Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận poly γ glutamic axit và hướng ứng dụng trong thực phẩm

MỞ ĐẦU Khoa học công nghệ trên thế giới nói chung hay ở Việt Nam nói riêng ngày càng đƣợc quan tâm khai thác ứng dụng vào cuộc sống. Nhờ tiến bộ khoa học công nghệ, các sản phẩm thực phẩm có thể giữ đƣợc lâu hơn và chất lƣợng chế biến tốt hơn. Tuy nhiên, trong sản xuất thực phẩm, do chạy theo lợi ích, một số nhà sản xuất đã sử dụng những nguyên liệu và phụ liệu chế biến không phù hợp với tiêu chuẩn đã đặt ra, làm cho vấn đề đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm càng trở nên báo động hơn bao giờ hết. Để góp phần giải quyết vấn đề này, việc nghiên cứu tạo ra phụ gia thực phẩm mới thay thế những hóa chất độc hại đang đƣợc sử dụng tràn lan trên thị trƣờng là nhiệm vụ cấp thiết đối với các nhà khoa học. Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer sinh học đƣợc tạo thành từ các phần tử axit glutamic. Với ƣu thế là một polymer có khả năng phân hủy, không độc với con ngƣời và tự nhiên nên γ-PGA đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, thí dụ: Trong công nghiệp môi trƣờng γ-PGA đƣợc sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học [5, 59, 82, 83, 88, 95, 126]. Trong y dƣợc γ-PGA đƣợc dùng nhƣ các chất mang, chất giữ ẩm... Trong sản xuất thực phẩm γPGA đƣợc sử dụng nhƣ một dạng phụ gia ổn định chất lƣợng sản phẩm, chất chống kết tinh, chất ổn định… Axit poly γ-glutamic đƣợc sản xuất bằng cách trùng hợp các axit glutamic, thông qua con đƣờng tổng hợp hóa học [1, 2], hay theo con đƣờng lên men sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic. Các chủng vi sinh vật này thƣờng đƣợc tuyển chọn trong các sản phẩm lên men truyền thống nhƣ Natto (Nhật Bản), Thua-nao (Thái Lan), Chungkookjang (Hàn Quốc), Tƣơng (Việt Nam)…[8, 53, 100]. Ở Việt Nam những nghiên cứu về γ-PGA cho đến nay chỉ đƣợc triển khai trên quy mô phòng thí nghiệm, ở mức độ phân lập và tuyển chọn chủng giống. Một số nghiên cứu sản xuất γ-PGA trên quy mô công nghiệp phục vụ nông nghiệp đƣợc thực hiện bởi các công ty của Đài Loan và Nhật Bản với chủng giống độc quyền của họ Bacillus là vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm nƣớc ngoài mà có thể phân lập đƣợc từ các sản phẩm thực phẩm truyền thống của Việt Nam nhƣ Tƣơng Bần, Tƣơng Nam Đàn, Nƣớc Mắm, Chao…[3]. Thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng ta cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ƣu việt của vi khuẩn Bacillus trong sinh tổng hợp γ-PGA và ứng dụng của chúng trong chế biến các sản phẩm thực phẩm. Hơn nữa việc tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hƣớng mới, tiến bộ bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống. Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc lạm dụng các phụ gia có nguồn gốc hóa học đang diễn biến rất phức tạp, với việc nhiều loại hóa chất công nghiệp đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm. Các nhà quản lý và nhà nghiên cứu đang dần trở nên thụ động đối với mỗi loại sản phẩm có chứa các phụ gia lạ. Từ góc độ nghiên cứu cho thấy cần phải nghiên cứu ra những loại phụ gia thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an toàn, đƣợc các tổ chức trong nƣớc và quốc tế công nhận. Để đáp ứng một phần nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ-glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi khuẩn Bacillus, để tạo ra sản phẩm lên men an toàn cho chế biến thực phẩm ngày nay. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:  Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ-glutamic từ vi sinh vật.  Ứng dụng chế phẩm axit poly γ-glutamic trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm  Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp γPGA từ các sản phẩm thực phẩm.  Khảo sát và tối ƣu các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic.  Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm và cấu trúc của axit poly γ-glutamic.  Bƣớc đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ-glutamic vào một số sản phẩm thực phẩm. Những đóng góp mới của đề tài: Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu nhận axit poly γ-glutamic từ vi khuẩn Bacillus subtilis B5 ( phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ƣu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc, đặc tính của γ-PGA). Bƣớc đầu thử nghiệm ứng dụng có hiệu quả γ-PGA trong quá trình chế biến để ổn định trạng thái, màu sắc và hƣơng vị của nƣớc cam và thử nghiệm ứng dụng để cải thiện độ giòn, dai và màu sắc trong sản xuất giò.

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình vẽ và đồ thị x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic 3

1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam 4

1.2.1 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới 4

1.2.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam 7

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA 8

1.4 Tính chất γ-PGA 11

1.5 Phân loại γ-PGA 12

1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 13

1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 15

1.7.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng 15

1.7.2 Ảnh hưởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men 21

1.7.3 Phương pháp lên men γ-PGA 23

1.8 Xác định và đánh giá chất lượng và γ-PGA 24

1.8.1 Định tính và định lượng γ-PGA 24

1.8.2 Thu nhận và tinh sạch γ-PGA 25

1.8.3 Đánh giá cấu trúc và khối lượng phân tử của γ-PGA 30

1.8.4 Xác định khối lượng phân tử γ-PGA 31

1.9 Ứng dụng γ-PGA 32

1.9.1 Trong lĩnh vực môi trường 32

1.9.2 Trong lĩnh vực y dược 33

1.9.3 Trong lĩnh vực nông nghiệp 33

1.9.4 Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm 34

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 40

2.1 VẬT LIỆU 40

2.1.1 Nguồn phân lập 40

2.1.2 Hóa chất 40

2.1.3 Môi trường nuôi cấy: 40

2.1.4 Dụng cụ và thiết bị 41

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.2.1 Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử 41

2.2.2 Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp γ-PGA 42

2.2.3 Phương pháp toán học - tối ưu điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực nghiệm 43

2.2.4 Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh 46

2.2.5 Phương pháp đánh giá cảm quan 49

2.2.6 Nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γ-PGA đến chất lượng giò lụa 49

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Poly γ-glutamic

51

3.2 Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA 55

3.2.1 Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng kit API 50CHB

55

3.2.2 Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử: 60

3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 61

3.3.1 Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA 61

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 62

3.3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 63

3.3.4 Ảnh hưởng của pH 64

3.3.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp γ-PGA 65

3.3.6 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 66

3.3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 67

3.3.8 Ảnh hưởng của nồng độ natri-glutamat 68

3.4 Tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ-PGA 69

3.5 Nghiên cứu động học của quá trình lên men 75

3.6 Nghiên cứu các yếu tố ngoại cảnh đến sinh tổng hợp γ-PGA của chủng B5 ở quy mô 100 lít/mẻ 77

3.6.1 Ảnh hưởng của chế độ khuấy và sục khí 77

3.6.2 Sự thay đổi của hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men 78

3.7 Tinh sạch γ-PGA 79

3.7.1 Tinh sạch dựa trên tiêu chí hàm lượng protein và carbonhydrat 79

3.7.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau khi tinh sạch 80

3.7.3 Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 81

3.7.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh sạch, cấu trúc γ-PGA qua kính hiển vi điện tử quét 83

3.7.5 Xác định cấu trúc và độ sạch của γ-PGA thông qua phổ FT-IR và phổ H NMR 84

3.8 Nghiên cứu một số đặc tính của γ-PGA 86

3.8.1 Xác định khối lượng phân tử 86

3.8.2 Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γ-PGA 89

3.8.3 Nghiên cứu tính bền axit của γ-PGA 89

3.8.4 Nghiên cứu tính bền nhiệt của γ-PGA 90

3.9 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ-PGA 91

3.9.1 Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ-PGA 91

3.9.2 Đánh giá mức độ an toàn của γ-PGA trong việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm 92

3.10 Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong ổn định nước cam 94

3.10.1 Khảo sát chất lượng nguyên liệu 94

3.10.2 So sánh ảnh hưởng của γ-PGA đến độ ổn định của nước cam với các phụ gia khác 95

3.10.3 Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nước cam 100

3.10.4 Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng cảm quan của nước cam

101

3.11 Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong cải thiện chất lượng giò 102

3.11.1 Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt xay 103

3.11.2 Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến chất lượng của giò 104

3.11.3 Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lượng của giò 107

KẾT LUẬN 109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111

PHỤ LỤC 121

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

MEGA6 Phần mêm phân tích trình tự gen, phân loài

NCBI Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ

Danh mục các bảng

Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn trên thế giới 6

Bảng 1.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic 13

Bảng 1.3 Thành phần môi trường cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 15

Bảng 2.1 Khoảng biến đổi của các yếu tố 44

Bảng 2.2 Bảng bố trí thí nghiệm tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ-PGA 45 Bảng 3.1 Sự phát triển, tạo màng nhày của các trực khuẩn gram dương trên môi trường đặc hiệu 51

Bảng 3.2 Độ nhớt của canh trường nuôi cấy của các chủng tuyển chọn 53

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn trên môi trường LB 55

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn 56

Bảng 3.5 Kết quả sinh tổng hợp enzym ngoại bảo của các chủng vi khuẩn 58

Bảng 3.6 Kết quả sử dụng carbon của vi khuẩn B5 và T1 bằng Kit API 50 CHB 59

Bảng 3.7 Kết quả thực nghiệm theo ma trận quy hoạch thực nghiệm 70

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình 71

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy và sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) 77

Bảng 3.10: Hàm lượng protein và carbonhydrat còn lại sau khi tinh sạch γ-PGA 80

Bảng 3.11 Các tiêu chí đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm γ-PGA 81

Bảng 3.12 Kết quả chạy sắc ký lọc gel (GPC) mẫu γ-PGA từ chủng B subtilis B5 88

Bảng 3.13 Tỷ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học axit glutamic 89

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của axit đến tính chất của sản phẩm γ-PGA 90

Bảng 3.15 Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA 92

Bảng 3.16 Bảng phân tích chỉ tiêu hóa lý, hóa sinh của γ-PGA sử dụng làm phụ gia thực phẩm 93

Bảng 3.17 Một số chỉ tiêu hóa học của cam sành Hà Giang 94

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch quả đến chất lượng cảm quan của nước cam 94

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của các phụ gia ổn định đến sự biến đổi độ nhớt của nước cam 96

Bảng 3.20 Sự biến đổi màu sắc sản phẩm sau thời gian bảo quản 97

Bảng 3.21 Chất lượng cảm quan của nước cam ép đục ở các tỷ lệ bổ sung γ-PGA 100

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng màu sắc và mùi vị của nước cam 102

