Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp và thu nhận erythritol bằng nấm men moniliellasp

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG SINH HỌC NGHỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp thu nhận erythritol nấm menMoniliella sp Người hướng dẫn : PGS Vũ Nguyên Thành Sinh viên : Đỗ Thanh Huyền Khóa : K19 – Lớp 1203 - CNSH Hà Nội - 2016 Style Definition: TOC 2: Indent: Left: 0", Tab stops: 6.1", Right,Leader: … Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học LỜI CAM ĐOAN Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small gap, Auto, pt Line width), Tab stops: 2.53", Left Formatted: Right: 0.79" Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu Khóa luận Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" trung thực Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực Khóa luận cảm ơn thông tin trích dẫn Khóa luận ghi rõ nguồn gốc Formatted: Indent: Left: 0" Hà Nội, tháng năm 2016 Formatted: Centered, Indent: Left: 3.5" Sinh viên Formatted: Indent: Left: 0" Đỗ Thanh Huyền Formatted: Centered, Indent: Left: 3.5" Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 i Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small gap, Auto, pt Line width), Tab stops: 2.53", Left LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Formatted: Indent: Left: 0" PGS.Vũ Nguyên Thành, ThS Vũ Kim Thoa, thầy cô tận tình bảo hướng dẫn giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu, thực khóa luận Tôi xin trân trọng cảm ơn tới anh, chị bạn sinh viên làm việc Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm nhiệt tình giúp đỡ suốt trình thực khóa luận Trung tâm Qua xin trân trọng cảm ơn tới thầy, cô Viện Đại học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy, cô Khoa Công nghệ Sinh học nhiệt tình giảng dạy, dìu dắt suốt trình học tập trường Cuối cùng, vô biết ơn gia đình, bạn bè khích lệ động viên suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Hà Nội, tháng năm 2016 Formatted: Indent: Left: 0" Sinh viên Đỗ Thanh Huyền Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 ii Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small gap, Auto, pt Line width), Tab stops: 2.53", Left MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iiiiii Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 14 pt, No underline, Font color: Auto, Do not check spelling or grammar Formatted: Indent: Left: 0" MỤC LỤC iiiiiiiii DANH MỤC CÁC BẢNG viviv DANH MỤC CÁC HÌNH viiviv MỞ ĐẦU 111 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 333 1.1 ERYTHRITOL 333 1.1.1 Cấu trúc đường erythritol 333 Formatted: Tab stops: Not at 6.79" 1.1.2 Tính chất đường erythritol 444 1.1.3 Ứng dụng erythritol công nghiệp 555 1.1.3.1 Đồ uống 666 Formatted: Indent: Left: 0", Tab stops: 6.1", Right,Leader: … + Not at 6.79" 1.1.3.2 Kẹo cao su 777 1.1.3.3 Chocolate 878 1.1.3.4 Kẹo mềm 989 1.1.3.5 Kẹo Fondant 999 1.1.3.6 Viên ngậm 10910 1.1.3.7 Sản phẩm bánh 111011 1.1.3.8 Bánh mì 111011 1.1.4.Tình hình sản xuất erythritol Việt Nam giới 121112 1.2 CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA GLUCOSE SANG ERYTHRITOL 141314 Formatted: Tab stops: Not at 6.79" Formatted: Indent: Left: 0" 1.3.NẤM MEN MONILIELLA 171717 1.3.1 Giới thiệu chung nấm men Moniliella 171717 Formatted: Tab stops: Not at 6.79" 1.3.2 Tình hình sử dụng nấm men Moniliella để sản xuất đường erythritol191919 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 212121 2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 212121 Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 iii Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học 2.1.1 Chủng vi sinh vật: 98 chủng nấm men thuộc chiMoniliellatrong sưu tập giống Trung tâm Vi sinh vật, Viện Công nghiệp Thực phẩm 212121 Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small gap, Auto, pt Line width), Tab stops: 2.53", Left Formatted: Tab stops: Not at 6.79" 2.1.2.Hóa chất thiết bị 212121 2.1.3.Thành phần môi trường 212121 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 232323 Formatted: Indent: Left: 0" 2.2.1 Phương pháp vi sinh 232323 Formatted: Tab stops: Not at 6.79" 2.2.1.1 Hoạt hóa giữ giống 232323 Formatted: Indent: Left: 0", Tab stops: 6.1", Right,Leader: … + Not at 6.79" 2.2.1.2 Phương pháp lên men sinh tổng hợp erythritol 232323 2.2.2 Phương pháp sắc kí trao đổi ion 242424 Formatted: Tab stops: Not at 6.79" 2.2.3 Phương pháp thu nhận tinh erythritol 242424 2.2.3.1 Phương pháp lọc than hoạt tính 242424 2.2.3.2 Phương pháp kết tinh thu nhận erythritol 252525 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 262626 Formatted: Indent: Left: 0", Tab stops: 6.1", Right,Leader: … + Not at 6.79" Formatted: Tab stops: 6.1", Right,Leader: … + Not at 6.79" Formatted: Indent: Left: 0" 3.1 KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN MONILIELLA sp.A.sp CÓ KHẢ NĂNG SINH ERYTHRITOL CAO 262626 3.