 10 11 12 13 14 15 16 18.41 19.214 19.49 19.984 20.73 21.452 21.563 4.450 7.163 48.90 8.205 6.978 4.44 2.728 22.188 2.552 17 18 19 25.633 25.957 26.815 0.763 1.178 1.33 Tên gọi 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethylHexadecanoic acid, ethyl ester Phytol 7-Methyl-Z-tetradecen-1-ol acetate 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4olide Teracosane Heneicosane Di-n-octyl phthalate Pentacosane Octacosane Heptacosane Squalene 1-Monolinoleoylglyxerol trimethylsilyl ether Campesterol Stigmasterol γ-Sitosterol Bảng 3.8 cho ta thấy phương pháp GC – MS định danh 19 cấu tử dịch chiết clorofom từ Cẩm Thành phần hóa học dịch chiết clorofom chủ yếu cấu tử có độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm hidrocacbon dài 21C 27C Các cấu tử có hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate (48.9 %), Pentacosane (8,20 %), Heneicosane ( 7.163 %) 3.2.3 Kết nghiên cứu thu dịch chiết dung môi etylaxetat a Dịch chiết etylaxetat Cẩm Điều kiện chiết tách: 10 gam bột Cẩm, thể tích dung mơi etylaxetat 200ml; thời gian chiết: 2, 4, 6, Tiến hành chiết soxhlet bếp cách thủy nhiệt độ từ khoảng 78 - 88oC Sau 11 đó, tiến hành cô dung môi để thu cao chiết đem cao chiết thu cân Khối lượng cao chiết trình bày Bảng 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu Thời gian chiết (giờ) Khối lượng cao chiết (g) 0,17 0,20 0,22 0,22 Bảng 3.9 ta thấy, thời gian chiết từ đến khối lượng chất thu tăng theo thời gian, sau khối lượng cao chiết đạt lớn Điều giải thích tăng thời gian chiết chất Cẩm khơng hòa tan thêm Vậy tơi chọn thời gian chiết tốt dung môi etylaxetat b Định danh thành phần hóa học dịch chiết etylaxetat Cẩm GC - MS Dịch chiết etylaxetat Cẩm xác định thành phần hóa học phương pháp GC-MS Trên sắc kí đồ nhận có tín hiệu peak ứng với cấu tử tách So sánh thời gian lưu với thư viện phổ xác định tên chất đo diện tích peak ta xác định hàm lượng chất hỗn hợp nhận diện Kết định danh thành phần hóa học thể Bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết etylaxetat Cẩm STT Thời gian lưu 5.413 5.737 Diện tích peak (%) 1.132 0.985 6.726 0.665 8.469 9.375 12.645 0.66 2.614 0.606 Tên gọi 1,2,3-Propanetriol, 1-acetate 2,5-Dihydroxy-1,4-dioxane, bis(tertbutyldimethylsilyl) ether Hexadecanoic acid, 3-hydroxy-, methyl ester Tetradecane 2,5-Dimethoxythiophenol Acetic acid, 2-(2,2,6-trimethyl-7-oxa- 12 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 12.761 0.734 13.28 14.442 15.891 16.806 18.008 5.912 1.211 12.82 1.753 1.442 18.405 19.209 19.48 19.984 20.73 21.447 21.563 22.184 1.098 1.964 49.23 2.073 1.979 1.132 4.214 0.793 25.633 25.957 26.81 1.753 2.609 2.624 bicyclo[4.1.0]hept-1-yl)-propenyl ester 2-Cyclohexen-1-one, 4-hydroxy-3,5,5trimethyl-4-(3-oxo-1-butenyl)2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyln-Hexadecanoic acid Phytol Phytol,acetate 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4olide Tetracosane Heneicosane Di-n-octyl phthalate Pentacosane Octacosane Squalene Heptacosane 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether Campesterol Stigmasterol γ-Sitosterol Từ kết Bảng 3.10 cho ta thấy phương pháp GC – MS định danh 23 cấu tử dịch chiết etylaxetat từ Cẩm Thành phần hóa học dịch chiết n- n-hexane chủ yếu cấu tử có độ phân cực yếu đến khơng phân cực Các cấu tử có hàm lượng cao như: Di-n-octyl phthalate (49.23%), 2Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl-(5,91%), Heptacosane (4,2%) γSitosterol (2.624%) c Định danh chất màu dịch chiết etylaxetat từ Cẩm HPLC LC-MS Dịch chiết chiết etylaxetat từ Cẩm đo HPLC đầu dò DAD bước sóng 522 nm Kết Hình 3.4 cho thấy có peak ứng với thời gian lưu 18,024 chiếm 98,173% 13 Hình 3.1 Sắc kí đồ chiết etylaxetat Cẩm Tiến hành khảo sát hệ thống LC-MS với chế độ scan giá trị m/z từ 200 đến 1200 Tín hiệu phút 18 hệ HPLC cho tín hiệu phút 19,169 hệ LC-MS, phổ khối lượng trình bày Hình 3.5 Hình Phổ khối lượng dịch chiết etylaxetat từ Cẩm, phút thứ 19 hệ LC-MS Hình 3.5 cho thấy có giá trị m/z = 595,4 ứng với hợp chất cyaniding - 3-rutinoside 534,4 ứng với hợp chất cyaniding - 3malonyglucoside 3.2.4 Kết nghiên cứu thu dịch chiết dung môi etanol a Dịch chiết etanol Cẩm Điều kiện tiến hành: gam bột Cẩm, thể tích dung mơi 150 ml etanol; thời gian chiết: 70, 90, 110, 130 phút Tiến hành chiết soxhlet bếp cách thủy nhiệt độ từ khoảng 80oC90oC Sau đó, tiến hành dung mơi để thu cao chiết đem cao 14 chiết thu cân Kết khối lượng cao thu thu 0,20 gam Khối lượng cao chiết trình bày Bảng 3.11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khối lượng cao chiết thu Thời gian chiết (phút) 70 90 110 130 Khối lượng cao chiết (g) 0,15 0,17 0,20 0,20 Bảng 3.11 ta thấy, thời gian chiết từ 70 phút đến 130 phút khối lượng chất thu tăng theo thời gian, sau 110 phút khối lượng cao chiết đạt lớn Điều giải thích tăng thời gian chiết chất Cẩm khơng hòa tan thêm Vậy chọn thời gian chiết tốt dung môi etanol 110 phút b Định danh thành phần hóa học dịch chiết etanol từ Cẩm GC - MS Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết etanol từ Cẩm thể Hình 3.6 kết định danh thành phần hóa học dịch chiết etanol tổng hợp Bảng 3.12 Bảng 3.12 Kết định danh thành phần hóa học dịch chiết etanol Cẩm STT Thời gian lưu Diện tích peak (%) 8.449 0.55 9.365 9.646 7.257 1.522 10.038 0.78 10.101 0.802 10.305 1.355 10.595 10.673 0.84 0.907 11.215 1.245 Tên gọi Dithiocarbamate,S-methyl-,N-(2methyl-3-oxobutyl)2,5-Dimethoxythiophenol Phen, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzyl alcohol 2(4H)-Benzofuranone,5,6,7,7Atetrahydro-4,4,7a-trimethyl-, (R)2-Tertbutyl cyclohexyl propylphosphonofluoridate 2-Hexadecanol Geranyl isovalerate 2-Cyclohexen-1-one, 4-(3-hydroxy-1butenyl)-3,5,5-trimethyl- 15 10 11.675 1.637 11 12.63 1.715 12 12.751 5.262 13 14 15 16 17 12.828 13.26 14.756 15.875 16.684 0.867 3.78 2.877 25.00 0.975 18 16.786 1.417 19 17.552 1.315 20 17.988 1.235 21 22 23 24 25 18.259 18.385 19.184 19.446 19.756 2.372 1.13 0.965 16.1 1.052 26 19.954 0.862 27 28 29 20.701 21.418 21.534 0.767 0.442 2.91 30 22.149 0.36 31 32 33 25.574 25.894 26.751 2.55 4.772 4.507 1-{2-[3-(2-Acetyloxiran-2-yl)-1,1dimethylpropyl]cycloprop-2enyl}ethanone Ppropiolic acid, 3-(1-hydroxy-2isopropyl-5-methlcyclohexyl)2-Cyclohexen-1-one, 4-hydroxy3,5,5-trimethyl-4-(3-oxo-1-butenyl)Tetradecane,2,6,10-trimethyl2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethylHexadecanoic acid, ethyl ester Phytol 1-Heptatriacotanol E,E,Z-1,3,12-Nonadecatriene-5,14diol 17-Pentatriacontene 4,8,12,16-Tetramethylheptadecan-4olide Ethanol, 2-(9_octadecenyloxy)-, (Z)Tetrapentacontane, 1,54-dibromoHeneicosane Di-n-octyl phthalate E-8-Methyl-9-tetradecen-1-ol acetate Phen-1,4-diol, 2,3-dimethyl-5trifluoromethylOctacosane Heptacosane