Bảng PL1 Bảng thành phần các môi trường lên men sinh tổng hợp γ-PGA 122

Bảng PL2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh γ-PGA 122

Bảng PL3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh γ-PGA 123

Bảng PL4 Hệ số trọng lượng đánh giá cảm quan 127

Bảng PL5 Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nước cam 127

Bảng PL6 Thang điểm đánh giá chất lượng sản phẩm nước cam 128

Bảng PL7 Thang điểm đánh giá thị hiếu sản phẩm 129

Bảng PL8 Hệ số trọng lượng đánh giá cảm quan sản phẩm giò lụa 129

Bảng PL9 Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm giò 129

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử γ-PGA 3

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp γ-PGA 9

Hình 1.3 Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP 10

Hình 1.4 Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Ho và các cộng sự 27

Hình 1.5 Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Seong và các cộng sự 28

Hình 1.6 Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Goto và Kunioka 29

Hình 1.7 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE xác định khối lượng phân tử γ-PGA 31

Hình 1.8 Quy trình thử nghiệm chế phẩm γ-PGA trên sản phẩm giò lụa 37

Hình 3.1 Ảnh chụp tạo màng của các chủng vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường đặc hiệu 52

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng dịch nhớt canh trường sau khi thủy phân 54

Hình 3.3 Khả năng sinh γ-PGA của các chủng tuyển chọn 54

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái tế bào của chủng B5 và T1 dưới kính hiển vi quang học 56

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của vi khuẩn 57

Hình 3.6 Cây phát sinh chủng (B5) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 60

Hình 3.7 Cây phát sinh chủng (T1) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 60

Hình 3.8 Ảnh hưởng của các tiền chất đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 61

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 62

Hình 3.10 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 63

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 64

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự hình thành γ-PGA 66

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ-PGA 67

Hình 3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA 68

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ Natriglutamat đến sự tổng hợp γ-PGA 69

Hình 3.16 Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi thời gian và nhiệt độ thay đổi 73

Hình 3.17 Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi nhiệt độ và tiền chất thay đổi 74

Hình 3.18 Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và nhiệt độ thay đổi 74

Hình 3.19 Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và thời gian thay đổi 75

Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn động học quá trình tổng hợp γ-PGA 76

Hình 3.21 Sự biến đổi của hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men 78

Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC mẫu γ-PGA thủy phân thành glutamic 82

Hình 3.23 Sắc ký đồ axit L-Glutamic sử dụng trong sinh tổng hợp γ-PGA 82

Hình 3.24 Ảnh chụp cấu trúc γ-PGA bằng kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 100.000 lần 83

Hình 3.25 Phổ FT-IR của γ-PGA tinh sạch thu được bởi chủng B subtilis B5 84

Hình 3.26 Phổ FT-IR của γ-PGA chuẩn của hãng Merck 85

Hình 3.27 Phổ H NMR của γ-PGA tinh sạch thu được bởi chủng B subtilis B5 85

Hình 3.28 Phổ HNMR mẫu γ-PGA chuẩn của hãng Merck 86

Hình 3.29 Điện di SDS PAGE xác định khối lượng phân tử của γ-PGA 87

Hình 3.30 Sắc ký đồ mẫu γ-PGA tạo thành bởi chủng B subtilis B5 bằng sắc ký lọc gel 88

Hình 3.31 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi độ nhớt của dịch γ-PGA 91

Hình 3.32 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia thường dùng khác trong việc ổn định cho nước cam 95

Hình 3.33 Nước cam đóng chai sau 6 tháng bảo quản 98

Hình 3.34 Biểu đồ ảnh hưởng của các phụ gia ổn định đến chất lượng cảm quan của nước cam 99

Hình 3.35 Biểu đồ đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nước cam ép đục ở các tỷ lệ bổ sung γ-PGA 100

Hình 3.36 Biểu đồ ảnh hưởng của phụ gia tạo cấu trúc đến chất lượng khối thịt xay 103

Hình 3.37 Biểu đồ lực nén và lực cắt của giò thành phẩm 104

Hình 3.38 Biểu đồ đánh giá cường lực gel của các mẫu sản phẩm giò 105

Hình 3.39 Biểu đồ điểm đánh giá cảm quan các mẫu giò sử dụng phụ gia 106

Hình 3.40 Cường lực gel của các mẫu giò sử dụng γ-PGA 107

Hình PL1 Ảnh khuẩn lạc trên môi trường LB, môi trường E và ảnh chụp qua kính hiển vi nhuộm bào tử, nhuộm gram của vi khuẩn Bacillus subtilis B5 121

Hình PL2 Đường chuẩn xác định hàm lượng γ-PGA 123

Hình PL3 Ảnh các peak khi giải trình tự 2 chiều 124

Hình PL4 Đường chuẩn đánh giá hàm lượng carbonhydrat 126

Hình PL5 Bảng phối màu từ ba màu cơ bản 126

MỞ ĐẦU

Khoa học công nghệ trên thế giới nói chung hay ở Việt Nam nói riêng ngày càng được quan tâm khai thác ứng dụng vào cuộc sống Nhờ tiến bộ khoa học công nghệ, các sản phẩm thực phẩm có thể giữ được lâu hơn và chất lượng chế biến tốt hơn Tuy nhiên, trong sản xuất thực phẩm, do chạy theo lợi ích, một số nhà sản xuất đã sử dụng những nguyên liệu và phụ liệu chế biến không phù hợp với tiêu chuẩn đã đặt ra, làm cho vấn đề đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm càng trở nên báo động hơn bao giờ hết Để góp phần giải quyết vấn đề này, việc nghiên cứu tạo ra phụ gia thực phẩm mới thay thế những hóa chất độc hại đang được sử dụng tràn lan trên thị trường là nhiệm vụ cấp thiết đối với các nhà khoa học

Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer sinh học được tạo thành từ các phần tử axit glutamic Với ưu thế là một polymer có khả năng phân hủy, không độc với con người và tự nhiên nên γ-PGA đang được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, thí dụ: Trong công nghiệp môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học [5, 59, 82, 83, 88, 95, 126] Trong

y dược PGA được dùng như các chất mang, chất giữ ẩm Trong sản xuất thực phẩm PGA được sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh, chất ổn định… Axit poly γ-glutamic được sản xuất bằng cách trùng hợp các axit glutamic, thông qua con đường tổng hợp hóa học [1, 2], hay theo con đường lên men sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic Các chủng vi sinh vật này thường được tuyển chọn trong các sản phẩm lên men truyền thống như Natto (Nhật Bản), Thua-nao (Thái Lan), Chungkookjang (Hàn Quốc), Tương (Việt Nam)…[8,

γ-53, 100]

Ở Việt Nam những nghiên cứu về γ-PGA cho đến nay chỉ được triển khai trên quy mô phòng thí nghiệm, ở mức độ phân lập và tuyển chọn chủng giống Một số nghiên cứu sản xuất γ-PGA trên quy mô công nghiệp phục vụ nông nghiệp được thực hiện bởi các công ty

của Đài Loan và Nhật Bản với chủng giống độc quyền của họ Bacillus là vi khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ được tìm thấy trong các sản phẩm nước ngoài mà có thể phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm truyền thống của Việt Nam như Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm, Chao…[3]

Thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng

ta cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ưu việt của vi khuẩn Bacillus trong sinh

tổng hợp γ-PGA và ứng dụng của chúng trong chế biến các sản phẩm thực phẩm Hơn nữa việc tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hướng mới, tiến bộ bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hưởng đến môi trường sống Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc lạm dụng các phụ gia có nguồn gốc hóa học đang diễn biến rất phức tạp, với việc nhiều loại hóa chất công nghiệp được sử dụng trong chế biến thực phẩm Các nhà quản lý và nhà nghiên cứu đang dần trở nên thụ động đối với mỗi loại sản phẩm có chứa các phụ gia lạ Từ góc độ nghiên cứu cho thấy cần phải nghiên cứu ra những loại phụ gia thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an toàn, được các tổ chức trong nước và quốc tế công nhận Để đáp ứng một phần nhu cầu đó

đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ-glutamic và hướng ứng dụng trong thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi khuẩn Bacillus,

để tạo ra sản phẩm lên men an toàn cho chế biến thực phẩm ngày nay

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

 Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ-glutamic từ vi sinh vật

 Ứng dụng chế phẩm axit poly γ-glutamic trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm

Nội dung nghiên cứu gồm

 Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp PGA từ các sản phẩm thực phẩm

γ- Khảo sát và tối ưu các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic

 Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm và cấu trúc của axit poly γ-glutamic

 Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ-glutamic vào một số sản phẩm thực phẩm

Những đóng góp mới của đề tài:

Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu nhận axit poly γ-glutamic

từ vi khuẩn Bacillus subtilis B5 ( phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ưu hóa

các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc, đặc tính của γ-PGA)

Bước đầu thử nghiệm ứng dụng có hiệu quả γ-PGA trong quá trình chế biến để ổn định trạng thái, màu sắc và hương vị của nước cam và thử nghiệm ứng dụng để cải thiện độ giòn, dai và màu sắc trong sản xuất giò

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic

Axit poly gamma glutamic (γ-PGA) là một polymer tự nhiên, mang điện tích âm có các đơn phân là axit L-glutamic hay axit D-glutamic hoặc chứa cả hai đơn phân trên liên kết với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm γ-carboxyl và nhóm α-amino [50, 95] Khả năng tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 của nhóm α-COOH và γ-COOH theo thứ tự giảm dần theo mạch Thông thường, α-NH2 liên kết với α-COOH tạo nên liên kết α-peptid (hình 1.1), tạo ra sản phẩm là α-PGA thông qua các phản ứng hóa học bằng cách trùng hợp nucleophile Nhưng khi có được một hệ xúc tác thích hợp, nhóm α-NH2 sẽ liên kết với nhóm γ-COOH để tạo nên liên kết γ-peptid, như mô tả trong hình 1.1 Sự hình thành γ-PGA khác với sự hình thành của protein, vì glutamate được polymer hóa bên trong tế bào thông qua các mối liên kết γ-amide, tổng hợp một cách độc lập với ribosome Do vậy, các chất ức chế của protein, chẳng hạn như chloramphenicol không có ảnh hưởng đến việc tổng hợp γ-PGA[4] Nhờ quá trình polymer hóa, γ-PGA có thể được hình thành từ hơn 10.000 phân tử axit glutamic Tùy theo môi trường và phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, γ-PGA có thể được hình thành với 3 loại khác nhau, trong đó một loại được tạo thành từ toàn

bộ D-γ-PGA, một loại được tạo thành nhờ toàn bộ L-γ-PGA và một loại được tạo thành nhờ polymer hóa hỗn hợp DL-γ-PGA Sự khác biệt này có được khi vi khuẩn có khả năng chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp axit L-glutamic thành axit D-glutamic và hai dạng này

sẽ đồng trùng hợp tạo ra DL-γ-PGA gọi chung là γ-PGA [95]

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử γ-PGA [4]

Một vài nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn đã được tiến hành thông qua việc đo độ nhớt, đo phổ hấp thụ hồng ngoại Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong phần nhầy của Natto có 58% γ-PGA và 40% polysaccharide, pH khoảng 5 – 8,8 và phần nhầy này sẽ thay đổi tỷ lệ γ-PGA và polysaccharide khi pH môi trường thay đổi [42, 85, 92, 130] Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ polymer tới cấu trúc cho thấy γ-PGA có cấu trúc xoắn khi ở nồng