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG NẤM MEN M MEGACHILIENSIS TBY 3406.6 303030 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ERYTHRITOL 313031 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian lên men 313131 Formatted: Tab stops: Not at 6.79" 3.3.2 Ảnh hưởng hàm lượng oxy 323232 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 343434 3.3.4 Ảnh hưởng pH 353535 3.4 THU NHẬN ERYTHRITOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TINH 373737 3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến khả hấp phụ 373737 Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Tab stops: Not at 6.79" 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường tới trình kết tinh 383838 3.4.3.Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến trình kết tinh 393939 PHẦN V KẾT LUẬN 414141 Formatted: Indent: Left: 0" TÀI LIỆU THAM KHẢO 424242 Formatted: Tab stops: 6.1", Right,Leader: … Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 iv Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small gap, Auto, pt Line width), Tab stops: 2.53", Left Formatted: Font: Bold, No underline, Font color: Auto Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 v Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học DANH MỤC CÁC BẢNG Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small gap, Auto, pt Line width), Tab stops: 2.53", Left Formatted: Font: Bold, No underline Formatted: Normal Bảng 1.1 Đặc điểm số loại đường Formatted: Indent: Left: 0" Bảng3.1 Hàm lượng polyol dịch lên men loài M.megachiliensis Bảng 3.2 So sánh hàm lượng erythritol dịch lên men Bảng 3.3.Kết hàm lượng polyol mốc nhiệt độ sau 10 ngày nuôi (g/l) Bảng 3.4 Kết hàm lượng polyol mốc pH sau 10 ngày nuôi (g/l) Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ chất hấp phụ Bảng 3.6.Ảnh hưởng nồng độ đường tới trình kết tinh Bảng 3.7 Kết ảnh hưởng thời gian đến trình kết tinh Formatted: Right: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 vi Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small gap, Auto, pt Line width), Tab stops: 2.53", Left DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Hình ảnh đường erythritol Formatted: Indent: Left: 0" Hình1.2 Con đường pentose-phosphate Hình1.3 Transketolase transaldolase Hình 2.1 Sắc ký đồ dung dịch glucose 1%, erythritol 1%, glycerol 1% Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch lên men chủng M.megachiliensis TBY 3406.6 Hình 3.2 Sắc ký đồ dịch lên men chủng M.megachiliensis TBY 2127.1, TBY 3438.2, TBY 3439 Hình 3.3.Khuẩn lạc tế bào chủng TBY 3406.6 malt-glucose 4°Bx sau ngày nuôi cấy Hình 3.4 Hàm lượng polyol dịch lên men theo thời gian Hình 3.5.Ảnh hưởng nồng độ oxy Hình 3.6.Ảnh hưởng nhiệt độ Hình 3.7 Ảnh hưởng pH Hình 3.8.Sắc ký đồ dịch lên men sinh tổng hợp erythritol sau 10 ngày Hình 3.9 Hình ảnh đường erythritol kết tinh nồng độ khác khoảng thời gian 18 Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 vii MỞ ĐẦU Trong 20 năm qua, người nghiên cứu, lựa chọn sử dụng thực Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" phẩm chức để hỗ trợ cho sức khỏe tốt sống đại Trên đà phát triển thực phẩm chức năng, đường chức đời Đường chức đường thấp lượng,có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe chống sâu răng, có khả kích thích hoạt động hệ tiêu hóa… Với ưu trên, đường chức trở thành thực phẩm thiếu cho người chế độ ăn kiêng.