Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận APTAMER đặc hiệu kháng sinh PENICILLIN

VIN I HC M H NI KHOA CễNG NGH SINH HC KHểA LUN TT NGHIP ti: NGHIấN CU SNG LC V THU NHN APTAMER C HIU KHNG SINH PENICILLIN Giỏo viờn hng dn: PGS.TS Lấ QUANG HUN TS L TH HUYN Sinh viờn thc hin: NGUYN NH HOA Lp: 11- 04 H Ni 2015 LI CM N Li u tiờn, xin c gi li cm n sõu sc nht t trỏi tim n b m thõn yờu ó nuụi ln, dy d v luụn bờn cnh ng viờn Con hiu rng, bao nhiờu khú khn, vt v, m hụi v nc mt m b m ó chu ng cho cuc sng tt p nht Con yờu v cm n b m rt nhiu V hon thnh khúa lun ny, li u tiờn em mun gi li cm n sõu sc n PGS.TS Lờ Quang Hun, TS Ló Th Huyn ó tn tỡnh hng dn, giỳp em sut quỏ trỡnh thc hin khúa lun tt nghip Em xin by t li cm n n quý Thy, Cụ giỏo khoa Cụng ngh sinh hc - Vin i Hc M H Ni ó ging dy, ch bo tn tỡnh em sut bn nm qua, nhng kin thc m em nhn c trờn ging ng i hc va l nn tng cho quỏ trỡnh nghiờn cu khúa lun v va l hnh trang qỳy bỏu giỳp em vng bc tng lai Em mun gi li cm n n cỏc anh ch phũng Cụng ngh T bo ng vt Vin Cụng ngh Sinh hc Vin Hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó hng dn rt nhit tỡnh v cho em nhng li khuyờn b ớch v chuyờn mụn quỏ trỡnh thc hin ti Nhõn dp ny em mun gi li cm n n ngi thõn, bn bố ó luụn bờn em, giỳp , ng viờn em sut thi gian qua H Ni, ngy thỏng nm 2015 Sinh viờn Nguyn Nh Hoa i MC LC LI CM N i MC LC ii DANH MC CC Kí HIU V CC CH VIT TT v DANH MC CC HèNH vi DANH MC CC BNG vii M U CHNG 1: TNG QUAN TI LIU 1.1 Tng quan v penicillin 1.1.1 Khỏng sinh penicillin 1.1.2 Lch s phỏt hin v sn xut penicillin 1.1.3 Phõn loi 1.1.4 Cu trỳc húa hc v mt s tớnh cht ca cỏc penicillin 1.1.5 C ch tỏc ng ca khỏng sinh penicillin lờn vi khun 1.1.6 Khỏng sinh chn nuụi 1.1.6.1 Tỏc dng ca vic s dng khỏng sinh thc n chn nuụi 1.1.6.2 Tỡnh hỡnh s dng khỏng sinh thc n chn nuụi mt s quc gia 1.1.7 D lng khỏng sinh cỏc mu thc phm v mt s phng phỏp xỏc nh d lng khỏng sinh 1.1.7.1 D lng khỏng sinh cỏc mu thc phm 10 1.1.7.2 Quy nh v tn d khỏng sinh nhúm -Lactam thc phm 10 1.1.7.3 Mt s phng phỏp xỏc nh d lng khỏng sinh 11 1.2 Tng quan v aptamer 13 1.2.1 Khỏi nim 13 ii 1.2.2 c trng ca aptamer 13 1.2.3 u im ca aptamer so vi khỏng th 14 1.2.4 Phng phỏp thu nhn aptamer phng phỏp SELEX 14 1.2.5 Tỡnh hỡnh nghiờn cu aptamer v ngoi nc 17 CHNG 2: VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 18 2.1 Vt liu 18 2.1.1 Sinh phm 18 2.1.2 Húa cht 18 2.1.3 Trang thit b 19 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 20 2.2.1 Chun b th vin 20 2.2.1.1 PCR lm giu th vin 20 2.2.1.2 Ct DNA si ụi thnh si n 21 2.2.2 Phng phỏp SELEX sng lc aptamer c hiu penicillin 22 2.2.3 Phng phỏp tỏch dũng v gii trỡnh t 24 2.2.3.1 Nhõn bn aptamer liờn kt vi penicillin bng k thut PCR 24 2.2.3.2 Phõn tớch in di