độ thấp và có dạng  khi nồng độ cao (thể hiện ở 2 dải quang phổ 1635 và 1588 cm-1) [58, 84] Khi nồng độ polymer tăng, có sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa các phân tử, sự ảnh hưởng này lớn hơn rất nhiều so với ảnh hưởng nội phân tử Như vậy có thể thấy polymer ngoại bào được sản xuất từ vi khuẩn tồn tại nhiều cấu hình khác nhau, phụ thuộc vào điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nồng độ polymer và nồng độ ion những nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới xu hướng hình thành các nhóm chức năng trong polymer Cấu trúc thay đổi

sẽ ảnh hưởng đến tính chất vật lý (gắn, kết dính) kim loại, theo đó sẽ thay đổi môi trường

và độc tính của kim loại mà γ-PGA có thể gắn kết [50]

1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới

Các sản phẩm có nguồn gốc sinh học, các polymer sinh học, các vật liệu sinh học đang dần thay thế các polymer dầu mỏ, các sản phẩm có nguồn gốc dầu mỏ và khoáng sản đang dần cạn kiệt Trong số các sản phẩm sinh học có những đặc tính nói trên phải kể đến axit poly γ-glutamic (γ-PGA), một sản phẩm được tổng hợp từ axit glutamic, được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật với các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như ngô, khoai, sắn hay từ sinh khối thực vật Hiện tại trên thế giới một số công ty đã sản xuất γ-PGA như Wako Pure Chemical Industries, Vedan Enterprise Corp (Đài Loan), Alamanda Polymers (Canada)… Năm 1913, axit poly γ-glutamic chỉ được biết đến trong hỗn hợp với fructan, ở lớp màng nhầy của Natto – sản phẩm đậu tương lên men của người Nhật Bản [91]

Năm 1937, axit poly γ-glutamic được tìm thấy lần đầu tiên bởi Ivanovíc và các cộng sự khi

họ nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthrasis một loại vi khuẩn gây

nên bệnh than rất nguy hiểm cho các động vật ăn cỏ, động vật có vú và con người [54]

Năm 1942, Bovarnick đã chứng minh rằng γ-PGA là một sản phẩm tiết trực tiếp vào canh trường nuôi cấy giống như một sản phẩm lên men ngoại bào thông thường [27]

Năm 1962, House và các cộng sự phân tách được một hệ enzym tổng hợp PGA cũng từ

chủng Bacillus licheniformis 9945A Tuy nhiên, hệ enzym này xúc tác tạo ra một loại

γ-PGA chứa 60% là axit L-glutamic [51]

Năm 1973, Troy đã tìm ra một phức hợp các enzym poly-glutamyl synthetase ở màng nhầy

bao quanh vi khuẩn B licheniformis 9945A xúc tác cho hàng loạt phản ứng trên màng,

trong đó axit L- glutamic được hoạt hóa, đồng phân hóa và polymer hóa thành cấu trúc rất giống PDGA như là một sản phẩm tiết vào canh trường dạng hòa tan Hệ enzym xúc tác

cho các phản ứng này đòi hỏi phải sự có mặt của ion Mg2+ và không thể thay thế bằng các ion kim loại hóa trị hai khác [113]

Năm 1982, trong một số nghiên cứu đã công bố việc phân lập được một số enzym ngoại

bào từ Bacillus natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển hóa amin đặc biệt là cho

glutamine Các đơn phân này được chuyển hóa thành đơn phân còn lại, sau đó chúng sẽ liên kết với nhau nhờ các liên kết γ-peptid và tồn tại ở dạng đồng hình chỉ chứa một loại đơn phân Kết quả là có hàng loạt enzym phải tham gia vào quá trình tổng hợp này [48, 112]

Các nghiên cứu sâu hơn về γ-PGA đã được tiến hành vào năm 1995, từ đó sản phẩm này trở thành một polymer nhận được nhiều sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà khoa học trong những năm gần đây Phương pháp đơn giản để phát hiện, tinh sạch, xác định γ-PGA đã được Kanno và cộng sự đưa ra và rất hữu ích trong nghiên cứu di truyền và sinh hóa Phương pháp này sử dụng Cetyltrimethylammonium bromide là chất tạo độ đục cho dung dịch chứa γ-PGA rồi đo OD ở 400 nm có thế xác định được hàm lượng γ-PGA [7]

Năm 2006, Masaaki và các cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu về sự hình thành màng

sinh học từ chủng B subtilis ATCC 14593 và chỉ ra rằng γ-PGA là thành phần chính của

màng sinh học Nghiên cứu này đã mở ra một hướng ứng dụng mới đầy tiềm năng cho PGA trong tương lai đặc biệt là việc lựa chọn phương thức lên men nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa tạo γ-PGA của chủng vi khuẩn [79, 82]

γ-Theo số liệu thống kê trong bảng 1.1 để thu γ-PGA thời gian lên men trung bình từ 3 đến 4 ngày (72-96h) và hàm lượng γ-PGA sinh tổng hợp đạt được từ 20-35 g/l [95, 96]

Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn trên thế giới [17, 34, 45, 46, 84, 85,

87, 93, 95, 96, 128]

gian lên men Năng suất Trích nguồn

và được quan tâm sâu hơn Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong công nghệ thức phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự nhiên được tổng hợp từ quá trình sinh học của vi sinh vật đang là đích đến của các nhà nghiên cứu Các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật tổng hợp được phân tách ra làm các sản phẩm với các mục đích khác nhau So với các hợp chất được tổng hợp bằng phương

pháp hóa học, chúng có những ưu điểm vượt trội như an toàn cho sức khỏe con người, thân thiện với môi trường[95]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam

Ở nước ta việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không cao như các nước phát triển khác Song việc khai thác ứng dụng các quá trình sinh học trong công nghệ thực phẩm đã được hình thành từ lâu trong đời sống xã hội Những sản phẩm truyền thống như nước mắm, tương Bần, tương Nam đàn, tôm chua Huế, Chao… là những nguồn tài nguyên

vi sinh vật tiềm năng cho phát triển công nghệ sinh học hiện đại đặc biệt là các hợp chất polymer sinh học

Nghiên cứu về axit poly γ-glutamic ở Việt Nam còn rất hạn chế, chủ yếu là hợp tác nghiên cứu các phần có liên quan đến γ-PGA Sản phẩm γ-PGA chỉ thấy xuất hiện tại Việt Nam ở các dạng mỹ phẩm gia dụng, màng sinh học và hầu hết các sản phẩm γ-PGA này đều có nguồn gốc nước ngoài: từ Nhật bản, Hàn Quốc, Mỹ, Đức… Các công trình nghiên cứu về γ-PGA tại Việt Nam cho đến nay mới chủ yếu đạt được ở mức tổng quan, mô tả về quy trình, mô tả về ứng dụng thực tiễn trong một số tài liệu giảng dạy Việc đi sâu nghiên cứu

về cơ chế quá trình sinh tổng hợp γ-PGA và khai thác ứng dụng sản phẩm này hầu như là chưa có Hiện tại cũng có một số nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam tại nước ngoài có liên quan đến γ-PGA như nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa enzym γ-PGA

synthetase từ B subtilis của Viện nghiên cứu thực phẩm Quốc gia Nhật bản và Viện Công

nghệ Sinh học [40, 66-68] Nhìn một cách tổng thể việc nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam

còn rất ít và chỉ liên quan đến vi khuẩn Bacillus và các ứng dụng của vi khuẩn này trong

công nghệ sinh học hay công nghệ thực phẩm Hiện tại ở Việt Nam tập đoàn Vedan đã sử

dụng vi khuẩn B subtilis var natto và axit L-Glutamic qua cơ chế chuyển hóa sinh hóa

Salvage Bioconversion Pathway để tạo thành sản phẩm γ-PGA Tuy nhiên công nghệ này chỉ được sử dụng trong khuôn khổ của tập đoàn Vedan nên mọi thông tin công nghệ hay chủng giống đều được bảo mật và sản phẩm tạo thành γ-PGA của Vedan là sản phẩm dạng nước sử dụng cho mục đích làm thức ăn chăn nuôi và phân bón nông nghiệp [114]

Năm 2013 đề tài nghiên cứu “Phân lập vi khuẩn có năng lực sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống Boza” của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên được thực hiện nhằm mục đích phân lập được chủng vi khuẩn có năng lực sinh tổng hợp γ-PGA và ứng dụng các sản phẩm này trong lĩnh vực nông nghiệp

Tóm lại, từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho

thấy cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ưu việt của vi khuẩn Bacillus cũng

như các sản phẩm do vi khuẩn này tạo ra

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ con đường trao đổi chất và các enzym

có liên quan đến quá trình polymer hóa tạo γ-PGA nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa của vi khuẩn bằng việc tác động vào các enzym trong quá trình tạo γ-PGA Đã có nhiều nghiên

cứu công bố cho thấy sự tham gia của enzym transglutaminase của B subtilis NR-1 là yếu

tố chính xúc tác sinh tổng hợp γ-PGA, và cơ chế đồng phân hóa L-glutamic sang glutamic nhờ enzym alanine recemase Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phản ứng kéo dài chuỗi γ- peptid được xúc tác bởi hệ enzym: glutamate dehydronase, glutamine synthetase,

D-pyruvic acid aminotransferase, PGA synthetase [45, 92, 95] Tuy nhiên, B anthracis và B subtilis không có sự chuyển hóa này mà vẫn tạo ra γ-PGA Điều đó chứng tỏ đây không

phải là cơ chế tạo ra γ-PGA mà thực tế chỉ là một bước trong cả một quy trình chuyển hóa tạo γ-PGA [19, 45]

Các nghiên cứu đã chỉ ra chủng B licheniformis 9945A có hệ enzym tổng hợp γ-PGA dạng

tự do là glutamyl transamidase Hệ enzym này xúc tác cho việc tạo ra một loại γ-PGA chứa 60% axit L-glutamic và trong quá trình tổng hợp này đòi hỏi phải có sự tham gia của Mn2+với vai trò co-factor [53, 64, 65, 67, 125]

Axit glutamic là những đơn phân trong cấu trúc của axit poly γ-glutamic nhờ ba nhóm liên kết hóa học α-NH2, α-COOH, γ-COOH Phản ứng hóa học của ba nhóm này được sắp xếp theo thứ tự α-NH2>α-COOH >γ-COOH Trong phản ứng hóa học xúc tác polymer hóa của axit glutamic, quá trình trùng hợp sẽ xảy ra đầu tiên giữa các nhóm α-NH2 và α-COOH hình thành nên liên kết α-peptid và kết quả của quá trình này sẽ là axit poly α-glutamic Nhưng đối với một quá trình sinh tổng hợp, phần lớn axit L- glutamic được xúc tác và chuyển hóa thành axit D – glutamic, khi đó cả D – glutamic và L – Glutamic cùng được polymer hóa và hình thành liên kết giữa nhóm α-NH2 và nhóm γ-COOH với kết quả tạo nên sản phẩm cuối là D,L-γ-PGA Liên kết α-peptid thường chỉ tìm thấy trong cấu trúc của các protein và các liên kết này có thể bị enzym protease phân cắt Đối với liên kết γ-peptid trong axit poly γ-glutamic chỉ có thể phân cắt bởi enzym γ-GTP (γ- glutamyltranspeptidase) một loại enzym hiếm có trong tự nhiên Không một protease nào

có thể phân cắt được γ-PGA, tuy nhiên γ-PGA lại là đối tượng sử dụng trở lại của các vi sinh vật tạo nên chúng [95]