Squalene 1-Monolinoleoylglycerol trimethylsilyl ether Campesterol Stigmasterol γ –Sitosterol Bảng 3.12 cho ta thấy phương pháp GC – MS định danh 33 cấu tử dịch chiết etanol từ Cẩm Thành phần 16 hóa học dịch chiết etanol chủ yếu cấu tử có độ phân cực yếu đến khơng phân cực Các chất có hàm lượng cao như: Phytol (25 %), 2,5-Dimethoxythiophenol (7,257 %) c Định danh chất màu dịch chiết etanol Cẩm HPLC LC-MS Dịch chiết etanol từ Cẩm đo HPLC đầu dò DAD bước sóng 522 nm Kết Hình 3.7 cho thấy có peak ứng với thời gian lưu 10,748 (chiếm 18,779%); 12,976 ( chiếm 18,1388%); 13,726 ( chiếm 63,6833%) Hình 3.3 Sắc kí đồ dịch chiết etanol Cẩm Tiến hành khảo sát hệ thống LC-MS với chế độ scan giá trị m/z từ 200 đến 1200 Trên hệ HPLC cho tín hiệu phút 10,748; 12,976; 13,726 cho tín hiệu tương ứng hệ LC-MS phút 10,498; 12,818; 13,936 Phổ khối lượng trình bày Hình 3.8, 3.9, 3.10 17 Hình 3.4 Phổ khối lượng dịch chiết etanol từ Cẩm, phút thứ 10,748 hệ LC-MS Hình 3.5 Phổ khối lượng dịch chiết etanol từ Cẩm phút thứ 12,818 hệ LC-MS Hình 3.6 Phổ khối lượng dịch chiết etanol từ Cẩm phút thứ 13,936 hệ LC-MS Kết Hình 3.10 Phổ khối lượng dịch chiết etanol từ Cẩm, phút thứ 13,936 hệ LC-MS cho thấy có giá trị m/z = 594,7 ứng với hợp chất cyanidin - 3-rutinoside Nhận xét chung Bằng phương pháp GC-MS, số thành phần hóa học dịch chiết từ Cẩm xác định Tổng số cấu tử 18 dịch chiết 85 cấu tử Cẩm từ: n-hexane có 20 cấu tử, clorofom có 19 cấu tử, etyl axetat có 23 cấu tử, etanol có 33 cấu tử Trong đó, dịch chiết etanol Cẩm nhiều cấu tử chứa 33 cấu tử Như vậy, điều kiện thực nghiệm phòng thí nghiệm dung môi chiết chất khác chúng có độ phân cực khác Bằng phương pháp HPLC kết hợp LC-MS chứng tỏ có hợp chất màu anthocyanin dịch chiết: chất dịch chiết etylaxetat hợp chất cyanidin 3-rutinoside hợp chất cyanidin 3malonyglucoside, chất dịch chiết etanol hợp chất cyanidin 3-rutinoside hợp chất cyanidin 3- malonyglucoside 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHIẾT PHẨM MÀU TỪ LÁ CẨM BẰNG ANCOL ETYLIC 3.3.1 Xác định bước sóng hấp thụ cực đại: Cho 1g Cẩm xay 50 ml C2H5OH vào bình cầu Lắp ống sinh hàn tiến hành đun nhiệt độ 50oC với thời gian thí nghiệm 30 phút Sau đem lọc với vải lần lọc giấy lọc thêm lần Dung dịch đo UV-Vis Xác định bước sóng cực đại Hình 3.7 Phổ UV-VIS dịch chiết etanol từ Cẩm Hình 3.11 cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại 664 nm, mật độ quang đạt 0,884 Chọn bước sóng 𝝺𝝺max = 664 nm để nghiên cứu yếu tố 3.3.2 Khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng 19 Cho 1g Cẩm V (ml) C2H5OH cho vào bình cầu, lắp ống sinh hàn vào bình cầu: tiến hành đun, nhiệt độ 50oC ứng với mẫu thí nghiệm với thể tích 50ml, 75ml, 100ml, 125ml, 150ml Sau thời gian 50 phút lấy ra: dung dịch bình cầu, lấy vải lọc lần, sau lọc thêm lần với giấy lọc Sau đem mẫu vừa lọc đo UV-Vis bước sóng 664 nm Kết trình bày Hình 3.12 Bảng 3.13 Hình 3.8 Phổ UV-VIS khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng dung dịch chiết từ Cẩm Bảng 3.13 Kết mật độ quang khảo sát tỷ lệ rắn – lỏng dung dịch chiết Cẩm Loại mẫu Mật độ 0,790 0,759 0,455 0,280 0,223 quang Bảng 3.13 cho thấy tỉ lệ rắn lỏng 1: 50 mật độ quang thu lớn tỉ lệ chất tan trích li tương đối cao, thể tích dung dịch nhỏ suy nồng độ lớn mật độ quang cao Khi tỉ lệ rắn lỏng 1: 75 độ quang có giảm so với tỉ lệ 1: 50, nhiên giảm không nhiều so với tăng