trờn gel agarose 26 2.2.3.3 Phng phỏp tinh sch sn phm phn ng PCR 26 2.2.3.4 Phn ng gn gen vo vector tỏch dũng 27 2.2.3.5 Bin np plasmid vo E.coli chng DH5 28 2.2.3.6 Phng phỏp tỏch DNA plasmid t vi khun E coli 29 2.2.3.7 Phng phỏp xỏc nh trỡnh t nucleotide 31 2.2.3.8 Phng phỏp xỏc nh ỏi lc gn gia aptamer vi penicillin 31 CHNG 3: KT QU THC NGHIM 33 3.1 Kt qu sng lc aptamer liờn kt penicillin 33 iii 3.1.1 Chun b th vin 33 3.1.2 Kt qu sng lc aptamer liờn kt penicillin 34 3.2 Kt qu tỏch dũng aptamer liờn kt penicillin sau sng lc 39 3.3 Xỏc nh ỏi lc liờn kt ca aptamer (cỏc phõn t DNA si n) vi penicillin 41 3.4 Xỏc nh trỡnh t aptamer thu c 44 KT LUN V KIN NGH 47 TI LIU THAM KHO 48 iv DANH MC CC Kí HIU V CC CH VIT TT DNA Axit deoxyribonucleic Bp Cp base EDTA Axit ethyenediaminetetraacetic E.coli Vi khun Escherichia coli LB Mụi trng Luria Bertani PCR Phn ng chui trựng hp RNA Axit Ribonucleic ssDNA Si n DNA dsDNA Si ụi DNA TAE Tris acetate EDTA PBS Phosphate buffer saline Taq polymerase Enzyme polymerase chu nhit BSA Bovine Serum Albumin TMB Tetramethylbenzidine DMSO Dimethyl sulfoxide SDS Natri dodexyl sulphat MPBS Milk + Phosphate buffer saline TPBS Tween + Phosphate buffer saline X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl--galactosidase EtBr Ethidium bromide v DANH MC CC HèNH Hỡnh 1.1: Cu trỳc chung ca cỏc penicillin Hỡnh 1.2: Cỏc khỏng sinh c ch tng hp vỏch t bo vi khun Hỡnh 1.3:Mt cỏc dng cu trỳc ca aptamer 14 Hỡnh 1.4: Quy trỡnh phng phỏp Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) 15 Hỡnh 1.5: S cỏc phõn t DNA si n th vin aptamer 16 Hỡnh 2.1: S cu to vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) 27 Hỡnh 2.2 : Hỡnh nh minh k thut ELISA trc tip 31 Hỡnh 3.1: Kt qu phn ng PCR lm giu th vin 33 Hỡnh 3.2: Kt qu PCR vi khuụn l ssDNA sau vũng sng lc th nht 35 Hỡnh 3.3: Kt qu PCR lm giu sau vũng sng lc 3, 36 Hỡnh 3.4: Kt qu PCR lm giu sau vũng sng lc 37 Hỡnh 3.5: Kt qu PCR lm giu sau vũng sng lc 37 Hỡnh 3.6: Kt qu PCR vũng sng lc loi tr 38 Hỡnh 3.7: Kt qu bin np vector pCR2.1 mang sn phm PCR vo t bo 39 E coli chng DH5 39 Hỡnh 3.8: Kt qu PCR trc tip t khun lc vi cp mi ApF2/ApR2 40 Hỡnh 3.9: Kt qu tỏch chit DNA plasmid mang sn phm PCR 40 Hỡnh 3.10: Kt qu ELISA gia aptamer c hiu khỏng sinh penicillin 42 Hỡnh 3.11: Biu th hin kh nng gn kt ca cỏc aptamer c hiu penicillin 43 Hỡnh 3.12: Kt qu xỏc nh trỡnh t nucleotide ca dũng cha aptamer s 44 Hỡnh 3.13: Kt qu xỏc nh trỡnh t nucleotide ca dũng cha aptamer s 44 Hỡnh 3.14: Cu trỳc khụng gian ca aptamer (dũng s 1) cú kh nng gn kt vi penicillin 45 vi DANH MC CC BNG Bng 1.1: D lng ti a khỏng sinh nhúm -Lactam thc phm 10 Bng 2.1: Thnh phn phn ng PCR lm giu th vin 20 Bng 2.2: Chu k nhit phn ng PCR lm giu th vin 21 Bng 2.3: Thnh phn phn ng to si n ADN 21 Bng 2.4: Thnh phn phn ng PCR khuch i cỏc trỡnh t gn 25 Bng 2.5: Chu k nhit ca phn ng PCR khuch i cỏc trỡnh t gn 25 Bng 2.6: Thnh phn phn ng gn on gen vo vector pCR2.1 28 Bng 3.1: Kt qu o nng ssDNA sau vũng sng lc 35 Bng 3.2: Nng ssDNA ca cỏc mu aptamer sau PCR vi cp mi lch 41 Bng 3.3: Kt qu ELISA gia aptamer c hiu khỏng sinh penicillin vi BSApenicillin 43 vii M U Ngy xó hi phỏt trin cng cao thỡ nhu cu i sng ngi cng cao hn, ú cht lng v an tonchim mt v trớ rt quan trng Tuy nhiờn, lnh vc chn nuụi gia sỳc, gia cmhin vic hng dn v qun lý s dng thuc khỏng sinh cũn lng lo ú tỡnh trng s dng cỏc cht khỏng sinh thc n chn nuụi khỏ tựy tin T ú ó li tn d cỏc khỏng sinh sn phm thc phm ( tht, cỏ, trng, sa,) gõy nguy hi nghiờm trng n sc khe ngi tiờu dựng v uy tớn hng xut khu ca nc ta Khỏng sinh penicillin l thn dc th h u tiờn cú tớnh khỏng khun rt mnh i vi nhiu loi vi khun Penicillin úng mt vai trũ ht sc quan trng vic chng li nhiu bnh tt cho ngi v cỏc loi ng vt Bờn cnh ú, nú c xem l v khớ mnh m i vi cỏc nh chn nuụi vic kớch thớch tng trng ng vt, nõng cao nng sut Vỡ mc ớch li nhun m sc khe ca ngi tiờu dựng b nguy hi khụng may s dng nhng sn phm thc phm cú tn d khỏng sinh Theo cỏc bỏo cỏo v y t, penicillin l khỏng sinh thng gõy d ng nht ó cú trng hp ngi b ni mn da trm trng vỡ ung sa cú d lng penicillin ([...]... Khoa học và Công nghệ Việt Nam đang tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất chế tạo và sử dụng bộ KIT phát hiện kháng sinh trong sữa bằng kỹ thu t nano (sử dụng aptamer) .Phòng đã có bài báo về aptamer được đăng trên Tạp chí Y học Việt Nam: “Sử dụng quy trình Selex sàng lọc aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn Escherichia Coli O157:H7” 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Sinh. .. 5 phút, thu dịch để kiểm tra nồng độ và sử dụng làm khuôn cho vòng sàng lọc tiếp theo Sau 7 vòng sàng lọc, để hạn chế tối đa những sản phẩm thu được sau giải hấp không liên kết đặc hiệu với kháng sinh penicillin, chúng tôi thực hiện vòng sàng lọc loại trừ Hay nói cách khác, các phân tử DNA nhận được sau vòng sàng lọc cuối cùng (vòng 7) bao gồm: các phân tử có khả năng gắn kết với penicillin và các phân... chế được hơn 100 kháng sinh penicillin sinh tổng hợp Tuy nhiên chỉ penicillin G và penicillin V là được sản xuất trong công nghiệp với tỷ lệ 80% và 20% Năm 1975 sản lượng penicillin khoảng 35.000 tấn, trong đó 38% được 4 dùng để chữa bệnh dưới dạng penicillin V và penicillin G, 12% dùng trong thú y và 43% được sử dụng để điều chế các kháng sinh penicillin bán tổng hợp, và trên 20 penicillin bán tổng... đó là 94 C trong 1 phút, 92oC trong 1 phút và sau đó nhiệt độ giảm dần mỗi 2oC giữ trong 1 phút cho o đến khi đạt 28 C để sợi đơn oligonucleotid