Việc chuyển hóa tạo γ-PGA cần sử dụng các hệ enzym đa dạng tùy thuộc vào hệ vi sinh và môi trường nuôi cấy Sơ đồ hình thành nên γ-PGA được minh họa trong hình 1.2 như sau:

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp γ-PGA [48]

Con đường sinh tổng hợp γ-PGA được nghiên cứu và đưa ra từ năm 1982 bởi Hara và các cộng sự vẫn là vấn đề đang gây tranh cãi giữa các nhà khoa học, bởi mỗi chủng vi khuẩn

có những cách chuyển hóa riêng [48] Tuy nhiên có một số điểm chung trong các nghiên cứu về con đường tổng hợp γ-PGA là: từ các hợp chất polysaccharide sau khi chuyển hóa thành các dạng đường cơ bản là glucose hoặc saccharose được vi khuẩn chuyển hóa qua quá trình đường phân thành axit pyruvic Từ axit pyruvic nhờ sự chuyển hóa của vi khuẩn qua chu trình TCA chuyển hóa thành axit α-ketoglutaric Với sự tham gia xúc tác của NH4+, phản ứng chuyển hóa axit α-ketoglutaric và L-glutamine thành axit L-glutamic Nhờ axit α-ketoglutaric và axit pyruvic mà axit L-glutamic có thể chuyển hóa một phần thành D-glutamic.Giai đoạn polymer hóa nhờ sự xúc tác của enzym PGA synthetase sản sinh bởi

vi khuẩn, các phần tử L-glutamic và D-glutamic liên kết với nhau thành D,L-γ-PGA

Quá trình tổng hợp PGA nhìn chung có thể tổng kết qua bốn góc độ là: racemic hóa PGA, polymer hóa γ-PGA, phân cắt γ-PGA, và điều tiết γ-PGA, được cụ thể như sau:

γ Quá trình racemic hóa γγ PGA: Do γγ PGA là một hỗn hợp chỉ gồm L hoặc D –glutamic hoặc cả D và L glutamic, tùy thuộc vào chủng vi khuẩn tham gia Tuy nhiên, để có được

D-glutamic cần phải có quá trình racemic hóa từ L-glutamic Vi khuẩn B subtilis, có đoạn

mã gen liên quan đến sự hình thành enzyme có khả năng racemic hóa là glr và yrpC Trong

đó glr là enzym cytosolic có khả năng lựa chọn glutamic cao và đặc biệt đối với

glutamic[30] Quy trình racemic hóa glutamic thành D-glutamic được xảy ra như sau: glutamic được enzym pyruvic aminotransferase xúc tác chuyển hóa thành L- alanine, sau

L-đó L-alanine được enzym alanine racemase xúc tác racemic hóa thành D-alanine Cũng nhờ xúc tác của enzym pyruvic aminotransferase mà D-alanine chuyển hóa thành D-glutamic [45, 95]

- Quá trình polymer hóa γ-PGA: cơ chế polymer hóa các phân tử γ-PGA phụ thuộc vào các phần tử ATP được chỉ ra trong hình 1.3 Đầu tiên là nhóm carboxyl ở cuối của phân tử γ-PGA kết hợp với nhóm phosphoryl từ gamma phosphate của ATP Tiếp theo, nhóm amino của axit glutamic tấn công thay thế vào các phần tử phosphorylated trên nhóm carboxyl, kết quả hình thành liên kết amin mới làm kéo dài mạch γ-PGA [104]

Hình 1.3 Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP [104]

- Quá trình phân cắt γ-PGA (depolymer γ-PGA): hai enzym (endo-γ-glutamyl peptidase và exo-γ- glutamyl peptidase được chứng minh là những enzym phân cắt γ-PGA Trong thực

tế đã chứng minh có sự phân cắt γ-PGA trong canh trường do enzym ngoại bào của vi

khuẩn B subtilis NX2, là nguyên nhân giảm khối lượng phân tử γ-PGA [120] Những

enzym này được thể hiện rõ ở pha cuối của quá trình sinh tổng hợp

- Quá trình điều tiết γ-PGA: Theo nhiều nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp γ-PGA được điều tiết bởi các gen ComPA, DegSU và DegQ điều khiển mức độ phiên mã để thể hiện các đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu và sự biến đổi pha

1.4 Tính chất γ-PGA

Axit poly γ-glutamic có thể bị phân hủy sinh học, không độc với môi trường, sinh vật và con người Axit poly γ-glutamic hòa tan tốt trong nước và tạo được các liên kết bền vững với nước, do vậy khả năng giữ nước được xem là một tính chất nổi trội của axit poly γ-glutamic [14, 126, 127] Nó có thể được phân tách với các thành phần trung tính khác nhờ sắc kí giấy [9] Axit poly γ-glutamic khác biệt với protein cả về cấu trúc và tính chất chính bởi liên kết γ-peptid Thường thì các liên kết α-peptid bị phân cắt bởi protease nhưng liên kết γ-peptid trong γ-PGA chỉ có thể bị phân cắt sinh học bởi enzym γ-GTP (γ-glutamyltranspeptidase) [95]

Axit poly γ-glutamic tinh khiết có độ nhớt cao ngay ở nồng độ thấp Để xác định khả năng tạo γ-PGA của các chủng vi khuẩn, một số nhà khoa học đã sử dụng phương pháp đo độ nhớt của canh trường vi sinh vật để làm phương pháp xác định γ-PGA [53, 95]

Axit poly γ-glutamic có thể kết hợp với một số ion kim loại để tạo nên các loại muối dạng phức với các ion: Na+

, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+ có ứng dụng rộng rãi trong ngành y tế, môi trường, mỹ phẩm [61, 125]

Đối với các dạng D-PGA và L-PGA riêng rẽ, chúng có khả năng tan trong ethanol, nhưng khi chúng là một hỗn hợp đẳng mol thì bị kết tủa trong ethanol [50, 95]

Kích thước cũng như khối lượng của axit poly γ-glutamic rất đa dạng, phụ thuộc vào cấu trúc cũng như dạng liên kết của nó với các chất khác trong canh trường vi sinh vật Khối lượng trung bình của các phân tử γ-PGA từ vài kilo dalton đến hàng triệu kilo dalton Nhìn chung, các phân tử D,L-γ-PGA thường có khối lượng lớn hơn nhiều so với D-γ-PGA hay L-γ-PGA và dạng neo giữ thường có kích thước nhỏ hơn dạng tự do [33]

Trong huyền phù cao lanh, γ-PGA đạt độ kết dính cao nhất ở nồng độ 20mg/l và độ kết dính tăng lên khi có các cation kim loại như Ca+2

,Mg+2,Fe+2 Độ kết dính cao trong môi trường pH thấp 3-5 và giảm khi nhiệt độ trên 100o

C [126]

Nếu cấu trúc hình thể γ-PGA có độ tinh sạch cao sẽ được sử dụng trong dược phẩm và thực phẩm Tuy nhiên để đạt được các sản phẩm này cần có sự tác động đến điều kiện môi trường Với 5 dạng hình thể γ-PGA như cấu trúc xoắn anpha, phẳng beta, xoắn cuộn liên tục ngẫu nhiên, cuộn ngẫu nhiên, bao phủ thành khối thì điều kiện môi trường hình thành

khác nhau Trạng thái hình thể của γ-PGA tinh sạch từ B licheniformis có thể tồn tại ở các

dạng hình thể khác nhau tùy thuộc vào nồng độ γ-PGA và giá trị pH của dung dịch Ở nồng

độ thấp (0,1% w/v) và pH dưới 7, cấu trúc γ-PGA chủ yếu là xoắn anpha, ngược lại khi pH cao, cấu trúc γ-PGA thể hiện dưới dạng phẳng beta

1.5 Phân loại γ-PGA

Có nhiều hình thức phân loại γ-PGA tùy thuộc vào cấu trúc, chủng vi sinh vật tổng hợp hay phương thức tồn tại của polymer này trong canh trường vi sinh vật Tuy nhiên có hai phương pháp phân loại phổ biến là:

Theo cấu trúc γ-PGA được phân làm 3 loại sau:

Axit poly γ-D-glutamic (D-γ-PGA): chỉ chứa các đơn phân là axit D-glutamic và loại polymer này hiện nay mới được chứng minh chỉ tạo ra bởi chủng vi khuẩn B anthracis

một chủng vi khuẩn được tìm thấy trên các vật chủ bị bệnh than [15, 32, 33]

Axit poly γ- L-glutamic (L-γ-PGA): là polymer chỉ chứa các đơn phân là axit L- glutamic loại này được sản xuất chủ yếu từ các vi khuẩn Natrialba aegyptiacia một loài ưa mặn, γ-

PGA được sinh ra trong vi khuẩn này nhằm để chống lại sự mất nước của vi khuẩn trong điều kiện môi trường nước biển [117] L-γ-PGA cũng được tìm thấy rất nhiều trong các

động vật có xúc tu (sứa biển, san hô) và thành phần chính trong chất dính của Hydra

L-γ-PGA kết hợp với các cation như Ca²+, Mg2+ và K+ giúp vi khuẩn và các sinh vật khác điều hòa áp suất thẩm thấu bên trong tế bào [16, 69]

Axit poly γ-D,L- glutamic (DL-γ-PGA): là polymer trong phân tử chứa cả axit L-glutamic

và axit D-glutamic, DL-γ-PGA được sản xuất chủ yếu từ Bacillus được chia làm 2 nhóm:

- Cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA

- Không cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA

Tỷ lệ đồng phân D/L trong DL-γ-PGA thường phụ thuộc vào tỷ lệ Mn2+trong môi trường phát triển của vi khuẩn và tùy thuộc vào loài vi khuẩn [16] Đồng phân của axit poly γ-glutamic được hình thành bởi D và L-Glutamic tùy thuộc vào chủng giống vi sinh vật tạo

ra nó cụ thể được chỉ ra trong bảng 1.2:

Bảng 1.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic [69]

Phân loại theo phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật, có 2 dạng như sau:

Axit poly γ-glutamic dạng neo giữ: Chủ yếu có trong vi khuẩn B anthracis đối với loài vi

khuẩn này γ-PGA là một hợp chất có tác dụng kháng thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn công vào bên trong tế bào Dạng neo giữ thường được tìm thấy dưới dạng nội bào, được tiết ra ngoài dưới dạng các sợi liên kết giữa vi khuẩn và môi trường ngoài khi gặp điều kiện bất lợi Do vậy việc sử dụng γ-PGA từ dạng neo giữ ít được nghiên cứu [50]