thể tích (thể tích tăng 1,5 lần, mật độ quang gảm 0,96 lần so vơi ban đầu) điều cho thấy với tỉ lệ rắn lỏng 1: 75 trích li hoàn toàn nhất, chiết nhiều chất Chọn tỉ lệ rắn lỏng 1: 75 để nghiên cứu yếu tố 20 3.3.3 Khảo sát nhiệt độ Cho vào bình cầu: 1g cẩm xay 75ml C2H5OH Lắp ống sinh hàn tiến hành đun thời gian 50 phút Khảo sát mẫu với nhiệt độ là: 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC Sau thời gian 30 phút lấy ra, lọc với lần vải sau lọc dung dịch thêm lần với giấy lọc Đem mẫu thí nghiệm vừa lọc đo UV-Vis bước sóng 664 nm Bảng 3.14 Kết mật độ quang khảo sát nhi ệt độ dung dịch chiết từ Cẩm Loại mẫu (40oC ) (50oC ) (60oC ) (70oC ) (80oC ) Mật độ quang 0,849 0,904 1,126 1,227 1,237 Hình 3.9 Phổ UV-VIS khảo sát nhiệt độ dung dịch chiết từ Cẩm Kết trình bày Hình 3.13 cho thấy nhiệt độ tăng mật độ quang tăng Khi nhiệt độ tăng độ nhớt giảm, chuyển động phân tử ancol tăng dần Dưới tác dụng nhiệt độ protopectin không tan chuyển thành pectin tan Vì ancol thẩm thấu nhanh vào bên tế bào Cẩm làm cho diện tích tiếp xúc tế bào ancol tăng lên Dẫn đến áp suất nội bào tăng làm tế bào bị phá vỡ giải phóng chất, dẫn đến chất chiết hòa tan khuếch tán từ nguyên liệu vào ancol tăng Đối với mẫu mật độ quang tăng không đáng kể, chọn điều kiện ứng với mẫu (nhiệt độ 70oC) thực nghiên cứu 3.3.4 Khảo sát thời gian 21 Cho 1g cẩm xay 75ml C2H5OH vào bình cầu Lắp ống sinh hàn tiến hành đun nhiệt độ 70oC với thời gian ứng với mẫu thí nghiệm 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút, 70 phút Sau đem lọc với vải lần lọc giấy lọc thêm lần Các dung dịch đo UV-Vis Kết trình bày Hình 3.14 Hình 3.10 Phổ UV-VIS khảo sát thời gian dung dịch chiết từ Cẩm Bảng 3.15 Kết mật độ quang khảo sát thời gian chiết Loại mẫu Mật độ quang (30 phút ) 0,903 (40 phút ) 1,105 (50 phút ) 1,208 (60 phút ) 1,209 (70 phút ) 1,303 Từ Hình 3.14 Bảng 3.15 cho thấy thời gian tăng mật độ quang tăng, sau thời gian 50 phút mật độ quang tăng khơng đáng kể chất màu bị chiết hồn tồn, chọn thời gian 50 phút thời gian chiết Từ kết thực nghiệm cho thấy hàm lượng phẩm màu từ Cẩm chiết cồn thực phẩm thu với giá trị cao điều kiện tỉ lệ rắn lỏng 1:75, nhiệt độ 70oC, thời gian 50 phút 22 3.4 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHẨM MÀU GIÀU ANTHOCYANIN TỪ CÂY LÁ CẨM TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM 3.4.1 Xác định số tiêu vi sinh Để kiểm tra tính an tồn phẩm màu thực phẩm thu nhận cồn thực phẩm từ Cẩm tiến hành kiểm tra số tiêu vi sinh a Phương pháp tham chiếu Để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, phẩm màu từ Cẩm xác định số tiêu vi sinh Quy định giới hạn tối đa nhiễm sinh học hóa học thực phẩm (QĐ 46/2007/QĐBYT ngày 19/12/2007) Các TCVN, ISO theo quy định xét nghiệm thực phẩm, sản phẩm thực phẩm trình bày Bảng 3.16 Bảng 3.16 Một số tiêu phương pháp thử STT Tên tiêu Phương pháp thử 01 TSVKHK TCVN 4884-1:2015 02 Coliform TCVN 4882:2007 03 E.coli TCVN 6846:2007 04 Cl.perfringens TCVN 4991:2005 05 B.cereus TCVN 4992:2005 06 TSBTNMM-M TCVN 8275-2:2010 b Kết số tiêu vi sinh Kết xác định số tiêu vi sinh trình bày Bảng 3.17 Bảng 3.17 Kết số tiêu vi sinh Tên tiêu Giới hạn cho phép Kết Đơn vị Nhận xét TSVKHK Coliform 104 10 2,6 x 103 4,3 CFU/g MPN/g Đạt E.coli Khơng có MPN/g Đạt Cl.perfringens 10 < 10 CFU/g Đạt Đạt 23 B.cereus 102 < 10 CFU/g Đạt TSBTNMM-M 102 < 10 CFU/g Đạt Ghi chú: