Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM VĂN PHÖC NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU KHÁNG SINH TETRACYCLINE VÀ ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÊ QUANG HUẤN Hà Nội – 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI MỞ ĐẦU Kháng sinh loại thuốc quan trọng coi chiến lược cuối để điều trị nhiễm trùng người Tuy nhiên, hiệu điều trị chúng bị đe dọa việc sử dụng kháng sinh rộng rãi không phù hợp không y học mà nông nghiệp Sự diện dư lượng kháng sinh thực phẩm mức cho phép bất hợp pháp Vì vậy, kiểm soát dư lượng sữa, thực phẩm…đang vấn đề xã hội quan tâm Tetracyline nhóm thuốc kháng sinh phổ rộng Chúng sử dụng vừa để điều trị bệnh cho người động vật vừa dùng để kích thích tăng trưởng động vật Do đó, sản phẩm thực phẩm từ động vật (thịt, trứng, sữa) có nguy chứa dư lượng Tetracycline dẫn đến nguy hại cho sức khỏe người sử dụng Mức độ tối đa cho phép sữa 100 μg/kg, gan 600 μg/kg thận 1200 μg/kg (theo tiêu chuẩn Codex) Hiện nay, việc nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh Tetracycline thực phẩm nói chung sữa nói riêng chủ yếu dựa phương pháp phân tích hóa lý thông thường phương pháp vi sinh vật, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao, ELISA Các phương pháp hầu hết cho độ nhạy cao, kết xác Tuy nhiên, hạn chế phương pháp chỗ đòi hỏi nhiều hóa chất, dung môi; cần lượng mẫu phân tích lớn; khả phân tích nhanh theo thời gian thực; thiết bị cồng kềnh, sử dụng phức tạp, mặt khác chi phí cho lần đắt đỏ so với điều kiện kinh tế nước nhà Công nghệ nano tạo loại vật liệu hệ có đặc tính siêu việt Các ứng dụng công nghệ nano vào khoa học sống ngày phát triển rộng rãi, việc sử dụng vật liệu nano để tạo cảm biến sinh học (biosensor) hướng nghiên cứu nhiều phòng thí nghiệm giới nước quan tâm phát triển Ưu điểm bật việc sử dụng cấu trúc nano việc tạo cảm biến sinh học tính đặc hiệu độ nhạy cao Nguyên lý cảm biến sinh học xác định thay đổi quang điện hóa tương tác đặc hiệu phân tử Trong tương tác kháng nguyên-kháng thể, tương tác enzyme-cơ chất, tương tác thụ thể-ligand tương tác bản, đóng vai trò then chốt Mặc dù có độ nhạy độ đặc hiệu cao, Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ khả ứng dụng cảm biến sinh học thực tế nhiều hạn chế thời gian chuẩn bị mẫu, thao tác lâu, phức tạp Hơn nữa, vấn đề thu nhận tinh kháng thể, nguyên liệu then chốt để tạo cảm biến sinh học, phức tạp, tốn độ bền kháng thể hạn chế Vì vậy, việc sử dụng phân tử thay kháng thể đơn dòng chế tạo cảm biến sinh học bảo đảm độ nhạy độ đặc hiệu cao cần thiết, aptamer xem phân tử thay kháng thể đơn dòng phù hợp chế tạo biosensor Aptamer sợi đơn DNA, phân tử RNA đoạn peptide có cấu trúc đặc biệt có khả gắn kết với phân tử đích khác nhau, chẳng hạn phân tử hữu nhỏ, protein tế bào ung thư Với đặc tính độc đáo, aptamer trở thành nhóm chất có nhiều tiềm ứng dụng điều trị ung thư So với kháng thể đơn dòng aptamer có nhiều ưu điểm hơn: (1) aptamer có kích thước phân tử nhỏ kháng thể không sinh đáp ứng miễn dịch sử dụng in vivo, (2) aptamer có khả nhận biết gắn kết đặc hiệu với phân tử đích tương đương phân tử kháng thể, (3) việc chế tạo aptamer đơn giản, nhanh, hiệu vượt trội so việc tạo kháng thể đơn dòng kháng thể tái tổ hợp, (4) aptamer có độ bền với tác nhân hóa, lý, môi trường cao kháng thể Vì vậy, aptamer hướng nghiên cứu công nghệ gen nhằm sử dụng chẩn đoán điều trị miễn dịch Từ lí trên, xin đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline định hƣớng ứng dụng” Mục tiêu đề tài:  Xây dựng quy trình sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline  Chọn dòng phân tử aptamer có lực cao với kháng sinh Tetracycline  Bước đầu phát kháng sinh sữa biosensor theo nguyên lý điện hóa Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH TETRACYCLINE 1.1.1 Kháng sinh Tetracycline Tetracycline kháng sinh thuộc hệ cũ tìm từ năm 1948, loại thuốc tốt Trong trình sử dụng dù tỷ lệ kháng lại nhiều kháng sinh công hiệu chưa thể loại bỏ khỏi tủ thuốc nhân loại Tetracycline dòng kháng sinh phổ rộng, có hiệu lực với vi khuẩn gram âm gram dương Nó coi kháng sinh ―bách bệnh‖ dùng cho loại vi khuẩn sử dụng lạm dụng Tỷ lệ kháng kháng sinh cao mà công hiệu vốn có Với tác dụng đặc hiệu Tetracycline bảo toàn sau 70 – 80 năm kháng sinh đầu bảng bệnh nhiễm Chlamydiae, bệnh nhiễm Mycoplasma, Rickettsiae sốt kiểu thương hàn, sốt hồi quy đặc biệt nhiễm phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae gây bệnh dịch tả điển hình mùa hè 1.1.2 Phân loại Hình 1.1 Công thức hóa học chung nhóm Tetracycline ( Nguồn: Từ Ming Koóng, 2004) Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Kháng sinh nhóm Tetracycline bao gồm loại là: Oxytetracycline, Tetracycline Chlortetracycline Các loại Tetracycline có cấu trúc giống nhau, chúng khác gốc R 1.1.3 Cơ chế tác động Tetracycline vận chuyển theo phương thức tích cực qua màng bào tương vi khuẩn mẫn cảm với thuốc Các yếu tố vận chuyển tích cực có vi khuẩn mà tế bào vật chủ Sau thuốc vượt qua màng bào tương gắn vào tiểu phần 30s Ribosom đồng thời gắn vào ARN thông tin, từ ngăn cản gắn kết axit amin vào chuỗi peptid Qua đó, chúng