Axit poly γ-glutamic dạng tự do được tiết trực tiếp vào môi trường nuôi cấy: Dạng này chủ yếu được tìm thấy trong các loài lành tính của chi Bacillus mà điển hình là B subtilis Loài

vi khuẩn điển hình cho γ-PGA dạng tự do là B subtilis, γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao

quanh tế bào vi khuẩn và có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng trong trường hợp

môi trường thiếu dinh dưỡng, trong giai đoạn suy vong của vi khuẩn [104]

1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh axit poly γ-glutamic được sản sinh bởi các

chủng vi khuẩn thuộc các loài: B subtilis, B licheniformis, B thuringensis, B cereus, B pumilus, B amyloliquefaciens, B mojavensis, B atrophaeus, B megaterium, Staphylococcus epidermidis, Natrialba aegyptiaca, Lysinibacillus sphaericus và Fusobacterium nucleatum trong đó một số chủng vi khuẩn này đã được ứng dụng rộng rãi

trong các ngành công nghiệp và đời sống [33, 50, 95, 104, 115] Các nghiên cứu trước

cũng cho thấy tất cả các vi khuẩn tạo ra γ-PGA đều là vi khuẩn Gram dương và chủ yếu là

các vi khuẩn thuộc chi Bacillus, γ-PGA có chức năng đa dạng khác nhau tùy theo loài tổng

hợp và môi trường của chúng [30] Trong những chủng vi khuẩn sản sinh ra axit poly

γ-glutamic, thuộc chi Bacillus các nghiên cứu đi sâu hơn vào các chủng của loài B subtilis,

đây là những vi sinh vật được sử dụng rất phổ biến trong công nghiệp và các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chúng có lợi cho đường ruột Trong tự nhiên, chúng được phân bố rộng rãi

và phổ biến: cỏ khô, bụi, đất nước… B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, thuộc họ Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi, sinh trưởng trong điều

kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, pH môi trường có độ biến động cao Chúng có khả năng hình thành bào tử khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi như dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt, hàm lượng kháng sinh, chất ức chế cao, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp hoặc biến động mạnh… Bào tử có kích thước nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào Bào tử

có thể quan sát được dưới kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm bào tử hoặc nhuộm gram

[13] Nhờ tính chất đặc trưng này mà có thế phân lập được B subtilis trong môi trường Trong công nghệ thực phẩm ngày nay, có rất nhiều chủng của chi Bacillus có thể sử dụng

các nguồn cơ chất đa dạng, có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA và sinh trưởng tốt Loài vi khuẩn điển hình nhất, an toàn đối với người, được sử dụng rộng rãi hiện nay trong ngành

công nghiệp thực phẩm là B subtilis Một số chủng B subtilis đã được phân lập và nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA trên thế giới như B subtilis NX-2, ZJU-7, TAM 4, IFO 3335,

RKY3, chungkookjang, natto… là nhưng vi khuẩn điển hình được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm Các chủng này khi ứng dụng để sản xuất γ-PGA trên thực tế cho sản lượng ổn định từ 20g/l đến 50 g/l, an toàn với người và động vật [93, 106, 116, 121, 128]

Vi khuẩn B licheniformis thường được tìm thấy trong đất, trên lông của các loài chim mặt đất và thủy cầm B licheniformis là vi khuẩn Gram dương và ưa ấm, với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của nó là khoảng 37°C, mặc dù nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn B licheniformis được phân lập và ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, xử lý môi trường và xử lý các sản phẩm nông nghiệp Các chủng B licheniformis được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trên thế giới là B licheniformis NCIM 2324, S2, ATCC 9945a, WBL-3,

CCRC 12826, với khả năng sinh tổng hợp γ-PGA đến 98 g/l [17, 33, 38, 80]

Vi khuẩn B anthracis là vi khuẩn gây bệnh than, một căn bệnh phổ biến của gia súc và con người là loại vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn B anthracis sinh tổng hợp chủ yếu là D – PGA

dưới dạng neo giữ và ít được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm bởi tính chất gây

bệnh của B anthracis [32, 33]

Chuyển gen sinh tổng hợp PGA: một số gen trong vi khuẩn có chức năng polymer hóa

γ-PGA đã được tìm ra và đã được nghiên cứu chuyển gen vào một số vi khuẩn có đặc tính

sinh trưởng cao như Erscherichia coli và Agrobacterium trên cây thuốc lá nhằm cải thiện

năng suất và giảm giá thành γ-PGA sản phẩm Tuy nhiên những nghiên cứu này vẫn chưa đạt yêu cầu khai thác công nghiệp do lượng γ-PGA sản sinh thấp với khoảng 0,024 g/l trên

vi khuẩn E coli và 0,6mg/g lá thuốc lá [12, 108]

1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA

1.7.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

Nguồn dinh dưỡng là yếu tố cốt lõi để vi sinh vật sinh trưởng và tạo thành các sản phẩm mong muốn Các chủng vi sinh vật tạo ra những sản phẩm khác nhau khi được nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau Thông thường mỗi sản phẩm đều có một môi trường đặc hiệu khác nhau, sau nhiều năm nghiên cứu về γ-PGA các nhà khoa học trên thế giới đã đưa ra một môi trường đặc hiệu riêng, cơ bản cho các loại vi khuẩn sinh γ-PGA (môi trường E) Thành phần môi trường E được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Thành phần môi trường cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA [73]

Môi trường dinh dưỡng này được gọi tắt là môi trường cơ bản E Tùy thuộc vào từng loại

vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA mà sự điều chỉnh các thành phần trong môi trường dinh

dưỡng bao gồm: nguồn carbon, nguồn nitơ, nguyên tố vi lượng Mn+2

, Mg+2 [72, 95] Những yếu tố này được thay đổi phụ thuộc vào chủng giống vi khuẩn khi tổng hợp và những tính chất đặc điểm cần đạt của γ-PGA như khối lượng phân tử, năng suất, tỷ lệ đồng phân D và L-glutamic trong γ-PGA

1.7.1.1 Nguồn Carbon

Cùng với việc sử dụng các chất hữu cơ sẵn có trên thị trường như axit citric, đường glucose, glycerol, muối khoáng, vi lượng…, Quá trình nghiên cứu và ứng dụng luôn hướng đến việc sử dụng những hợp chất sẵn có trong tự nhiên, các phế phụ phẩm từ quá trình sản xuất khác (nước đậu, dịch chiết của một số quá trình nên men…) làm cơ chất cho quá trình nghiên cứu; để từ đó tận dụng được triệt để các nguồn phát thải, cũng như giảm giá thành sản xuất, nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng

Theo một số nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, vi khuẩn B subtilis có thể sinh

tổng hợp γ-PGA từ các nguồn carbon có trong đậu tương, do đậu tương có thành phần dinh dưỡng như: protein (35-45%), ngoài ra còn có các loại axit amin cơ bản isoleucine, leucine, lysin, methionine, phenylamin, tryptophan, valin… isoflavones Trong đậu tương axit glutamic chiếm khoảng 10g/kg là thành phần chính tham gia vào quá trình tổng hợp γ-PGA Ngoài ra đậu tương có chứa: glucose (15-25%), nước (8%), chất vô

cơ, muối khoáng như Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S (5%), vitamin: A, B1, B2, D, E, F, globulin, chất xơ [8, 36, 119, 128] Những nghiên cứu về thành phần của đậu tương đã

cho thấy, đây có thể là nguồn thức ăn cung cấp nhiều dinh dưỡng cho vi khuẩn Bacillus tạo

ra sản phẩm γ-PGA có tính ưu việt, phù hợp với mục tiêu đề ra

Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp γ-PGA đã sử dụng hai nguồn carbon tự nhiên là bột đậu tương và bột mỳ làm cơ chất trên môi trường rắn [118] Những nghiên cứu khác sử dụng nguồn carbon từ phụ phẩm của quá trình sản xuất natri glutamat cho môi trường sinh tổng hợp γ-PGA, để từ đó làm phụ gia thực phẩm cho người và ứng dụng trong một số lĩnh vực có liên quan đến sức khỏe [114]

Nguồn carbon thường được sử dụng trong các nghiên cứu về γ-PGA gồm đường glucose, fructose, maltose, galactose, lactose, sacharose, xylose, glycerol, glutamic Ngoài nguồn carbon là gluxit thì các chất hữu cơ khác như các axit béo phân tử lượng lớn glycerol, axit hữu cơ… cũng được dùng làm nguồn C Thông thường trong các môi trường sinh tổng hợp γ-PGA các thành phần carbon thường được sử dụng là glycerol, axit citric, axit L-glutamic

[46] Nghiên cứu về các đặc tính và khả năng chuyển hóa của 3 nguồn carbon là axit citric, glycerol và axit glutamic được cụ thể như sau:

- Axit citric: Theo chu trình chuyển hóa γ-PGA việc sử dụng các nguồn carbon từ axit

citric là nguồn cacbon chính, bởi nó là mắt xích trung gian quan trong trong chu trình axit tricacboxylic Vì vậy nó xuất hiện trong trao đổi chất của gần như mọi sinh vật Hai phần

ba nguồn năng lượng sử dụng cho các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật là lấy từ citric Chu trình chuyển hóa axit tricarboxylic cho thấy tất cả các hợp chất polysaccharide đều phải chuyển hóa thành axit citric trước khi thành axit α-ketoglutaric và glutamic Một số nghiên cứu đã chỉ ra có thể không sử dụng glucose làm nguồn carbon khi tổng hợp γ-PGA, nhưng nếu không sử dụng axit citric trong thành phần của môi trường, thì việc hình thành γ-PGA là rất ít hoặc không có [38, 95, 113] Tuy nhiên điều này chỉ đúng với một số loại vi

khuẩn Một số chủng sử dụng glucose cho sản lượng cao hơn khi sử dụng citric như B subtilis NX2, B subtilis ZJU7, B subtilis F-2-1, B subtilis AR1 [57, 76, 123] Khi nghiên

cứu so sánh sử dụng axit citric với một số các axit hữu cơ khác như axit succinic, L-malic, fumaric trong nghiên cứu lên men sinh γ-PGA cho thấy sự hình thành γ-PGA là rất ít, thay vào đó là sự hình thành nhiều hơn của các sản phẩm phụ Các tế bào vi sinh vật không thể sinh trưởng được trong môi trường dinh dưỡng, nếu sử dụng nguồn carbon là axit axetic thay cho citric [45] Khi nghiên cứu nồng độ axit citric đến sự sinh tổng hợp γ-PGA của vi

khuẩn Bacillus sp RKY3 cho thấy nồng độ tối ưu cho việc tạo γ-PGA cực đại là 30 g/l Ở

nồng độ citric cao hơn 30 g/l sẽ gây ra hiện tượng ức chế, giảm sự sinh trưởng của tế bào

vi sinh vật, làm ảnh hưởng đến sự tạo thành γ-PGA [60] Những nghiên cứu về sự ảnh hưởng của axit citric và các hợp chất ammonium trong sinh tổng hợp γ-PGA trong một số

chủng vi khuẩn như Bacillus velezensis NRRL-23189 cho thấy có sự ảnh hưởng không nhỏ

của yếu tố NH4+

trong sự hình thành γ-PGA bởi yếu tố này là tác nhân trong chu trình tổng hợp glutamic [81] Sự chuyển hóa của axit citric trong quá trình tổng hợp γ-PGA được

khảo sát trên đối tượng là vi khuẩn B licheniformis cho thấy với nồng độ ban đầu là 12g/l,

sau 10h lên men nồng độ citric giảm mạnh và gần như bằng không sau 21h lên men Để tăng hàm lượng γ-PGA, các nghiên cứu đã tiến hành bổ sung một lượng từ 2-5 g/l axit citric vào thời điểm sau 21h lên men, kết quả cho thấy lượng γ-PGA được cải thiện khoảng

15% [127]

- Glycerol: Glycerol tham gia trong chu trình tổng hợp này như một chất xúc tác cho quá

trình polymer hóa L-glutamic Ngoài ra vi khuẩn còn sử dụng glycerol như một dạng cơ

chất để phát triển Trong canh trường lên men γ-PGA của vi khuẩn B licheniformis ATCC

9945A, nồng độ glycerol cao trong canh trường đã tác động đến lớp màng phospholipids trên lớp màng tế bào Vì vậy các phần tử C18:1 và C16:1 trong phospholipids bị giảm xuống và các phân tử C12:0 và C10:0 tăng lên Nhờ sự thay đổi này mà lớp màng tế bào của vi khuẩn được giãn rộng ra, tạo điều kiện cho sự bài tiết γ-PGA qua lớp màng tế bào

[30, 47] Vì vậy trong nhiều nghiên cứu với vi khuẩn B subtilis NX-2, tác giả đã điều

chỉnh nồng độ glycerol nhằm thay đổi khối lượng phân tử của γ-PGA Glycerol ảnh hưởng đến hàm lượng γ-PGA ngay ở thời kỳ đầu của quá trình tổng hợp Khi hàm lượng glycerol tăng hàm lượng γ-PGA tăng, khối lượng phân tử γ-PGA giảm, đồng nghĩa với việc giảm

độ nhớt trong canh trường lên men [120] Nghiên cứu về sự thay đổi nồng độ glycerol

trong toàn bộ quá trình lên men trên B licheniformis cho thấy nồng độ glycerol thay đổi

không đáng kể trong khoảng thời gian 36h đầu quá trình lên men, giảm khoảng 10-15% từ 36h đến 50h [127] Hàm lượng glycerol trong canh trường lên men còn lại 45-50% sau thời gian 96 h và giá trị này tùy thuộc vào giá trị pH của canh trường nuôi cấy Giá trị pH càng gần 8 thì lượng glycerol còn lại trong canh trường càng cao [38] Những nghiên cứu về sự

biến đổi glycerol trong canh trường lên men B licheniformis NCIM 2324 cho thấy lượng

glycerol bằng không sau 96h lên men trong điều kiện sục khí và khuấy trộn ở tốc độ trên

750 vòng/phút Glycerol là nguyên nhân tạo độ nhớt trong canh trường, tác động đến sự trao đổi oxy của vi khuẩn trong canh trường Do vậy quá trình khuấy và glycerol có tương quan đến nhau trong nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA [17]

- Axit glutamic: Các nghiên cứu đi trước đã cho ta thấy γ-PGA được tạo thành từ các

thành phần chính là L-glutamic và D-glutamic thông qua hệ enzym polymerase của vi khuẩn Tùy thuộc vào enzym được sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn mà tỷ lệ D-glutamic/L-glutamic là khác nhau và khối lượng phân tử γ-PGA khác nhau Dựa trên chu trình tổng hợp γ-PGA (hình 1.2) có thể thấy axit glutamic trong quá trình tổng hợp γ-PGA được tham gia trong chu trình bằng hai cách Cách thứ nhất glutamic được thêm vào trong canh trường từ ban đầu, cách thứ 2 glutamic được tạo ra từ các nguồn carbon khác Theo một số nghiên cứu về γ-PGA, vi sinh vật tham gia tổng hợp chia làm hai nhóm [95]:

 Nhóm1: Môi trường đòi hỏi sử dụng axit L-glutamic để kích thích tế bào phát triển và tổng hợp γ-PGA

 Nhóm 2: Môi trường không đòi hỏi axit L-glutamic để sản sinh γ-PGA

Nhóm sử dụng axit L-glutamic bao gồm các chủng B subtilis ATCC9945a, IFO3335 và F-2-01 [36, 37, 71, 96, 99] Các nhóm vi khuẩn không phụ thuộc vào axit L-glutamic bao

gồm các chủng B subtilis 5E, TAM-4 và B licheniformis A35 Vi khuẩn không phụ thuộc

axit L- glutamic thường sử dụng axit citric và glucose làm nguồn carbon chính cho việc tạo

thành γ-PGA B subtilis A35 có thể sản sinh γ-PGA từ glucose và NH4Cl B subtilis

TAM-4 có thể tạo ra một lượng lớn γ-PGA khi môi trường nuôi cấy chứa muối amoni và

đường làm nguồn thức ăn nitơ và carbon B subtilis 5E có thể sản sinh γ-PGA từ L proline như nguồn nitơ và carbon trong môi trường khoáng Vi khuẩn B licheniformic ATCC9945a sử dụng axit citric và glycerol như một nguồn carbon chính, nhưng vẫn được

đưa vào nhóm phụ thuộc vào axit L-glutamic, bởi trong quá trình chuyển hóa thành γ-PGA thì glutamic được sử dụng như một dạng tiền chất, có tác dụng hoạt hóa các hệ enzym tổng

hợp γ-PGA Nghiên cứu sử dụng L-glutamic như một dạng tiền chất ở vi khuẩn B subtilis

ZJU-7 cho thấy với hàm lượng glutamic ban đầu cao (trên 80 g/l) sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc tích tụ γ-PGA (54 g/l) Khi lượng glutamic ở mức độ thấp (dưới 60g/l) sự tích tụ γ-PGA vẫn hình thành (4-5g/l), độ nhớt vẫn tăng, nhưng kèm theo sự hình thành đáng kể các sản phẩm phụ gây nhớt có cấu trúc fructan [9, 32, 33, 36, 37, 46, 93, 128]

1.7.1.2 Nguồn Nitơ

Nguồn dinh dưỡng Nitơ sử dụng trong canh trường có thể là các hợp chất hữu cơ hoặc vô

cơ Các hợp chất hữu cơ là những hợp chất giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô đậu, khô lạc, cao nấm men, cao thịt bò, pepton, tryptone, protein từ cá… Nguồn nitơ vô cơ như urê, NH4NO3, các muối amon khác Nguồn nitơ là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng của tế bào và là yếu tố xúc tác cho quá trình chuyển hóa thành axit glutamic [60]

Trong môi trường sinh tổng hợp γ-PGA ngoài các nguồn nitơ có trong các sản phẩm tự nhiên như bột đậu tương cao ngô… Nguồn nitơ trong canh trường nuôi cấy đòi hỏi phải có gốc NH4+ bởi đây là yếu tố chính trong việc chuyển hóa tạo thành L-glutamic Sự khác nhau về chủng giống vi sinh vật cũng ảnh hưởng nhiều đến việc sử dụng nguồn nitơ Nhiều nguồn nitơ có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzym, một số khác lại kìm hãm hoặc không có ảnh hưởng rõ rệt Nhiều chủng có thể sử dụng một trong hai nguồn nitơ là NH4+

hoặc cao nấm men, hoặc có thể dùng đồng thời hai loại này như B subtilis ZJU-7 Các

nguồn nitơ bổ sung vào canh trường lên men quyết định đến giá thành sản phẩm sau lên men Nếu sử dụng nguồn nitơ từ các nguồn như cao nấm men, đậu tương, nitơ vô cơ giá thành sẽ rẻ hơn rất nhiều so với các nguồn nitơ đặc chủng như tryptone Trong sản xuất γ-

PGA bởi chủng B subtilis RKY3, cao ngô từ nguồn phế phẩm nông nghiệp, được thay thế

cho pepton làm nguồn nitơ Hiệu suất sinh tổng hợp từ cách thay thế này, tạo ra lượng

γ-PGA bằng 80% so với sử dụng pepton Đối với một số chủng như B licheniformis IFO

3335 khi không có sự tham gia của NH4+thì một lượng rất nhỏ γ-PGA được tạo thành sau quá trình sinh tổng hợp Nghiên cứu trên chủng vi khuẩn này cho thấy hàm lượng NH4+

bổ sung vào canh trường để sản sinh γ-PGA hiệu quả nhất là 1,8% [5, 34, 35, 60, 76, 95] Một trong những nguồn nitơ cung cấp cho quá trình lên men phải kể đến là axit glutamic và các

muối của nó, các chủng B subtilis là điển hình cho việc sử dụng nitơ từ các nguồn này

[25]

1.7.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối

Nồng độ muối NaCl trong canh trường ảnh hưởng đến khối lượng phân tử γ-PGA được tạo thành Khi nồng độ muối trong canh trường tăng từ 0% đến 4% khối lượng phân tử γ-PGA

tạo thành bởi B licheniformis 9945a tăng từ 1200 kDa lên 2200 kDa [38] Nồng độ muối

cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ đồng phân D và L-glutamic trong γ-PGA sản sinh

bởi chủng B subtilis chungkookjang [86]

Nồng độ muối NH4Cl cũng được xem là một yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào Đặc biệt, muối NH4SO4 là một muối làm giảm sự tăng trưởng của tế bào, nhưng lại làm tăng sản lượng γ-PGA và tạo ra γ-PGA khối lượng phân tử lớn đối với canh trường có

vi khuẩn B subtilis IFO3335[45] Trong canh trường B subtilis chungkookjang, với hàm

lượng NH4SO4 cao tỷ lệ đồng phân L-glutamic trong γ-PGA cao hơn D-glutamic [86] Nghiên cứu ảnh hưởng của CaCl2 cho sinh tổng hợp γ-PGA từ B subtilis CGMCC 2108 thấy: khi tăng hàm lượng CaCl2 độ nhớt trong canh trường giảm, tăng lượng tiêu thụ glutamat ngoài tế bào lên 11,4%, nhưng làm tăng lượng γ-PGA từ 7,88g/l lên 9,07 g/l Nguyên nhân là do CaCl2 làm tăng hoạt tính ba loại enzym có liên quan trong tổng hợp γ-PGA ở nhánh 2-oxoglutarate trong chu trình TCA (isocitrate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase và 2 oxoglutarate dehydrogenase) Tăng lượng CaCl2 dường như lượng oxoglutarate được chuyển hóa nhiều hơn, vì vậy lượng γ-PGA tăng [53]