Để đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày cao người, ngày nhiều loại đường chức sản xuất nhiều phương pháp khác với độ tinh khiết cao panatinoza, fructooligosaccarit,xyloolisaccarit,galactooligosaccarit, sorbitol,mannitol, xylitol, erythritol…Trong đó,đường erythritol nhiều nhà nghiên cứu ý sản xuất phương pháp lên men từ vi sinh vật, sản phẩm có hương vị thơm ngon đường kính sacaroza, lại có nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho thể người, đặc biệt thấp lượng đườngkhác Một số chủng nấm có khả sinh erythritol nấm men Moniliella, Pichia, Candida, Trigonopsis, Auriobasidium, Psedozyma, Trichosporon Yarrowia.Trong Moniliella nhóm đối tượng đặc biệt quan tâm hiệu suất chuyển hóa đường để tạo erythritol tương đối cao Nấm men Moniliellađược phát vào khoảng đầu kỷ 20, nhóm nấm men có sắc tố đen thuộcBasidiomycota, có khả lên men đường, tổng hợp polyol đặc biệt erythritol glycerol, nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm có lợi sử dụng quy mô công nghiệp khả chịu áp suất thẩm thấu cao, trình lên men đơn giản Tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,Viện Công nghiệp Thực phẩm tiến hành phân lập tuyển chọn định tên chủng nấm men Moniliella.sp có khả sinh chuyển hóa Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 glucose thành erythritol Nhằm mục đích tìm điều kiện tối ưu để sản xuất erythritol, từ tinh chế đường erythritol để tạo erythritol tinh Chúng tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp thu nhận erythritol nấm men Moniliellasp.” Nội dung thực hiện: Formatted: Indent: Left: 0" - Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp erythritol cao - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp erythritol chủng tuyển chọn - Tìm điều kiện thích hợp thu nhận erythritol từ dịch lên men Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 GLUCOSE (G/L) ERYTHRITOL (G/L) GLYCEROL (G/L) M megachileiensis TBY 3440 65.78 59.79 7.37 Formatted: Tab stops: Not at 3.25" + 6.5" M megachileiensis TBY 3467 85.10 52.92 7.98 Formatted: Indent: Left: 0", Tab stops: Not at 3.25" + 6.5" M megachileiensis TBY 3469 56.34 53.12 10.61 Formatted: Tab stops: Not at 3.25" + 6.5" M megachileiensis TBY 3475 70.31 59.87 8.16 M megachileiensis TBY 3476 72.28 60.64 8.06 CHỦNG VI SINH VẬT M megachiliensis TBY 325 25.63 31.71 23.68 M megachiliensis TBY 4798.1 88.98 48.91 8.61 M megachiliensis TBY 4799.2 87.03 51.40 6.82 M megachiliensis TBY 4807.1 91.83 48.27 7.79 M megachiliensis TBY 4807.2 90.86 48.38 7.86 M megachiliensis TBY 4807.3 94.35 49.02 7.51 Formatted Table Hình 3.1: Sắc ký đồ dịch lên men chủng M.megachiliensis TBY 3406.6 Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 28 Hình 3.2: Sắc ký đồ dịch lên men chủng M.megachiliensis TBY 2127.1, TBY 3438.2, TBY 3439 Formatted: Indent: Left: 0" So sánh hàm lượng erythritol tạo thành canh trường chủngvi Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" sinh vật nghiên cứu với kết công bố trước đây, thấy, chủng thuộc loài Moniliella megachiliensis có khả chuyển hóa glucose thành erythritol không nhỏ, đặc biệt chủng M.megachiliensis TBY 3404.6, TBY 2127.1, TBY 3439… Bảng 3.2: So sánh hàm lượng erythritol dịch lên men CHỦNG VI SINH VẬT ERYTHRITOL (G/L) Formatted: Indent: Left: 0" TÁC GIẢ Formatted: Centered Formatted Table Trichosporonoides megachiliensis CBS 190.92 105 Moniliella tomentosa var pollinis 53 Saburo Chida et al(2000) Robert Edlauer et al(2012) Trichosporonoides variabilis 46 Kim et al(1997) Moniliella sp 440 116 Trichosporonoides madida DS 911 Moniliella megachiliensis TBY 3406.6 Moniliella megachiliensis TBY 3438.2 Moniliella megachiliensis TBY 2127.1 141 Lin et al(2002) Jin Byung Park et al(2000) Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered Moniliella megachiliensis TBY 3439 Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered 75.65 Nghiên cứu 62.62 Nghiên cứu 62.64 Nghiên cứu Formatted: Centered 61.39 Nghiên cứu Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Centered So với kết công bố, hàm lượng khả chuyển hóa tích lũy erythritol chủng nghiên cứu tương đối cao Các chủng Formatted: Centered Formatted: Centered Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" vi sinh vật ứng dụng để sản xuất công nghiệp hầu hết chủng tái tổ hợp tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp erythritol (nhiệt độ, Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 29 pH, oxy…) Nghiên cứu khảo sát sơ khả sinh tổng hợp erythritol canh trường, hoàn toàn chủng tự nhiên chưa tối ưu hóa Do vậy, với hàm lượng erythritol 60 – 75 g/l, M.megachiliensis loài có nhiều tiềm cho nghiên cứu Từ kết trên, nhóm nghiên cứu chọn chủng M.megachiliensis TBY 3406.6 (hàm lượng erythritol sinh tổng hợp 75.65 g/l để tiến hành nghiên cứu 3.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG NẤM MEN M.MEGACHILIENSIS TBY 3406.6 Moniliella megachiliensis TBY 3406.6 chủng phân lập từ hoa Formatted: Indent: Left: 0", Space Before: pt Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" ngũ sắc Bãi Lữ, Nghệ An Chủng có khả chuyển hóa glucose thành erythritol Chủngnghiên cứu nuôi cấy môi trường thạch (malt-glucose o Bx) tủ ấm 28oC, môi trường lỏng (glucose 20%, cao nấm men 1%, ure 0.1%), lắc 150rpm, nhiệt độ nuôi cấy 28oC.Sau ngày quan sát khuẩn lạc tế bào vi sinh vật Hình 3.3.Khuẩn lạc tế bào chủng Moniliella megachiliensisTBY 3406.6 trênmaltglucose 4°Bx sau ngày nuôi cấy Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Left: 1.38" Trên môi trường thạch, khuẩn lạc nấm men có đường kính 2-3 mm, màu Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" vàng, nhăn, xù, lồi nhỏ, khuẩn lạc mềm Quan sát kính hiển vi, tế bào nấm men có dạng hình cầu elip, có nảy chồi Trong môi trường lỏng, dịch lên men sau ngày có màu trắng đục đồng Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 30 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ERYTHRITOL Từ kết sàng lọc chủng nấm men Moniliella.spcó khả sinh Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" tổng hợp erythritol, tiếp tục tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sinh tổng hợp erythritol chủng nấm menM.megachiliensis TBY 3406.6.Bên cạnh việc lựa chọn sử dụng loại chủng giống vi sinh vật có khả chuyển hóa đường thành erythritol có hiệu suất cao việc lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp biện pháp hữu hiệu để nâng cao sản lượng sản phẩm sản xuất quy mô công nghiệp Trong thực tế chủng vi sinh vật chịu ảnh hướng lớn yếu tố bên nhiệt độ nuôi cấy, độ pH môi trường, thành phần canh trường Những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng phát triển sinh khối vi sinh vật, đồng thời ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chất nội bào, ngoại bào khả chuyển hóa chất trình sinh trưởng Erythritol sản phẩm tổng hợp chuyển hóa pha sinh trưởng Sự sinh trưởng chủng vi sinh vật phụ thuộc trực tiếp vào trình điều kiện nuôi cấy Do vậy, thí nghiệm tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình lên men sinh tổng hợp erythritol: nhiệt độ, pH, thời gian lên men, hàm lượng oxy 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian lên men Đối với loại vi sinh vật khác thời gian nuôi cấy có ảnh Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" hưởng khác đến đường tăng sinh trưởng chúng Với loại vi sinh vật thu nhận sinh khối chất tiết ngoại bào canh trường việc khảo sát thời gian lên men quan trọng việc thu nhận sản phẩm cụ thể Các chủng nấm men sau hoạt hóa, cấy vào môi trườngdinh dưỡng gồm 20% Glucose, 1% cao nấm men, 0.1% ure cho lên men điều kiện nhiệt độ 28oC, 150rpm Sau ngày lấy dịch lên men phân tích hàm Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 31 Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) lượng polyol phương pháp sắc ký.Theo thời gian, hàm lượng glucose chuyển hóa thành erythritol tăng dần, 12 ngày đầu, hàm lượng erythritol dịch lên men đạt 60 g/l, hàm lượng glucose lại 69 g/l Khi thời gian lên men kéo dài, glucose chuyển hóa hết thành erythritol Sau 19 ngày, lượng glucose lại 2g/l 180 160 140 Hàm lượng polyol (g/l) 120 100 Glucose 80 Erythritol 60 Glycerol 40 20 0 12 16 20 24 Thời gian (ngày) 28 Hình 3.4: Hàm lượng polyol dịch lên men theo thời gian Formatted: Indent: Left: 0" Thời gian lên men dài, hiệu suất chuyển hóa erythritol cao Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" Tuy vậy, để tăng hiệu suất chuyển hóa, cần có nghiên cứu tương quan yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp erythritol, từ lựa chọn phương án lên men phù hợp Formatted: Indent: Left: 0" 3.3.2.Ảnh hưởng hàm lượng oxy Hoạt hóa chủng vi sinh vật nghiên cứu môi trường malt-glucose Formatted: Left, Indent: Left: 0", First line: 0.39" 4°Bx, lên men sinh tổng hợp erythritol môi trường GYU20 với thể tích 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ml Sau 15 ngày, dịch lên men ly tâm phân tích hàm lượng polyol.Kết phân tích máy sắc ký Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 32 HPLCAgilient Technologies 1260 infinity.Kết thể hình 3.5 Hàm lượng polyol (g/l) 140 120 100 80 Glucose 60 Erythritol 40 Glycerol 20 100200300400 500 600500700600700 V (ml) Hình 3.5.Ảnh hưởng nồng độ oxy (g/l) Formatted: Indent: Left: 0" Từ đồ thị thấy, hàm lượng oxy có ảnh hưởng lớn đến khả Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" sinh tỏng hợp erythritol chủng nghiên cứu.Với tốc độ lắc, thể tích dịch lên men nhỏ, khả sinh tổng hợp erythritol cao.Khi thể tích dịch nuôi/thể tích bình 1/10(thể tích dịch nuôi chiếm 10% dung tích bình lên men), erythritol sinh tổng hợp cao (127.1g/l), cao gấp 2.5 lần so với tỷ lệ 3/10 (thể tích dịch nuôi chiếm 30% dung tích bình) gấp 5.7 lần so với tỷ lệ 7/10 (thể tích dịch nuôi chiếm 70% dung tích bình) Như vậy, trình sinh tổng hợp erythritol cần cung cấp lượng oxy tương đối lớn để đảm bảo hàm lượng erythritol đạt cao Kết phù hợp với nghiên cứu công bố trước Khi lên men sinh tổng hợp erythritol nấm men Moniliella, yếu tố quan trọng cần sục khí với nồng độ khí dịch lên men tương đối cao lên tới 1-1,5 vvm (tương đương với tốc độ 400 – 700rpm)(Lin et al,2002; Hajny et al, 1964) Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 33 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Chủng nấm men M.megachiliensis TBY 3406.6 nuôi môi Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" trường chứa glucose 20%, cao nấm men 1% urea 1%, nuôi mốc nhiệt độ 28°C, 30°C, 32°C, 34°C, tốc độ lắc 150rpm Sau 10 ngày, dịch lên men ly tâm xác định hàm lượng polyol Kết thể bảng 3.3 Bảng 3.3.Kết hàm lượng polyol mốc nhiệt độ sau 10 ngày nuôi (g/l) Nhiệt độ Glucose Erythritol Glycerol 28°C 68.09 92.21 7.52 30°C 28.87 84.84 11.79 32°C 7.00 84.60 11.47 34°C 7.03 111.87 13.83 Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Bảng 3.3 cho thấy, dải nhiệt độ 28-32°C, hàm lượng erythritol sinh Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" tổng hợp thay đổi không đáng kể, dao động khoảng 84 – 92 g/l Điều dễ hiểu dải nhiệt độ phù hợp với sinh trưởng nấm men Khi tăng nhiệt độ lên 34°C,hàm lượng erythritol tăng đáng kể (tăng 26g/l so với mứctrung bình dải nhiệt độ 28-32°C 86.6g/l) Hàm lượng erythritol sinh tổng hợp nhiệt độ 111.87 g/l Hàm lượng polyol (g/l) 120 100 80 Glucose 60 Erythritol 40 Glycerol 20 Nhiệt độ (°C) 28 30 3234 Formatted: Indent: Left: 0" Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 34 Dải nhiệt độ 28-32°C nhiệt độ phù hợp cho loài nấm men phát Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" triển.Tuy nhiên, nghiên cứu này, nhiệt độ thích hợp cho trình sinh tổng hợp erythritol chủng M.megachiliensisTBY 3406.6 34°C.Điều dễ lý giải hầu hết chủng thuộc loài M.megachiliensis có khả sinh tổng hợp erythritol cao phân lập từ loài hoa vùng Nghệ An (hoa ngũ sắc, hoa vừng, hoa mủ biển), nơi có khí hậu nóng Ở nhiệt độ này, nấm men M.megachiliensis phát triển tốt, trình bày trên, erythritol sản phẩm tổng hợp chuyển hóa pha sinh trưởng nấm men Khi nấm men sinh trưởng, phát triển tốt, khả chuyển hóa cao, lượng erythritol tích lũy nhiều 3.3.4 Ảnh hưởng pH Giá trị pH môi trường ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" khả sinh tổng hợp erythritol chủng nghiên cứu Chủng nghiên cứu sau hoạt hóa chuyển sang môi trường lên men bổ sung với cácpH 4-7 Điều chỉnh pH môi trường nuôi ban đầu dung dịch đệm: đệm citrate natri 0.1 M (4-6), đệm phosphate 0.1 M(6-7) ngày bổ sung0.5 ml dung dịch đệm Kết ảnh hưởng pH thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết hàm lượng polyol mốc pH sau 10 ngày nuôi (g/l) pH Glucose Erythritol Glycerol 4.0 55.64 59.42 2.70 5.0 32.87 55.00 2.73 Formatted: Indent: Left: 0", Line spacing: single Formatted: Indent: First line: 0", Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted Table Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single 6.0 (citrate) 61.24 34.82 3.64 6.0 (phosphate) 4.37 92.25 3.48 7.0 2.33 58.21 2.93 Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Indent: First line: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 35 100 90 80 70 60 50 Glucose 40 Erythritol 30 Glycerol 20 10 6-Ci 6-P pH Hình 3.7 Ảnh hưởng pH Formatted: Indent: Left: 0" Từ đồ thị nhận thấy, dải pH 4-6 hàm lượng erythritol cao Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" mức pH (đạt 59.42g/l) Tuy nhiên, pha môi trưng đệm phosphate pH6.0, hàm lượng erythritol đạt cao (92.25 g/l) cao gần gấp lần so với pH giá trị dung dịch đệm citratre Điều dẫn đến giả thiết, muối phosphate có ảnh hưởng lớn đến khả sinh tổng hợp erythritol TBY 3406.6 Sau nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khảnăng sinh tổng hợp erythritol chủng TBY 3406.6, tiến hành lên men sinh tổng hợp erythritol dựa điều kiện khảo sát (nhiệt độ lên men 34°C, pH6.0 đệm phosphate, thể tích dịch lên men chiếm 10% dung tích bình lên men, thời gian lên men 10 ngày).Kết thúc trình lên men, dịch lên men đem ly tâm nhiệt độ 10°C, tốc độ 8000 rpm 10 phút.Phân tích hàm lượng polyol dịch lên men phương pháp sắc ký Kết quả, hàm lượng erythritol dịch lên men 10 ngày đạt 138.38g/l, tăng gần gấp lần so với chưa khảo sát Đây kết tương đối khả quan so với nghiên cứu công bố Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 36 Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch lên men sinh tổng hợp erythritol sau 10 ngày Formatted: Indent: Left: 0" 3.4 THU NHẬN ERYTHRITOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TINH 3.4.1.Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến khả hấp phụ Dịch sau lên men làm bất hoạt vi sinh vật nhiệt độ 70oC 15 phút Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" tiến hành ly tâm 8000 rpm, 10 phút Thu dịch sau ly tâm cho lọc qua than hoạt tính để loại bỏ màu số tạp chất hữu với lượng than hoạt tính từ – 5% Hỗn hợp giữ nhiệt độ 45°C vòng 30 phút.Chỉ tiêu đánh giá giá trị OD bước sóng 500 nm cảm quan, kết biểu diễn bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ chất hấp phụ Formatted: Indent: Left: 0" TT Nồng độ than (%) OD500 Đánh giá cảm quan (đối chứng) 0,118 Màu vàng dịch đục, có mùi lạ Formatted Table 0.092 Màu vàng, dịch đục có mùi Formatted: Space After: pt, Line spacing: single 0.078 Màu vàng dịch trong, mùi lạ Formatted: Space After: pt, Line spacing: single 0,061 Màu sáng trong,thơm Formatted: Space After: pt, Line spacing: single 0,065 Màu sáng trong, thơm, Formatted: Space After: pt, Line spacing: single 0,067 Màu sáng thơm mùi lạ Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Space After: pt, Line spacing: single Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 37 Từ bảng kết quả, hàm lượng than hoạt tính sau xử lý bổ sung 1-2%, dịch sau lọc chưa đạt yêu cầu màu mùi Khi tăng hàm lượng than lên 3, 4, 5%, hiệu xử lý mùi màu tương đối tốt Dịch đường sau xử lý suốt, mùi thơm nhẹ Giá trị OD đo bước sóng 500nm hàm lượng than 3-5% tương đương nhau, vậy, lựa chọn hàm lượng than bổ sung 3% 3.4.2.Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường tới trình kết tinh Nghiên cứu trình kết tinh bước quan trọng Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" nghiên cứu thu hồi, sản xuất đường erythritol Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến trình kết tinh đường erythritol, yếu tố nồng độ dịch đường để đạt tới điều kiện kết tinh đường Formatted: Indent: First line: 0" Hình 3.9 Hình ảnh đường erythritol kết tinh nồng độ khác khoảng thời gian 18 Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0" Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường dịch lên men lên Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" trình kết tinh khảo sát với nồng độ khác điều kiện nhiệt độ, thời gian nồng độ mầm tinh thể bổ sung vào, sau so sánh trình kết tinh xảy (hình 3.9) Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 38 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nồng độ đường tới trình kết tinh Nồng độ(%) Erythritol Hiệu suất(%) 30 - 40 5,19 32,42 50 10,97 54,84 Formatted: Indent: Left: 0" Formatted Table 60 16,76 72,24 Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0" Từ bảng kết ta thấy nồng độ đường dịch mức 30% Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" tinh thể đường erythirtol tượng kết tinh bổ sung mầm tinh thể, tinh thể bổ sung quan sát thấy không tăng mặt kích thước Kết giống với kết nghiên cứu nồng đồ kết tinh đường Oxana Tyapkova (2012) Ở nồng độ cao hơn, tượng kết tinh xảy với tốc độ tuyến tính tùy thuộc vào nồng độ dịch đường, nồng độ cao kết tinh xảy nhanh tinh thể có kích thước lớn Nhưng nồng độ 60% có hiệu suất kết tinh cao lại xuất hiện tượng dịch đường tự hình thành tinh thể chưa tiến hành bổ sung mầm tinh thể, khó để kiểm soát yếu tố ảnh hưởng cho thí nghiệm sau Sau tiến hành thí nghiệm so sánh kết quả, lựa chọn nồng độ 50% nồng độ để tiến hành thí nghiệm sau hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu đề tượng tự kết tinh 3.4.3.Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến trình kết tinh Trong trình kết tinh thời gian yếu tố Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" quan trọng, tìm thời gian tối ưu trình kết tinh tiết kiệm thời gian, lượng thiết bị sử dụng trình kết tinh Hơn nữa, đưa vào sản xuất lớn tối ưu thời gian thuận tiện cho sản xuất, giảm tải chi phí đầu tư sản xuất, tiết kiệm lượng tiêu thụ Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 39 Vì yếu tố thời gian ảnh hưởng lớn đến trình kết tinh nên tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình kết tinh Thí nghiệm tiến hành với dịch đường 50% thống số tối ưu thí nghiệm trước, trình kết tinh diễn mức thời gian khác Kết so sánh bảng 3.7 STT Bảng 3.7: Kết ảnh hưởng thời gian đến trình kết tinh Erythritol (g) Thời gian Hiệu suất (giờ) (%) TN TN TB 6,99 6,96 6,98 34,9 7,21 7,18 7,19 35,95 12 7,58 7,54 7,56 37,8 14 8,91 8,87 8,89 44,45 16 10,17 10,13 10,15 50,75 20 10,80 10,75 10,78 53,9 24 10,84 10,79 10,82 54,2 Formatted: Indent: Left: 0" Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên trình kết tinh cho Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" thấy từ -12 giờ, hiệu suất kết tinh đường không thay đổi nhiều thời gian mầm tinh thể tập trung chưa tạo thành cấu trúc bền vững, tinh thể chưa hình thành hết Từ 14-20 khoảng thời gian tinh thể phát triển mạnh mẽ,hiệu suất kết tinh tăng rõ rệt từ 37.82% đến 53.94% Sau 20 quan sát tinh thể tượng tăng mặt kích thước, hiệu suất thay đổi nhiều Kết khớp với nghiên cứu thời gian kết tinh nhà khoa học Oxana Tyapkova(2012).Vì vậy, từ 16-20 khoảng thời gian tốt để kết tinh thu tinh thể erythirtol, để thuận lợi cho thí nghiệm sau chọnthời gian tối ưu để kết tinh 18 giờ, thời gian hiệu suất đường kết tinh cao, thuận tiện cho việc tiến hành thí nghiệm Formatted: Indent: First line: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 40 PHẦN V KẾT LUẬN Formatted: Indent: Left: 0" Sau trình nghiên cứu thu kết sau: 1.Đã tiến hành đánh giá 98 chủng nấm men Moniliellatheo khả chuyển hóa glucose thành erythritol chọn chủng M megachiliensis TBY 3406.6 có khả tạo 75.65g/l erythritol canh trường Đã xác định điều kiện sinh tổng hợp erythritol M megachiliensis TBY 3406.6, cụ thể là: thời gian lên men 10 ngày; thể tích dịch lên men chiếm 10% dung tích bình lên men; nhiệt độ lên men 34oC; pH 6.0 (đệm phosphate); Hàm lượng erythritol tối đa đạt 138.38g/l Đã xác định điều kiện thu nhận erythritol từ dịch lên men, cụ thể là: lượng than hoạt tính bổ sung g/l; nồng độ kết tinh 50%; thời gian kết tinh 18h Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Dooms L, Hennebert G.L, Verachtert H (1971), Polyol synthesis and Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0" taxonomic characters in the genus Moniliella, Antoni van Leeuwenhoek, 37, pp 107-118 Haij F (2009), “ Erythritol-a health choice for bakery product ”, Formatted: Justified, Indent: Left: 0", First line: 0" Wellness Foods European Laxman S S., Ramchandra V G., Bhalchandra K V., Narayanan K (2011), “Strainimprovement and statistical media optimization for enhanced erythritol production with minimal by-products from Canida magnoliae mutant R23”, Biochemical EngineeringJournal, Vol55 Lee D H., Lee Y J., Ryu Y W., Seo J H (2010), “Molecular cloning and biochemical characterization of a novel erythrose reductase from Canida magnoliae JH110”, MicrobialCell Factories S J Lin, C Y Wen, CC Huang Chu-US (2005), Mcroorganism for use in the generation of erythritol, Erythritol-producing Moniliella strains Y Kobayashi, H Iwata, D Mizushima, J Ogihara and T Kasumi (2015) Erythritol production by Moniliella megachiliensis using nonrefined glycerol wasteas carbon source, Letters in Applied Microbiology ISSN 02668254 http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.549.408&rep =rep1&type=pdf Formatted: Indent: Left: 0" Formatted: Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, pt Line width) Đỗ Thanh Huyền Lớp 1203 K19 42 [...]... sp nov,M spathulata, M suaveolens, Moniliellasp1 Các chủng giống được trẻ hóa và lên men sinh tổng hợp erythritol trong môi Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0" trường GYU20 (glucose, cao nấm men và ure) Sau 8 ngày, dịch lên men được ly tâm và phân tích hàm lượng các polyol bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion.Kết quả phân tích cho thấy, trong dịch lên men chứa glucose, erythritol và glycerol... giống, môi trường lên men sinh tổng hợp erythritol 2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Formatted: Indent: Left: 0", Space Before: 0 pt 2.2.1.Phương pháp vi sinh Formatted: Indent: Left: 0" 2.2.1.1 Hoạt hóa và giữ giống Hoạt hóa: Các chủng giống nấm men do Trung tâm Vi sinh vật,Viện Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" Công nghệ Thực phẩm cung cấp Từ đó lấy 1ít nấm men cần hoạt hóa và cấy ria lên đĩa... khi sinh trưởng chậm lại năng lực sinh tổng hợp cũng giảm theo, đồng thời NADPH cũng như các phosphate đường C5 và C4 cần ít hơn khiến cho tỉ lệ giữa hai con đường bây giờ trở thành 10:1 thậm chí 20:1 1.3.NẤM MEN MONILIELLA 1.3.1 Giới thiệu chung về nấm men Moniliella Con người biết đến nấm men đen vào khoảng cuối thế kỉ 19 là một nhóm phân loại không đồng nhất, thành tế bào có melanine và sinh sản bằng. .. các chủng nghiên cứu đều có khả năng chuyển hóa đường glucose thành erythritol nhưng hiệu suất chuyển hóa rất khác nhau giữa các loài.Loài có khả năng chuyển hóa glucose thành erythritol cao nhất làM.megachiliensis Trong số 39 chủng nấm men đen thu c loàiM.megachiliensis khảo sát, có 21 chủng có khả năng sinh tổng hợp erythritol với hàm lượng > 50 g/l Hai loài có hàm lượng erythritol sinh tổng hợp được... M.acetoabutans và M.spathulatla Không chỉ khác nhau về khả năng sinh tổng hợp erythritol từ glucose Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" giữa các loài khác nhau, trong cùng một loài, có chủng có khả năng sinh tổng hợp erythritol tương đối cao nhưng có chủng lại rất thấp Chủng nấm menM.megachiliensis TBY 3406.6 có khả năng chuyển hóa glucose thành erythritol cao nhất trong số 98 chủng nghiên cứu đạt... năng sinh polyol, đặc biệt là erythritol của các chủng thu thập được 1.3.2 Tình hình sử dụng nấm men Moniliella để sản xuất đường erythritol Hiện nay erythritol đang được sản xuất thương mại ở quy mô công nghiệp sử dụng các chủng Moniliella.Công nghệ sản xuất erythritol sử dụng nấm men Moniliella ở các khía cạnh khác nhau được bảo vệ bằng một loạt các sáng chế bởi các công ty hóa chất và viện nghiên cứu. .. lại sự tăng đường huyết và sự phá vỡ mạch máu (Den Hartog et al,2009) Nhiều nghiên cứu cấp tính, mãn tính đã được tiến hành trên chuột và chó Nghiên cứu đặcbiệt bao gồm các nghiên cứu cho ăn dài hạn được tiến hành để xác định chất gây ung thưtiềm ẩn, nghiên cứu gây quái thai, bệnh tĩnh mạch qua đường uống để xác định nguy cơ cho các hiệu ứng trên các bào thai, các nghiên cứu bằng con đường ăn uống qua... thế hệ để xác định nguy cơ cho các hiệu ứng sinh sản, và các nghiên cứu trong hệ thống vikhuẩn và động vật có vú để xác định tiềm nănggây đột biến.Tất cả các nghiên cứu an toàn trên erythritol đã chứng minh rằng nó được hấp thu tốt và ngay cả khi tiêm vào tĩnh mạcherythritolcũng khôngsản xuất bất kỳ toxicologicgâytác dụng phụ.Dựa trên cơ sở an toàntrênchothấy erythritol khôngcó bất kì nguycơ gây ung thư,gây... tâm Vi sinh vật, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã có một số nghiên cứu về tuyển chọn những chủng Moniliella phân lập tại Việt Nam có khả năng chuyển hóa glucose thành erythritol Kết quả cho thấy, hầu hết các chủng đều có khả năng sinh erythritol, chỉ một vài chủng không có Hai chủng sinh erythritolcao nhất là TBY 348 thu c loài M carnis với tỷ lệ phần trăm erythritol chiếm21,9% và chủng TBY 202.2 thu c... lên men bằng vi sinh vật để sản xuất erythritol từ glucose bằng việc sử dụng Moniliella (Torula) sp với tỷ lệ chuyển đổi của glucose thành erythritol tương đối cao Các nghiên cứu về sàng lọc và đột biến được sử dụng để xác định các chủng cải tiến của Moniliella có thể sản xuất erythritol từ glucose với một tỷ lệ chuyển đổi ít nhất là khoảng 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% hoặc cao hơn trong điều kiện