ức chế trình tổng hợp protein vi khuẩn Nếu protein vi khuẩn phát triển, nhân rộng tăng số lượng Do đó, Tetracycline làm dừng lại trình lây lan vi khuẩn lại bị giết hệ thống miễn dịch tự chết Hình 1.2 Cơ chế tác động Tetracycline (Nguồn: Gary E Kaiser) Đề kháng Tetracycline thay đổi khả thẩm thấu vách tế bào vi khuẩn Ở vi khuẩn nhạy cảm, thuốc tập trung vào bên khó thoát khỏi tế bào, vi khuẩn đề kháng thuốc không vận chuyển chủ động vào bên dễ dàng rời khỏi tế bào cách nhanh chóng làm nồng độ ức chế thuốc không trì Cơ chế kiểm soát plasmid 1.1.4 Phổ hấp thụ Kháng sinh nhóm Tetracycline có phổ tác dụng rộng Chúng tác dụng với nhiều loại vi khuẩn gram dương âm, nhiều loại Mycoplasma, Clamidia, Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Richketsia; tác dụng với Protozoa (ở nồng độ cao) Theileria, Anaplasma, Eperythrozoom Tác dụng tốt với Clostridium, Listeria, Streptococcus, E.rhusiopathiae, Brucella, B,bronchiseptica, Klebsiella Không tác dụng với P.aeruginosa, P vulgaris [6] 1.1.5 Sự hấp thu, phân bố thải trừ Hấp thu Tetracycline thường hấp thu theo đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp cho động vật, tiêm da cho gia cầm Nếu đưa thuốc đường miệng, kháng sinh nhóm Tetracycline giữ nồng độ tác dụng máu từ – 4h Oxytetracycline thải qua phân với nồng độ 2,5 mg/g phân cho uống người Khả hấp thu thuốc giảm nhiều cho uống với sữa, sản phẩm sữa muối ion Al3+, Mn2+, Mg2+, Ca2+… Nếu tiêm, thuốc hấp thu gần hoàn toàn, nhanh đạt nồng độ hữu hiệu máu đường uống Đưa đường tiêm, thuốc phân bố dịch tổ chức hơn, rộng so với uống Do hiệu điều trị cao Sau uống khoảng – 4h, thuốc đạt nồng độ hữu hiệu máu giữ khoảng 6h hay lâu hơn, kéo dài tới 24h hay 30h Nếu sau 6h lại uống 250 mg, nồng độ thuốc máu đạt – μg/ml Còn uống liều 500 mg, nồng độ thuốc máu đạt – μg/ml Liều g nồng độ cao μg/ml Nồng độ trì suốt thời gian điều trị Khi tiềm liều 250 – 500 mg, nồng độ thuốc máu đạt từ – 10 μg/ml [6] Phân bố Hàm lượng thuốc tổ chức có liên quan lớn đến liều lượng sử dụng với hàm lượng nước mô tổ chức thể Chúng phụ thuộc vào liên kết biến đổi protein huyết tương Ví dụ Chlortetracycline 50 – 70%, Oxytetracycline 20 – 25% Tất dạng thuốc nhóm Tetracycline sau hấp thu chuyển tới gan theo mật đổ xuống ruột non Hàm lượng thuốc gan, mật cao máu từ – 10 lần Thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột – máu nên tồn lâu máu, thời gian tác dụng thuốc dài Thải trừ Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tetracycline phần lớn thải trừ qua nước tiểu Sự lọc thải thuốc phụ thuộc vào công thận Nếu tiêm khoảng 20 – 60%, lượng thuốc thải qua thận sau 24h đầu Có khoảng 20 – 55% liều uống thải qua nước tiểu Trong có khoảng 10 – 35% lượng Oxytetracycline thuốc thải qua nước tiểu dạng hoạt tính sau dùng thuốc 1/2h đến 5h Còn Chlortetracycline uống, có khoảng 10 – 15% lượng thuốc tìm thấy nước tiểu Sự thải Chlortetracycline qua thận khoảng 35%, thấp Oxytetracycline Nếu tiêm tĩnh mạch, 60% lượng thuốc thải qua nước tiểu 12h đầu Nếu đưa thuốc qua đường uống, phần Tetracycline không hấp thu thải trừ qua đường tiêu hóa (theo phân) dạng hoạt lực Có khoảng 500 – 600 μg Tetracycline g phân Đồng thời phần lượng thuốc tiêm thải trừ qua phân thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột theo phân [1] 1.1.6 Tính kháng thuốc Kháng thuốc diễn chậm, theo bước tăng dần Nguyên nhân chuyển vận thuốc qua màng bị rối loạn, giảm dần Trong trường hợp kháng R.Plasmid ngược lại, lan truyền nhanh Sử dụng Tetracycline rộng rãi, không kiểm soát tạo điều kiện làm tăng tình trạng kháng thuốc thực tế lâm sàng Tình trạng kháng thuốc vi khuẩn E.coli, Salmonella, Proteus giống nhau; tỷ lệ chủng Staphylococcus kháng thuốc thay đổi tùy tình hình, tùy địa phương Các chủng M.hyoneumoniae, M.bovis, Pasteurella, A.pleuropneumoniae có tỷ lệ kháng [6] 1.1.7 Tác dụng phụ Không thể phủ nhận hiệu lực Tetracycline việc điều trị nhiễm trùng, đặc biệt bệnh nhiễm trùng thuộc vi khuẩn kể Người bệnh thấy có biến chuyển từ liều khỏi bệnh Song ẩn chứa nhiều nguy có hại mặt sức khỏe Khi Tetracycline sử dụng chăn nuôi nhiều dẫn đến dư thừa sản phẩm thực phẩm nói chung sữa nói riêng Hàm lượng dư thừa người sử dụng hấp thụ thời gian dài gây tích lũy ảnh hưởng có hại tới sức khỏe Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Mặc dù tương đối an toàn, tác dụng phụ thường gặp Tetracycline bao gồm phản ứng dị ứng từ nhẹ đến trung bình, nhạy cảm với ánh nắng mặt trời, rối loạn dày, nhức đầu nặng vấn đề liên quan đến thị lực Ngoài ra, nhóm kháng sinh Tetracycline có xu hướng tác dụng xương trẻ em Do đặc tính đặc thù kết hợp tạo phức hợp bền (chelat) với canxi, thành phần nhiều xương nên Tetracycline dễ dàng tạo phức hợp bền với yếu tố hai quan cốt hóa Sự lắng đọng lâu kéo dài Tetracycline gây tượng hỏng men răng, xỉn răng, hủy hoại phát triển xương Nếu phụ nữ mang thai vào giai đoạn cuối thai kỳ sử dụng sữa có chứa dư lương Tetracycline ngăn chặn phát triển xương trẻ em Do vậy, kháng sinh Tetracycline tuyệt đối không sử dụng bà mẹ mang thai thời kỳ cuối (ba tháng cuối) không dùng cho trẻ em đến đứa trẻ 12 tuổi Do thuốc gây ức chế tổng hợp protein nên gây ứ đọng axit amin, đơn vị tiền thân protein Sự dư thừa axit amin gây tăng phân giải tạo sản phẩm ure nitơ Do mà thuốc làm tăng nồng độ ure huyết Bởi vậy, người già người bị bệnh lý thận mà vô tình bị tích lũy dư lượng Tetracycline hậu nguy hiểm Chúng làm cho gia tăng ure huyết đỉnh điểm gây tai biến, dẫn đến hôn mê Nếu xét độc tính gan Tetracycline thuốc kháng sinh gây viêm gan điển hình họ hàng nhà kháng sinh Thuốc gây viêm gan viêm tụy mức độ nặng dùng liều cao kéo dài Do đó, đối tượng sẵn có bệnh lý gan tụy viêm gan virut, viêm tụy, viêm gan tắc mật, viêm gan vàng da việc sử dụng sản phẩm sữa chứa dư lượng kháng sinh yếu tố làm tăng tình trạng bệnh Bên cạnh đó, việc tích lũy hàm lượng Tetracycline thời gian dài dẫn đến nguy phá vỡ hệ cân vi sinh vật đường ruột, tạo chủng kháng thuốc kháng sinh 1.1.8 Tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi Tình hình sử dụng kháng sinh giới Nhu cầu sử dụng kháng sinh chăn nuôi động vật nói chung nuôi bò sữa nói riêng lớn Kháng sinh sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ dùng với liều lượng thấp 2,5 – 50 ppm Việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi đánh dấu thí nghiệm Stokstad Juke (1949) cho gia cầm ăn thức ăn có bổ sung Chlortetracycline, nhận thấy tốc độ sinh trưởng hiệu sử dụng thức ăn gia cầm tăng rõ rệt Từ nhiều công trình nghiên cứu kháng sinh chất bổ sung thức ăn chăn nuôi thực Bắt đầu từ năm 1950 1960 kỷ 20, kỷ nguyên ngành chăn nuôi mở kháng sinh coi yếu tố thiếu, tạo nên bước đột phá suất hiệu chăn nuôi nhiều nước giới Ở Mỹ hàng năm khoảng triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh dùng chăn nuôi Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn; 70% bò sữa 60% bò thịt Mỹ nuôi dưỡng thức ăn có bổ sung kháng sinh USD chi phí cho kháng sinh dùng thức ăn, người chăn nuôi thu lợi tức 2- USD Vào năm 1999, riêng lượng kháng sinh nhóm Tetracycline sử dụng 1453 tấn, chiếm khoảng 15,67% lượng kháng sinh dùng (theo số liệu thống kê viện thú y Mỹ) đặc biệt khoảng 13,7% tổng lượng kháng sinh sử dụng với mục đích kích thích sinh trưởng [7] Ở Anh, Tetracycline nhóm kháng sinh sử dụng nhiều để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, chiếm 50% tổng số kháng sinh bổ sung vào thức ăn Theo số liệu Ghislain Follet, năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng dân y chăn nuôi nước châu Âu 10500 (quy theo mức 100% tinh khiết thành phần hoạt tính), 52% sử dụng dân y, 33% điều trị thú y 15% chất bổ sung thức ăn chăn nuôi Trong đó, tỷ lệ loại kháng sinh sử dụng chăn nuôi: penicillin: 9%; tetracycline: 66%; macrolide: 12%; Aminoglycoside: 4%; Fluoroquinolone: 1%; Trimethomprim/sulpha: 2% kháng sinh khác: 6% [6] Tình hình sử dụng kháng sinh Việt Nam Từ đưa vào Việt Nam đến nay, kháng sinh ngày sử dụng rộng rãi liên tục, có phần không nhỏ cho lĩnh vực chăn nuôi Nhằm tăng khả chống chịu thay đổi môi trường mầm bệnh nên trình chăn nuôi, người ta thường sử dụng kháng sinh trộn vào thức ăn, nước Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ uống tiêm với mục đích kích thích tăng trường, phòng bệnh trị bệnh Việc trộn kháng sinh vào thức ăn vật nuôi với hàm lượng cao, không tuân thủ thời gian quy định ngưng thuốc trước xuất chuồng nguyên nhân gây tồn dư kháng sinh thực phẩm vượt mức cho phép (Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT) Hậu ảnh hưởng tới sức khỏe người nguy dị ứng kháng sinh, độc tính mãn tính gia tăng tượng đề kháng kháng sinh Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ sử dụng kháng sinh chăn nuôi cao: 100% có Oxytetracycline, 67% có Chloramphenicol, 30% có Olaquindox, 77% có Dexamethasol [5] Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tiến hành khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi dư lượng kháng sinh thịt quầy kinh doanh gia súc, gia cầm (2003) Điều tra 628 hộ chăn nuôi lợn, gà cho thấy đa số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý liều cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa bệnh cho gia súc bán Xét nghiệm mẫu thịt lấy trực tiếp chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh phát Trong đó, loại sử dụng nhiều Chloramphenicol (chiếm 15,35%), Tylosin (15%), Colistin (13,24%), Norfloxacin (10%), Gentamycin (8,35%), nhóm Tetracycline (7,95%), Ampicillin (7,24%)… Trong đó, Chloramphenicol kháng sinh bị cấm sử dụng nhiều quốc gia Trong 149 mẫu thịt gà kiểm tra, phân tích có đến 44,96% số mẫu có dư lượng kháng sinh vượt mức quy định cho phép từ 2,5 – 1.100 lần so với tiêu chuần ngành Trong đó, loại kháng sinh Chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao đến 87,50%, Flumequin chiếm 83,33%, Chlortetracycline chiếm 62,50%, Amoxillin chiếm 60% Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh hộ chăn nuôi địa bàn Hà Nội cho thấy tỷ lệ sử dụng loại kháng sinh Quinolones 78,14%, Macrolides 86,89%, Polipeptides 54,92%, Aminoglycosides 50,96%, β-lactams 4,58% Tetracycline 46,58% Từ năm 2003 – 2006, kết phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng 150 mẫu thịt gan gia cầm, gia súc thu thập Hà Nội Khoa Thực phẩm vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện dinh dưỡng Quốc gia cho thấy: 10 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ kcal/mol), chứa vùng hoạt động: vùng gồm nucleotid 8-26, vùng gồm nucleotid 28-49 Trình tự aptamer ssDNA 18 đưa vào công cụ FASTA để so sánh với trình tự aptamer ngân hàng gen Kết nhận cho thấy aptamer 18 có độ tương đồng cao so với aptamer công bố patent 3.3 BƢỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH TETRACYCLINE TRONG SỮA BẰNG BIOSENSOR THEO NGUYÊN LÝ ĐIỆN HÓA Từ dòng aptamer 18 chọn, tiến hành PCR làm giàu, xử lý sợi đôi thành sợi đơn thực enzyme lamda exonuclease gắn kết h Fero/ Feri xianua Kết thể hình 3.18 Hình 3.18 Giản đồ vòng điện cực vàng điện cực vàng - aptamer Tiến hành đo tín hiệu điện hóa, kết thể bảng sau Bảng 3.5: Tín hiệu điện hóa quét vòng điện cực vàng điện cực vàng-aptamer Điện cực Epa(mV) Au 308,5 185,9 122,6 25,59 24,07 Au-Apt 339,1 90,02 249,08 18,15 12,53 Epc(mV) ∆Ep(mV) Ipa (uA) - Ipc(uA) 68 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - 2+ , Fe3+ - -DNA Điều chứng tỏ, aptamer hấp phụ lên bề mặt điện cực vàng làm cản trở trao đổi điện đổi điện tích cặp Fe2+/Fe3+ Điện cực Au-aptamer vừa chế tạo ngâm dung dịch BSA nồng độ 1mg/ml sau 30 phút, sau chuyển sang sữa có bổ sung bổ sung 1000 g/L 100 µg/L Tetracycline giờ, đối chứng âm sữa không bổ sung kháng sinh Sau rửa điện cực với dung dịch PBS 1X, pH = để loại bỏ thành phần không gắn kết Điện cực giai đoạn trên, tiến hành quét điện vòng dung dịch / Feri xianua để xác định thay đổi tín hiệu điện hóa so với điện cực ban đầu Tiến hành đo tín hiệu điện hóa, kết thể bảng sau: Hình 3.19 Giản đồ vòng (1) điện cực Au, (2) điện cực Au – aptamer, (3) Auaptamer-BSA, (4) Au-aptamer-BSA-sữa, (5) Au-aptamer-BSA-sữa+100 µg/l Tetracycline, Au-aptamer-BSA-sữa+ 1000 µg/l Tetracycline 69 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảng 3.6 Tín hiệu điện hóa quét vòng điện cực Au, Au-aptamer, Au-aptmer-BSA, Au-aptamer-BSA-sữa, Au-aptamer-BSA-sữa+100µg/L Tetracycline, Au-aptamer-BSA-sữa+1000µg/L Tetracycline Điện cực Epa Epc ∆Ep Ipa - Ipc (mV) (mV) (mV) (uA) (uA) Au 308,5 185,9 122,6 25,59 24,07 Au-Ap 339,1 90,02 249,08 18,15 12,53 433 27,46 405,54 9,66 10,8 550,8 16,69 534,11 7,23 9,43 616,3 19,53 596,77 4,21 5,05 776,1 149,6 626,5 Au-Ap-BSA Au-Ap-BSA-sữa Au-Ap-BSA-sữa+100µg/L Tet Au-Ap-BSA-sữa+ 1000µg/L Tet tín hiệu điện thu n 2+ , Fe3+ n đo, nhận thấy 2,82 3,13 dần từ điện cực vàng, điện cực vàng-aptamer, điện cực vàng-aptamer-BSA, điện cực vàng-aptamerBSA- sữa, điện cực vàng-aptamer-BSA-sữa-100µg/L kháng sinh Tetracycline, điện cực vàng-aptamer-BSA- sữa- 1000µg/L kháng sinh Tetracycline, tương ứng Đ khử tăng mạnh, 2+ , Fe3+ giảm mạnh giai đoạn điện khí cực ủ với kháng sinh Điều chứng tỏ, có mặt kháng sinh, dẫn tới liên kết mạnh với aptamer, liên kết đặc hiệu làm cản trở trao đổi điện tích Fe2+/Fe3+ Nồng độ kháng sinh cao, ngăn cản trao đổi điện tích lớn 70 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã xây dựng quy trình sàng lọc aptamer ssDNA đặc hiệu kháng sinh Tetracycline lựa chọn aptamer ssDNA 18 có lực liên kết cao với kháng sinh Tetracycline - Đã tách dòng, xác định trình tự, dự đoán cấu trúc bậc phân tích cấu trúc aptamer cho thấy aptamer ssDNA 18 có chiều có chiều dài 71 nucleotid có cấu trúc bậc dạng stem-loop với lực nhiệt động thấp (ΔG = -10.06 kcal/mol), chứa vùng hoạt động: vùng gồm nucleotid 8-26, vùng gồm nucleotid 28-49 - Bước đầu kiểm tra kháng sinh sữa biosensor theo phương pháp điện hóa Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu tính đặc hiệu chọn lọc dòng aptamer ssDNA 18 với số kháng sinh khác nhóm Tetracycline Oxytetracycline, Chlortetracycline… - Tiếp tục nghiên cứu giới hạn phát kháng sinh Tetracycline sữa biosensor theo nguyên lý điện hóa - Tiếp tục tối ưu điều kiện bước gắn kết, nhằm tạo cảm biến sinh học để xác định nhanh, xác dư lượng kháng sinh sữa với chi phí thấp 71 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Thị Tho (2006) Giáo trình Dược lý học thú y Nhà xuất Hà Nội 195 trang Đinh Thiện Thuật, Nguyễn Ngọc Tuân, Võ Thị Trà An, Lê Thanh Hiển, Võ Bá Lầm, Khương Thị Ninh (2003) Bước đầu khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi dư lượng kháng sinh thịt thịt thương phẩm địa bàn tỉnh Bình Dương Tạp chí KHKT Thú y, Số (Tập X(1)), tr.50-57 Dương Văn Nhiệm (2005) Phân tích bước đầu tồn dư Tetracycline thịt lợn thị trường Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học thú y Chieng Mai University Thailand & Freie Universitot Berlin Germany Nguyễn Quốc Ân (2009) Sử dụng kháng sinh chăn nuôi thú y Việt Nam Cục thú y Nguyễn Văn Kính (2010) Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam, Nhóm nghiên cứu GARP-Việt Nam tr.34 Phạm Khắc Hiếu (2009) Giáo trình dược lý học thú y Nhà xuất Bộ giáo dục Việt Nam 293 trang Trần Quốc Việt (2007) Sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Địa chỉ: http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=2754 Trần Thị Định, Vũ Thị Thư, Jeroen Lammertyn (2010), ―Xác định số phân ly DNA Aptamer-im-munoglobuline nhờ phương pháp huỳnh quang bất đẳng hướng điện di mao quản‖ Tạp chí Dinh Dưỡng Thực phẩm/Journal of Food and Nutrition Sciences, tập 6, số 3+4 Từ Minh Koóng (2004) Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập Bộ y tế 367 trang 10 Xuân Hùng (2003) Nỗi lo dư lượng thuốc kháng sinh thực phẩm Địa chỉ:http://archive.tcvn.vn/index.php?p=show_page&cid=&parent=83&sid=96&iid =1829 Tài liệu tiếng anh 72 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 Baugh, C., D Grate, C.Wilson (2000), ―2.8 angstrom crystal structure of the malachite green Aptamer.‖, J Mol Biol 301 : 117–128 12 Beate Strehlitz, Nadia Nikolaus and Regina Stoltenburg, (2008) Protein Detection with Aptamer Biosensors Sensors 2008, 8, 4296-4307; Review 13 Berends B., Van den Bogaard F., Snijders J M (2001) Human health hazards associated with the administration of antimicrobials slaughter animals Doctor Veterimary, 23(1), pp 2-10 14 Berens, C.; Thain, A & Schroeder, R (2001) A tetracycline-binding RNA aptamer Bioorganic & Medicinal Chemistry, 9, 10, (Oct), pp.2549-2556, 09680896; 0968-0896 15 Bianchini M, Radrizzani M, Brocardo MG, Reyes GB, Gonzalez SC & Santa–Coloma TA (2001) Specific oligobodies against ERK–2 that recognize both the native and the denatured state of the protein J Immunol Methods, 252, 191– 197 16 Bienenmann-Ploum M.E., de Keizer W., van Eekelen H.D.L.M, Bergwerff A.A., Haasnoot W., Nielen M.W.F 2008 Flow cytometric immunoassay for sulfonamides in milk, blood serum,meat drip and eggs Proceedings of the EuroResidue VI: conference on residues of veterinary drugs in food Van Ginkel, L.A., Bergwerff, A.A (Eds.) May 19-21, 2008, Egmond aan Zee, the Netherlands: 425-430 17 Bolger M., Coker R D., DiNovi M., Gaylor D., Gelderblom W., OlsenM., Speijers G J A, Fumonisins (2001), ―WHO/IPCS safety evaluation of certain mycotoxins in food‖ WHO Food Additives Series, 47, pp.557-680 18 Cháfer-Pericás, C.; Maquieira, Á & Puchades, R (2010), ―Fast screening methods to detect antibiotic residues in food samples.‖, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 29, (10), pp.1038-1049, 0165-9936 19 Cheli F., Pinotti L., Campagnoli A., Fusi E., Rebucci R., Baldi A (2008), ―Mycotoxin analysis, mycotoxin-producing fungi assays and mycotoxin toxicity bioassays in food mycotoxin monitoring and surveillance‖, Italian Journal of Food Science, 20, 4, pp.447-462, 1120-1770 73 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 20 Chung HH., Lee JB., Chung YH., and Lee KG., (2009) Analysis of sulfonamide and quinolone antibiotic residues in Korean milk using microbial assays and high performance liquid chromatography Analytical Methods.113 (1):297-301 21 Ciesiolka J, Gorski J & Yarus M (1995) Selection of an RNA domain that 2+ binds Zn RNA, 1, 538–550 22 Connel S R et al (2003) Ribosomal Protection Proteins and Their Mechanism of Tetracycline Resistance Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47(12):3675-3681 23 David JH & Szostak JW (2002), ―Isolation of high – affinity GTP Aptamer from partially structured RNA libraries.‖, Proc Nalt Acad Sci USA 99, 1161611621 24 De Brabander H.F., Noppe H., Verheyden, K., et al., (2009) Review Residue analysis: Future trends from a historical perspective J Chromatogr A 1216: 7964-7976 25 Dieckmann T., E Fujikawa, X Xhao, J Szostak, J Feigon (1995), ―Structural Investigations of RNA and DNA Aptamers in Solution‖, Journal of Cellular Biochemistry : 56–56 26 Duconge F & Toulme JJ (1999) In vitro selection identifies key determinants for loop–loop interactions: RNA aptamers selective for the TAR RNA element of HIV–1 RNA, 5, 1605–1614 27 Ellington AD & Szostak JW (1992), ―Selection In vitro of single – strand DNA molecules that fold into specific ligand – binding structures.‖, Nature, 355, 850-852 28 Elvin B., Chase W.K., Barand D.S and Jinming G (2009) Multifunctional Micellar Nanomedicine for Cancer Therapy Exp Biol Med 234:123–131 29 Famulok M (1999) Oligonucleotide aptamers that recognize small molecules Curr Opin Struct Biol 9, 324–329 30 Fitter S & James R (2005) Deconvolution of a complex target using DNA aptamers J Biol Chem, 280, 34193–34201 74 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 31 Ghidini S.M., Zanardi E., Varisco G and Chizzolini R., (2002) Prevalence of Molecules of ß–lactam Antibiotics in Bovine Milk In Lombardia and Emili Romagna (Italy) Ann Fac Medi Vet di Parma, 22: 245-252 32 Ghidini, S.M., Zanardi E., Varisco G and Chizzolini R (2003) Residues of ß - lactam Antibiotics in Bovine Milk: Confirmatory Analysis by Liquid Chromatography Tends Mass Spectrometry after Microbial Assay Screening Food Addit Contam., 20: 528-534 33 Grate D., & Wilson C (1999), ―Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts.‖, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96, 11, (May 25), pp.6131-6136, 0027-8424; 0027-8424 34 Green LS, Jellinek D, Jenison R, Ostman A, Heldin CH & Janjic N (1996) Inhibitory DNA ligands to platelet–derived growth factor B–chain Biochemistry, 35, 14413–14424 35 Grieshaber D., MacKenzie R., Voros J and Reimhult E., (2008) Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures Sensors 8, 1400-1458 Review 36 Guerrier–Takada C & Altman S (1984) Catalytic activity of an RNA molecule prepared by transcription in vitro Science, 223, 285–286 37 Gustavsson E (2003) SPR Biosensor Analysis of –Lactam Antibiotics in Milk Doctoral thesis; Swedish University of Agricultural Sciences,Uppsala 2003 38 Higuchi RG & Ochman H (1989) Production of single-stranded DNA templates by exonuclease digestion following the polymerase chain reaction Nucleic Acids Res 17, 5865 2+ 39 Hofmann HP, Limmer S, Hornung V, Sprinzl M (1997) Ni –binding RNA motifs with an asymmetric purine–rich internal loop and a G–A base pair RNA, 3, 1289–1300 40 http://www.aptagen.com/home.aspx 41 Huang Z., Szostak J.W (2003), ―Evolution of Aptamers with secondarystructures from a new specificity and new an ATP Aptamer RNA-A 9,1456–1463 75 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 Huet A.C., Delahaut P., Fodey T., Haughey,S.A., Elliott C., and Weigel S., (2010) Advances in biosensor-based analysis for antimicrobial residues in foods TrAC Trends in Analytical Chemistry Volume 29, Issue 11, Pages 1281-1294 43 Jeong S., Eom T., Kim S., Lee S., Yu J (2001), ―In vitro selection of the RNA Aptamer against the Sialyl Lewis X and its inhibition of the cell adhesion Biochem.‖, Biophys Res Commun 281, 237–243 44 Jordan, K (2011) Milk and Dairy Beef Drug Residue Prevention Producer Manual of Best Management Practices 2011 Green Book Sections 45 Kaya SE, Filazi A, (2010) Determination of Antibiotic Residues in Milk Samples Kafkas Univ Vet Fak Derg 16: S31-S35, 2010 46 Khaskheli M., Malik M.A Soomro A and Arain H.H., (2008) Detection of ß - Lactam Antibiotic Residues in Market Milk Pakistan Journal of Nutrition (5): 682-685 47 Kim M., Um H J., Bang S., Lee S H., Oh S J., Han J H., Kim Y H (2009), ―Arsenic removal from vietnamxsese groundwater using the arsenicbinding DNA Aptamer.‖, Environmental Science & Technology, 43, 24, (Dec 15), pp.9335-9340, 0013-936X; 0013-936X 48 Kim, Y S.; Kim, J H.; Kim, I A.; Lee, S J.; Jurng, J & Gu, M B (2010) A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline Biosensors & Bioelectronics, 26, 4, (Dec 15), pp.1644-1649, 1873-4235; 0956-5663 49 Kim, Y., Kim, Y S., Niazi, J H., & Gu, M B (2010) Electrochemical aptasensor for tetracycline detection Bioprocess and Biosystems Engineering, 33(1), 31-37 50 Kopylov AM & Spiridonova VA (2000) Combinatorial chemistry of nucleic acids: SELEX Mol Biol 34, 940–954 51 Kusser W (2005) Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution J Biotechnol 74, 27–38 52 Kuwahara M, Hanawa K, Ohsawa K, Kitagata R, Ozaki H & Sawai H (2006) Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: 76 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ convenient preparation of DNA libraries with high–potential activities for in vitro selection Bioorg Med Chem 14, 2518–2526 53 Kyung-Mi Song, Seonghwan Lee, and Changill Ban (2012), ―Aptamer and their biological applications‖, Sensors (Basel) 2012; 12(1): 612–631 54 Liu M., T.Kagahara, H.Abe, Y.Ito (2009), ―Direct In Vitro Selection of Hemin-Binding DNA Aptamer with Peroxidase Activity‖, Bulletin of the Chemical Society of Japan 82 : 99–104 55 Long S., M Long, R White, B Sullenger (2008), ―Crystal structure of an RNA Aptamer bound to thrombin‖ RNA 14 (2): 2504–2512 56 Marco M.P., Adrian J., Ramon J., et al., (2008) New techniques in residue analysis Proceedings of the EuroResidue VI: conference on residues of veterinary drugs in food Van Ginkel, L.A., Bergwerff, A.A (Eds.), Egmond aan Zee, the Netherlands: 181-185 57 McGlinchey TA., Rafter PA., Regan F., McMahon GP, 2008 A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matries J Analytica chemica acta 624:pp.1-15 58 Min K., M Cho, S Han, Y Shim, J Ku, C Ban (2008), ―A simple and direct electrochemical detection of interferon-gamma using its RNA and DNA aptamers.‖, Biosensors & Bioelectronics 23 : 1819–1824 59 Murphy MB, Fuller ST, Richardson PM & Doyle SA (2003), ―An improved method for the in vitro evolution of Aptamers and applications in protein detection and purification.‖ Nucleic Acids Res 31, e110 60 Murphy MB, Fuller ST, Richardson PM & Doyle SA (2003) An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purification Nucleic Acids Res 31, e110 61 Niazi, J H.; Lee, S J & Gu, M B (2008) Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16, 15, (8/1), pp.7245- 7253, 0968-0896 62 Nutiu R & Li Y (2005) In vitro selection of structure–switching signaling aptamers Angew Chem Int Ed Engl 44, 1061–1065 77 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 63 O’Sullivan C.K (2002), ―Aptasensors—the future of biosensing‖ Anal Bioanal Chem 372, 44–48 64 Potty, A.; K Kourentzi, H Fang, G Jackson, X Zhang, G Legge, R Willson (2009), ―Biophysical Characterization of DNA Aptamer Interactions with Vascular Endothelial Growth Factor.‖, Biopolymers 91 : 145–156 65 Pyle AM (1993) Ribozymes: a distinct class of metalloenzymes Science, 261, 709–714 66 Regulation (EC) No 470/2009 of the european parliament and of the council of May 2009 Official Journal of the European Union 67 Rhie A, Kirby L, Sayer N, Wellesley R, Disterer P, Sylvester I, Gill A, Hope J, James W, Tahiri–Alaoui A (2003) Characterization of 2’–fluoro–RNA aptamers that bind preferentially to disease–associated conformations of prion protein and inhibit conversion J Biol Chem 278, 39697–39705 68 Samanidou VF., Tsochatzis ED., and Papadoyannis IN.,(2006), HPLC determination of cefotaxime and cephalexine residues in milk and cephalexine in veterinary formulation Microchimica Acta Vol.160 (4): 471-475 69 Savory N., K Abe, K Sode, K Ikebukuro (2010),"Selection of DNA Aptamer against prostate specific antigen using a genetic algorithm and application to sensing.", Biosensors & Bioelectronics 15 : 1386–91 70 Smith, J.E.; Medley, C.D.; ETAL., (2007) Aptamer-conjugated nanoparticles for the collection and detection of multiple cancer cells, Anal Chem., 79, 3075-3082 71 Stead S L., Ashwin H., Johnston B., Dallas A.; Kazakov S A., Tarbin J A., Keely B J (2010), ―An RNA-Aptamer-based assay for the detection and analysis of malachite green and leucomalachite green residues in fish tissue.‖ Analytical Chemistry, 82, 7, (Apr 1), pp.2652-2660, 1520-6882; 0003-2700 72 Sternesjo, A., & Gustavsson, E (2006) Biosensor analysis of beta-lactams in milk using the carboxypeptidase activity of a bacterial penicillin binding protein Journal of AOAC International, 89(3), 832-837 78 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 73 Stoltenburg R, Reinemann C & Strehlitz B (2005) FluMag–SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection Anal Bioanal Chem 383, 83– 91 74 Stoltenburg R, Reinemann C & Strehlitz B SELEX–A (r)evolutionary method to generate high–affinity nucleic acid ligands (2007) Biomolecular Engineering, 24, 381–403 75 Tohill A., McAleer D., Acheson R., Bell B., McConnell R.I., FitzGerald S.P 2008 Application of biochip array technology to multi-analyte screening of sulphonamides in different matrices Proceedings of the EuroResidue VI: conference on residues of veterinary drugs in food Van Ginkel, L.A., Bergwerff, A.A (Eds.) May 19-21, 2008, Egmond aan Zee, the Netherlands: 1379-1383 76 Tombelli S, Minunni A, Luzi E & Mascini M (2005) Aptamer–based biosensors for the detection of HIV–1 Tat protein Bioelectrochemistry, 67, 135– 141 77 Toulme JJ, Darfeuille F, Kolb GL, Chabas S & Staedel C (2003) Modulating viral gene expression by aptamers to RNA structures Biol Cell, 95, 229–238 78 Tsai RYL, Reed RR (1998), ―Identification of DNA recognition sequnces and protein intreaction domains of the multiple – Zn – finger protein Roaz.‖, Mol Cell Biol 18, 6447-6456 79 Tuerk C & Gold L (1990), ―Systematic evolution of lignads by exponential enrichment: RNA lignads to bacteriophage T4 DNA polymerase.‖, Science, 249, 505-510 80 Unusan N., (2009) Occurrence of chloramphenicol, streptomycin and tetracycline residues in ultra-heat-treatment milk marketed in Turkey International Journal of Food Sciences and Nutrition Vol 60 (5): 359-364 81 Walsh R., M DeRosa (2009), ―Retention of function in the DNA homolog of the RNA dopamine Aptamer‖, Biochemical and Biophysical Research Communications, 388 : 732–735 79 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 82 Wells J, Davis B, Wachsmuth I, Riley L, Remis RS, Sokolow R, Morris G (1983) ―Laboratory investigation of hemorrhagic colitis outbreaks associates with a rare E.coli seotype‖, J Clin Microbiol, 18: 512 83 William A M and Raida HK., (1995).Rapid Determination of Tetracycline Antibiotics in Milk and Tissues Using Ion-Pairing High-Performance Liquid Chromatography 43 (4), 931-934 84 Williams K.P., Liu X.H., Schumacher T.N., Lin H.Y., Ausiello D.A., Kim P.S., Bartel D.P (1999), ―Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of vasopressin.‖, Proc Natl Acad Sci U S A 94, 11285–11290 85 Wilson, C., Szostak, J.W (1999), ―Isolation of a fluorophore-specific DNA Aptamer with weak redox activity.‖, Chem Biol 5, 609–617 86 Xu J P., Song Z G., Fang Y., Mei J., Jia L., Qin A J., Tang B Z (2010), ―Label-free fluorescence detection of mercury(II) and glutathione based on Hg2+DNA complexes stimulating aggregation-induced emission of a tetraphenylethene derivative.‖, The Analyst, 135, 11, (Nov), pp.3002-3007, 1364-5528; 0003-2654 87 Ying Lu, Xianchan Li, limin Zhang, Ping Yu, Lei Su, and Lanqun Mao (2008), ―Aptamer – Based Electrochemical Sensors with Aptamer- Complementary DNA Oligonucleotides as probe‖, Anal.Chem :1883-1890 88 Zacco E., Adrian J., Galve R., et al., (2007) Electrochemical magneto immunosensing of antibiotic residues in milk Biosensors and Bioelectronics 22: 2184–2191 89 Zhang, J.; Zhang, B.; Wu, Y.; Jia, S.; Fan, T.; Zhang, Z & Zhang, C (2010) Fast determination of the tetracyclines in milk samples by the aptamer biosensor The Analyst, 135, 10, (Oct), pp.2706-2710, 1364-5528; 0003-2654 90 Zuker M., ―Mfold web server for nucleic acid folding, hybridization prediction‖, Nucleic Acids Res 31 (2003) 3406–3415 80 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 81 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trƣờng tăng sinh Môi trƣờng LB lỏng LB đặc Thành phần Nồng độ Bacto-tryptone 10 g/l NaCl 10 g/l Yeast extract g/l Bacto-tryptone 10 g/l NaCl 10 g/l Yeast extract g/l Agar 15g/l Phụ lục Thành phần dung dịch đệm PBS (10X) TES TBS SB TE NaCl 80,0 g/l KCl 2,0 g/l Na2HPO4.7H2O 2,2 g/l KH Tris-HCl 2PO4 pH 7,6 2.4mM g/l 10 EDTA pH 8,0 25 mM SDS 0,25% Tris-HCl pH7.5 10 mM NaCl 150 mM MgCl2 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 250 mM Tris – HCl EDTA 1M, pH = 0,5 M, pH = 82 Số hóa Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ [...]... nghiên cứu aptamer nhận biết đặc hiệu kháng sinh Lần đầu tiên, năm 2001, Berens và cộng sự đã công bố một ARN đặc hiệu kháng sinh Tetracycline có hằng số phân ly 1 μM Sau đó, đến năm 2008, Niazi và cộng sự đã sử dụng phương pháp sàng lọc cải tiến nhờ điện hóa để tạo ra hai phân tử DNA aptamer đặc hiệu với Tetracycline và Oxytetracycline Ngoài ra còn có Y S Kim và cộng sự, nhờ phương pháp điện hóa và. .. Trong khi đó, aptamer là lĩnh vực nghiên cứu mới ở Việt Nam và ban đầu đã có một số nghiên cứu, ứng dụng: Nghiên cứu tạo aptamer tái tổ hợp đặc hiệu tế bào ung thư máu dạng Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đang tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất chế tạo và sử dụng bộ kit phát hiện kháng sinh trong... Phƣơng pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu Tetracycline 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Quá trình sàng lọc một aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline được thực hiện bằng phương pháp ủ kháng sinh với ssDNA và ly tâm loại bỏ những thành phần không mong muốn Chuẩn bị cột agarose có gắn kháng sinh đặc hiệu Kháng sinh được gắn với agarose được sử dụng làm chất giá trên... kiểm tra nồng độ và sử dụng làm nguồn DNA để PCR vào vòng sàng lọc tiếp theo Cứ như vậy, sau 8 vòng sàng lọc chúng tôi thu nhận ssDNA không bám dính, tủa lại với ethanol và dùng làm khuôn thực hiện phản ứng PCR nhân bản các aptamer sau các vòng chọn lọc Để theo dõi quá trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với kháng sinh Tetracycline trong suốt quá trình sàng lọc, thư viện đưa vào và sản phẩm thu... 1.1.9 Sự tồn dƣ kháng sinh Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi: - Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc - Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh - Kháng sinh cho vào nước uống để chữa... bản chất là aptamer RNA kháng VEGF – 165 và các đồng vị chủ yếu của VEGF – 165 Từ đó, đã có nhiều thuốc dựa trên các nghiên cứu về aptamer được sử dụng trong điều trị bệnh như: AS1411, aptamer DNA liên kết đặc hiệu với necleolin, dùng cho bệnh bạch cầu ASRC1779, aptamer DNA liên kết đặc hiệu với willebrand, dùng cho hội chứng nghẽn động mạch vành cấp tính NU172, DNA aptamer liên kết đặc hiệu Thrombin,... nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường Phân của vật nuôi được nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn có kháng sinh không chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hoá hấp thu mà còn chứa rất nhiều loài vi sinh vật, trong đó có nhiều loài vi khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại kháng sinh, chính chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường Với kháng sinh Tetracycline, ... (sử dụng aptamer) Nghiên cứu tổng hợp các aptamer ức chế protease HIV của Đại học Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng đang tiến hành các nghiên cứu ứng dụng aptamer và vật liệu nano trong phát hiện tồn dư của thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản, các ion kim loại nặng trong sản phẩm nông nghiệp và môi trường Và các nghiên cứu để phát hiện các loại virus gây bệnh trên động và thực... Những cải biến này đã được ứng dụng cho quá trình chọn lọc aptamer như sử dụng cho các thí nghiệm chọn lọc in vitro sàng lọc aptamer gắn với phân tử đích dạng anion [11] Quá trình sàng lọc, thư viện được ủ với những phân tử đích trong đệm, nhiệt độ phù hợp Sau đó, sử dụng các kỹ thuật khác nhau để tách các phức hợp aptamer – đích ra khỏi những phân tử không gắn đặc hiệu Sử dụng màng nitrocellulose là... tiêu cực về kinh tế của mỗi quốc gia Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy: ở bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ E.coli kháng kháng sinh tăng từ 18% năm 2005 lên 42% năm 2008: cho thấy mức độ kháng kháng sinh Tetracycline 88,6%, ciprofloxacine 82,3% [5] Ngoài ra, sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi còn là mối đe dọa cho môi trường Kháng sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng ... xuất đề tài nghiên cứu Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline định hƣớng ứng dụng Mục tiêu đề tài:  Xây dựng quy trình sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline. .. QUẢ SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU KHÁNG SINH TETRACYCLINE Quy trình SELEX sàng lọc aptamer liên kết đặc hiệu kháng sinh Tetracycline điển hình gồm ba trình: - Chọn lọc trình tự oligonucleotit (aptamer) ... QUAN VỀ KHÁNG SINH TETRACYCLINE 1.1.1 Kháng sinh Tetracycline Tetracycline kháng sinh thuộc hệ cũ tìm từ năm 1948, loại thuốc tốt Trong trình sử dụng dù tỷ lệ kháng lại nhiều kháng sinh công hiệu