1.7.1.4 Nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố khoáng cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp enzym Các nguyên tố này bao gồm cả nguyên tố đa lượng và vi lượng Trong sinh tổng hợp γ-PGA các nguyên tố vi lượng là mangan, magie, sắt, kẽm, kali, canxi và đồng Các nguyên tố này thường có trong nước hoặc trong các thành phần hữu cơ khác của môi trường (bột, cao ngô

và dịch chiết khác) do đó không cần bổ sung hoặc chỉ bổ sung ở dạng rất ít Nếu nồng độ của các nguyên tố này tăng sẽ kìm hãm mạnh sự phát triển của vi sinh vật

Sinh tổng hợp γ-PGA còn chịu ảnh hưởng bởi, Ca2+

, Mg2+, Fe3+, Mn2+… là các yếu tố vi lượng được đưa vào dưới dạng muối vô cơ với hàm lượng nhỏ hơn 0,5% thành phần của môi trường Trong các nguyên tố này cần lưu ý đến các ion Mn2+

[110, 121] Nghiên cứu trên chủng B licheniformic 9945a cho thấy khi không có sự tham

gia của MnSO4, tế bào vi khuẩn bị suy thoái sau 50h nuôi Tuy nhiên khi thêm MnSO4 vào canh trường nuôi cấy thì lượng này hầu như còn nguyên sau 96h nuôi cấy Sự có mặt của MnSO4 giúp tế bào đồng hóa glycerol, L-glutamic và axit citric tốt hơn khi không có nó

Sự có mặt của MnSO4 tạo ra một lượng γ-PGA (13g/l) cao hơn so với lượng γ-PGA (5g/l) khi không có sự tham gia của MnSO4 [62]

Ion Ca+2 tuy không ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp nhưng nó ảnh hưởng đến tính chất của sản phẩm khi ứng dụng Sự có mặt Ca+2

trong γ-PGA sản phẩm sẽ giúp tăng

sự hấp thụ Ca+2

trong cơ thể giúp ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm chức năng [10]

1.7.2 Ảnh hưởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men

Các yếu tố và điều kiện môi trường nuôi cấy có khả năng ảnh hưởng đến vi khuẩn, cụ thể

là ảnh hưởng đến thành tế bào như sự thương tổn thành tế bào, làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất, gây kìm hãm, ức chế

sự hoạt động của các enzym, phá hủy các quá trình tổng hợp của tế bào Các yếu tố đó cụ thể như:

1.7.2.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường sống của vi khuẩn, do vậy nó ảnh hưởng rất lớn đến các quá trình sinh tổng hợp Trong nghiên cứu về ảnh hưởng nhiệt của nhiệt độ đến vi khuẩn chia làm các khoảng nhiệt độ như sau:

Dải nhiệt độ sinh trưởng của vi khuẩn thông thường chia làm 3 dải: vi khuẩn ưa lạnh nhiệt

độ dưới 20oC, vi khuẩn ưa ấm nhiệt độ từ 20o

C - 45oC, vi khuẩn ưa nóng từ 45oC trở lên

Đây cũng là đặc tính để phân lập, tuyển chọn, định danh vi khuẩn và cũng là cơ sở cho các quá trình nuôi, sinh tổng hợp γ-PGA [56] Đối với các chủng sinh tổng hợp γ-PGA, tùy theo đặc tính của từng loài mà nhiệt độ tối ưu của các chủng khác nhau Nghiên cứu trên

các chủng B licheniformic ATCC 9945, B licheniformic A35, B subtilis F02-1 sinh tổng

Yếu tố pH quyết định đến mức độ hoạt động của ion H+ trong canh trường, ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong canh trường Giá trị pH sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bởi hoạt độ ion H+ trong môi trường làm thay đổi trực tiếp đến trạng thái điện tích của thành tế bào Trong quá trình lên men, pH canh trường luôn thay đổi, tuỳ theo chủng vi sinh vật, dạng sản phẩm lên men cần thu nhận mà các nghiên cứu sẽ hiệu chỉnh hoặc không hiệu chỉnh pH theo quá trình lên men Nếu giá trị pH không phù hợp sẽ làm tổn thất trong quá trình lên men tăng nhanh Trong các nghiên cứu

về giá trị pH đối với chủng sinh tổng hợp γ-PGA các giá trị pH thông thường được khảo

sát quanh giá trị pH = 7 [38] Nghiên cứu về chủng B licheniformis NCIM 2324 cho thấy

pH = 6,5 là giá trị tối ưu cho sinh tổng hợp γ-PGA, và axit citric được cho là sử dụng tốt ở

giá trị pH này [76] Trong một nghiên cứu khác về chủng vi khuẩn B subtilis IFO3335 cho

thấy, pH tối ưu là 7 và lượng γ-PGA tạo thành là 23 g/l cao gấp 1,44 lần trước khi tối ưu

pH [45] Một số trường hợp đặc biệt trong nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình

tổng hợp γ-PGA bởi chủng B subtilis CGMCC 0833, có hai trạng thái pH tối ưu đối với

chủng này, tại pH = 6,5 tối ưu cho việc sử dụng glutamat, còn pH = 7 thích hợp nhất cho

sự sinh trưởng của vi khuẩn Chính vì vậy trong quá trình sinh tổng hợp γ-PGA, trong 24h đầu pH = 7, sau 24h giá trị pH được điều chỉnh về 6,5 Sự điều chỉnh giá trị pH của canh trường đã giúp tăng hiệu suất tổng hợp γ-PGA lên 24,8% [122] Khảo sát trên một số

chủng vi khuẩn B licheniformis ATCC 9945a cho thấy chủng có khả năng sinh γ-PGA cao

nhất tại pH tối ưu là 7,4 [38, 76] Như vậy có thể nói giá trị pH tối ưu cho mỗi canh trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào các chủng vi khuẩn tham gia tổng hợp γ-PGA

1.7.2.3 Ảnh hưởng của sục khí và khuấy trộn

Poly gamma glutamic là nguyên nhân chính tạo độ nhớt trong canh trường, độ nhớt là yếu

tố cản trở sự trao đổi các chất dinh dưỡng và oxy của quá trình lên men Điều khiển, duy trì

sục khí và khuấy trộn là yếu tố rất quan trọng đối với quá trình lên men γ-PGA Kết quả nghiên cứu của Shih và các cộng sự cho thấy khi tăng lưu lượng sục khí từ 0,5 lít/phút lên 2,0 lít/phút và tốc độ khuấy từ 250 vòng/phút lên 800 vòng/phút trong quá trình nuôi cấy

B licheniformis thì lượng γ-PGA thu được tăng từ 15 g/l lên đến 23 g/l [98] Sục khí và

khuấy trộn còn ảnh hưởng đến mức độ đồng hóa glutamat và citric trong quá trình tổng

hợp Đối với vi khuẩn B licheniformis sau 96h nếu không có sục khí và khuấy trộn thì

lượng glutamat và citric còn lại tương ứng là 8,3 g/l và 7,5 g/l, nhưng khi có khuấy trộn và sục khí, lượng glutamat và citric còn lại tương ứng là 0,2 g/l và 2,2 g/l Mức độ cung cấp oxy cho quá trình lên men γ-PGA thông qua khuấy và sục khí là yếu tố cần thiết cho việc sinh tổng hợp của vi sinh vật, bởi như vậy các nguồn dinh dưỡng mới được đồng hóa triệt

để, tạo sản phẩm có khối lượng phân tử lớn, năng suất cao [38]

Trong nghiên cứu qui trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm, quá trình lắc (cấp khí và khuấy trộn) có thể không thể hiện chính xác, tương ứng với quy mô khi nhân rộng Nhưng

ở quy mô thực nghiệm quy mô lớn, quá trình sục khí, khuấy trộn ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất của quá trình lên men Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA khi nuôi cấy trên quy mô phòng thí nghiệm thường được nghiên cứu ở chế độ nuôi tĩnh, trong khi thực hiện ở quy mô công nghiệp thường được nghiên cứu bổ sung thêm chế độ sục khí hoặc khuấy trộn đển đảm bảo nguồn oxy cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và tổng hợp γ-PGA Vì vậy, trước khi lên men trên quy mô lớn cần phải nghiên cứu kỹ đặc tính chu kỳ sinh trưởng và tổng hợp của chủng vi khuẩn để đưa ra những chế độ cấp khí và khuấy trộn phù hợp [17, 35, 38, 127]

1.7.3 Phương pháp lên men γ-PGA

Dựa trên những tài liệu nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn Bacillus của các nhà khoa học

trên thế giới cho thấy môi trường đặc trưng cho quá trình sinh tổng hợp γ-PGA gồm các thành phần: L-glutamic, axit citric; glycerol; NH4Cl; MgSO4.7H2O; FeCl3 6H2O; K2HPO4; CaCl2 2H2O; MnSO4 H2O gọi tắt là môi trường E Đây được coi là môi trường gốc, nền tảng cho các nghiên cứu về γ-PGA Các sự biến đổi thành phần trong môi trường được nghiên cứu và thay đổi với nhiều dạng khác nhau nhưng trong nghiên cứu phòng thí nghiệm thành phần môi trường E được coi là thành phần cơ bản cho nhiều nghiên cứu [71,

84, 86, 95] Hiện nay để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất công nghiệp, γ-PGA được lên men theo 2 phương pháp:

Phương pháp lên men chìm: là phương pháp được sử dụng thông dụng trong các phòng

thí nghiệm và các quá trình sản xuất γ-PGA quy mô pilot hoặc quy mô lớn Trong môi trường lên men dạng lỏng, có chứa các thành phần gồm: axit L- glutamic; axit citric; glycerol; NH4Cl; MgSO4.7H2O; FeCl3.6H2O; K2HPO4; CaCl3.2H2O; MnSO4.H2O; pH môi trường được điều chỉnh về 7 hoặc 8 bằng NaOH và HCl tùy theo công nghệ của các nhà nghiên cứu Trong môi trường trên mỗi thành phần như axit L- glutamic, axit citric, glycerol, các muối vô cơ đều ảnh hưởng đến khả năng hình thành γ-PGA Quá trình lên men được thực hiện trong các thiết bị lên men có cánh khuấy và có hỗ trợ sục khí Ưu điểm của quá trình lên men chìm trong sản xuất γ-PGA là năng suất cao, tinh sạch đơn giản, dễ kiểm soát các yếu tố đầu vào và các thông số trong quá trình nghiên cứu, tốn ít diện tích,

có thể triển khai trên quy mô lớn Nhược điểm của phương pháp lên men chìm là giá thành đầu tư trang thiết bị đắt hơn so với các phương pháp khác [60, 71, 84]