cuộn gấp tạo cấu trúc thứ cấp đặc thù cho aptamer 2.2.2 Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu penicillin Quy trình của một vòng sàng lọc như sau: Chuẩn bị cột agarose có gắn kháng sinh penicillin - Kháng sinh penicillin được gắn với agarose được sử dụng... một nhóm các kỹ thu t sinh học phân tử để tổng hợp in vitro oligonucleotide có khả năng liên kết với phân tử đích [7] Trong quá trình sàng lọc aptamer theo một quy trình SELEX gồm nhiều vòng sàng lọc với 3 quá trình: chọn lọc những trình tự oligonucleotide (aptamer) gắn với phân tử đích từ thưviện oligonucletide ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử... lượng kháng sinh có trong mẫu nghiên cứu mà không thể phân tích từng loại kháng sinh được 12 1.2 Tổng quan về aptamer 1.2.1 Khái niệm Aptamer là các oligonucletide (ssDNA, RNA)hoặc là các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng và có khả năng gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng Aptamer được sàng lọc từ nguồn các oligonucleotide với trình tự ngẫu nhiên theo quy trình sàng. .. dụng kháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng và phòng bệnh bổ sung vào thức ăn cho lợn, đặc biệt là lợn con và lợn choai Tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong thức ăn cao: 100% có oxytetracycline, 67% có cloramphenicol, 30% có olaqundox, 7% có dexamethasol [19] Giám sát tình hình sử dụng kháng sinh tại 30 trại lợn thịt và 30 trại nuôi gà thịt trên địa bàn tỉnh Hưng Yên và Hà Tây cho thấy 60% mẫu lợn thịt và. .. hấp thu nhanh và thải trừ nhanh ra khỏi cơ thể cho nên thời gian tác dụng ngắn Penicillin nhóm II: • Gồm các penicillin thu c dẫn xuất penicillin bán tổng hợp có phổ kháng khuẩn hẹp hơn Penicillin G nhưng có khả năng kháng penicilinase, dùng để chữa nhiễm khuẩn do tụ cầu đã kháng penicillin nhóm I như Methicillin, Cloxacilin Penicillin nhóm III: • Gồm các penicillin bán tổng hợp phổ rộng, không kháng. .. của aptamer 1.2.3 Ưu điểm của aptamer so với kháng thể Độ tinh khiết của aptamer cao hơn được tổng hợp và tinh sạch trong khi đó sản xuất kháng thể phải sử dụng các hệ thống sinh học, các cơ thể sống và quá trình tinh sạch khó khăn hơn Giá thành sản xuất aptamer thấp hơn, thời gian sàng lọc ngắn hơn so với việc sản xuất các kháng thể Phổ đích của aptamer rất rộng so với kháng thể từ những phân tử nhỏ... sản lượng penicillin của thế giới là khảng 300.000 tấn/năm [18] 1.1.3 Phân loại Phân nhóm penicillin thu c nhóm β-lactam Dựa vào nguồn gốc có thể sắp xếp các penicillin thành 3 nhóm: Penicillin nhóm I: • Gồm các penicillin tự nhiên, được chiết suất từ môi trường nuôi cấy nấm Penicillinum notatum hoặc Penicillinum chrysogenumnhư Penicillin G, Penicillin V, không kháng được penicilinase • Các penicillin