Phương pháp lên men bề mặt trên môi trường rắn: Môi trường lên men rắn cho sinh

tổng hợp γ-PGA bao gồm 2 thành phần: Phần chất rắn gồm bột đậu tương và bột mỳ với tỷ

lệ 1:0,8 Đậu tương và bột mỳ được nghiền mịn để tăng tiết diện tiếp xúc, dễ dàng trao đổi chất dinh dưỡng Phần dịch lỏng: Gồm các thành phần với tỷ lệ như lên men lỏng, phần dịch lỏng được pha và sau đó dùng NaOH và HCl để điều chỉnh về pH = 8 Sử dụng phần dịch lỏng để trộn đều với phần chất rắn của môi trường đến khi độ ẩm môi trường đạt 75% Hai thành phần rắn và lỏng sau khi phối trộn đạt độ ẩm 75%, rồi được đưa đi khử trùng trên các khay inox có diện tích 1600cm2

Môi trường sau khi khử trùng, được tiến hành lên men trên các khay thành lớp, phủ kín mặt khay dày khoảng 3cm, và được cấy giống với tỷ

lệ 10% Các khay được lên men trong các tủ lên men có khử khuẩn không khí ở nhiệt độ 37-40oC Ưu điểm của phương pháp lên men trên môi trường rắn: thiết bị đầu tư rẻ tiền, nguyên vật liệu sẵn có, dễ vận hành thao tác Nhược điểm của phương pháp này là khả năng bị nhiễm khuẩn cao, phải qua nhiều công đoạn tinh sạch sản phẩm, tỷ lệ phụ phẩm cao [35, 37, 50, 71, 74, 84, 86, 95, 101, 122, 128]

canh trường Sau khi thu nhận γ-PGA từ các mẫu thí nghiệm theo các mốc thời gian tiến hành ly tâm loại bỏ xác vi sinh vật, tủa bằng cồn 98% với tỷ lệ 3:1, đem kết tủa và hòa tan trong nước với cùng một tỷ lệ như nhau, đem đi đo độ nhớt bằng nhớt kế Brookfield Tuy nhiên trong nhiều trường hợp sự tạo nhớt trong canh trường là những hợp chất không phải

là γ-PGA mà là hợp chất polysaccharide Để có thể kết luận chính xác cần bổ sung thêm công đoạn định tính γ-PGA bằng cách thủy phân γ-PGA thành các monomer axit glutamic

và xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng [39, 50, 95]

Xác định hàm lượng γ-PGA bằng cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB), CTAB sẽ kết hợp với γ-PGA tạo phức Phức chất này sẽ được hấp thụ ở bước sóng 400nm Khi phức chất tạo ra càng nhiều, giá trị hấp thụ màu của phản ứng CTAB ở bước sóng 400nm càng lớn Hàm lượng γ-PGA được xác định dựa trên độ tăng khả năng hấp thụ màu của hỗn hợp [7]

Xác định hàm lượng γ-PGA bằng cách đo độ hấp thụ trong vùng ánh sáng tử ngoại: phương pháp được dựa trên đặc tính hấp thụ cực đại của dung dịch γ-PGA tại vùng ánh sáng tử ngoại, bước sóng 216nm Nghiên cứu về cách đo này đã được Zeng và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh năm 2012 và đã được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu gần đây Phương pháp đơn giản, được sử dụng trong việc xác định các hợp chất hữu cơ và vô

cơ, có thể thực hiện dễ dàng trong các phòng thí nghiệm Phương pháp dựa trên đặc tính hấp thụ ánh sáng cực đại của γ-PGA khi hòa tan trong nước deion tại vùng ánh sáng tử ngoại, có thể xác định hàm lượng γ-PGA mà không bị ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử γ-PGA [130]

Phương pháp xác định hàm lượng γ-PGA bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký lỏng HPLC kết hợp với hệ sắc ký lọc gel GPC để từ đó định lượng γ-PGA Do vậy việc sử dụng cách

đo này thường được sử dụng tại các phòng nghiên cứu công nghệ cao [106]

1.8.2 Thu nhận và tinh sạch γ-PGA

Thu nhận γ-PGA từ môi trường lên men lỏng thường đơn giản bởi γ-PGA là một polymer

có khả năng tan trong nước, nên có thể loại bỏ các tạp chất bằng cách lọc hoặc ly tâm Đối với γ-PGA thu được bằng phương pháp lên men trên môi trường rắn, sau khi kết thúc quá trình lên men, γ-PGA được trích ly bằng nước nhiều lần và đem đi lọc trước khi mang đi tinh sạch [50, 95]

Một số nghiên cứu về γ-PGA của các nhà khoa học đã đưa ra nhiều phương pháp tinh sạch γ-PGA, các phương pháp này chủ yếu là sử dụng cồn 98% để làm sạch γ-PGA sau khi lên

men Tỷ lệ cồn và dịch nổi thu hồi từ quá trình lên men thường được sử dụng theo tỷ lệ 1:3 hoặc 1:4 Cồn sau khi sử dụng tinh sạch γ-PGA được đem thu hồi và xử lý lại Phương pháp sử dụng cồn chỉ có tác dụng khi tinh sạch với các axit D-L γ-PGA bởi chỉ các axit này mới bị kết tủa Khi sử dụng cồn, γ-PGA và protein bị kết tủa, một số khác không bị kết tủa sẽ được loại bỏ theo dịch Nhờ tính chất phân cực của mình sau khi kết tủa γ-PGA có thể hòa tan trở lại trong môi trường nước đã được deion, một đặc tính ít thấy ở protein.Trong công nghiệp sản xuất đại trà γ-PGA của các nhà máy lớn, γ-PGA được tinh sạch bằng các hệ thống lọc và các hệ thống chất hấp thụ như than hoạt tính, cation, anion, celite nhằm loại bỏ các ion kim loại, hợp chất tạo màu, tạo mùi ảnh hưởng đến sản phẩm [50] Dựa trên tính chất tạo nhớt của γ-PGAcó thể thu hồi làm sạch bằng cách làm giảm độ nhớt của γ-PGA bằng cách giảm pH, tăng nhiệt độ dịch sau đó sử dụng các phương pháp như lọc, ly tâm, hấp thụ để loại bỏ các tạp chất [92] Nghiên cứu các phương pháp tinh

sạch γ-PGA từ một số chủng B subtilis natto, B subtilis BS 62 và B licheniformis

CCRC1286 cho thấy phần lớn quá trình tinh sạch γ-PGA có áp dụng kết tủa bằng cồn và,

để giảm lượng cồn sử dụng trong quá trình tinh sạch, có phối hợp khai thác các kỹ thuật khác như ly tâm, lọc, tảy màu, tảy mùi là những phương pháp tinh sạch được sử dụng hiện nay [50, 92, 96]

Phương pháp của Ho và các cộng sự: đây là phương pháp này đã được dùng cho tinh sạch cho các phân tử γ-PGA trong dải 100-2500kDa [50]

Hình 1.4 Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Ho và các cộng sự [50]

Dịch lên men

Gia nhiệt đến 100oC thêm tỷ lệ 1:1 nước deion

Sau đó đem đi lọc thô loại bỏ than, celite và những cặn thô

Lọc tinh với màng siêu lọc 0,5μm để loại bỏ tế bào tự do

Phương pháp tinh sạch γ-PGA của Seong và các cộng sự [92]

Hình 1.5 Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Seong và các cộng sự [92]

Dịch lên men

Điều chỉnh pH đến 2 bằng HCl 4N

Li tâm 20phút, 6000v/ph; 4oC

Bổ sung cồn vào dịch theo tỷ lệ 3:1 để 24h

Li tâm 20phút, 6000v/ph; 4oC thu dịch nổi Loại phần cặn không tan

Điều chỉnh pH đến 7 bằng NaOH 6N

γ-PGA sạch

Li tâm 20phút, 6000v/ph; 4oC thu phần cặn tủa là PGA

Hòa tan với nước cất tỷ lệ 1:10

Bổ sung cồn vào dịch theo tỷ lệ 3:1 để 24h

Lọc thu kết tủa

Lọc thu kết tủa

Phương pháp của Goto và Kunioka [45]

Làm 3 lần

Dịch lên men

Ly tâm 20.000v/p 15 phút nhằm loại bỏ

tế bào Lấy phần nổi

Kết tủa bằng cồn 98% theo tỷ lệ cồn:

dịch = 4:1

Ly tâm 20.000v/p,15 phút thu kết tủa

Hòa kết tủa trong nước deion (dịch chứa γ-PGA)

Thẩm tách 4o

C trong 24h bằng nước deion

γ-PGA sạch Thêm 1 phần nước cất theo tỷ lệ 1:1

Hình 1.6 Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Goto và Kunioka [45]

Mỗi phương pháp tinh sạch này có những ưu nhược điểm riêng, nên trong nghiên cứu thực nghiệm tùy thuộc vào chủng vi sinh vật, đặc tính của γ-PGA để đưa ra được phương án tối

ưu, phù hợp với sản phẩm

Mẫu γ-PGA sau khi tinh sạch, được kiểm tra độ sạch bằng cách xác định hàm lượng protein, carbonhydrat Phương pháp đánh giá γ-PGA bằng cách thủy phân γ-PGA trong HCl 6N ở nhiệt độ 105oC trong thời gian 8h, sau đó đem đi trung hòa bằng NaOH1N, dịch thu được đem thẩm tích loại bỏ NaCl Dịch sau thủy phân γ-PGA là các monomer - axit glutamic, mẫu dịch này có thể sử dụng sắc ký lỏng cao áp là đánh giá chất lượng γ-PGA [9, 30, 34, 38, 53, 78, 86, 104]

1.8.3 Đánh giá cấu trúc và khối lượng phân tử của γ-PGA

1.8.3.1 Đánh giá cấu trúc bằng phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Đặc trưng phổ hồng ngoại (FTIR) của các nhóm cấu trúc là sự bộc lộ tương ứng của các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hoá học Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất hoá học được coi như chìa khóa nhận dạng các nhóm cấu trúc tương ứng và phương pháp phân tích phổ hồng ngoại cung cấp những thông tin quan trọng

về các dao động của các phân tử, từ đó xây dựng được mô hình cấu trúc của các phân tử Theo một số nghiên cứu về γ-PGA và cách sử dụng phổ hồng ngoại, γ-PGA được nhận dạng các nhóm chức: -OH (α- carboxylic), -NH và -CH được nhận dạng ở dải tần từ 3300 đến 3500 cm-1

; các nhóm chức -NH kéo dài được nhận dạng ở tần số 3300-3400 cm-1 peak đôi; nhóm chức -CH kéo dài trong -CH2 được nhận dạng ở tần số 2930-3080 cm-1

, nhóm chức -C=O kéo dài trong -COOH được đọc ở tần số ν = 1620cm-1, nhóm chức -OH nhánh của -COOH được nhận dạng ở tần số ν = 1400 và 987 cm-1

, còn nhóm amit -CONH để đánh giá mức độ kéo dài của phân tử được đọc ở tần số ν = 1650 đến 1715 cm-1

[50, 74, 84,

95, 115]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NMR) là một kỹ thuật sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ, cho biết được số proton có trong phân tử Số proton sẽ quyết định tính chất của hợp chất, vì thế sẽ có độ dịch chuyển khác nhau trên phổ proton Người ta sử dụng tetra methyl silan làm chất chuẩn trong phổ proton và độ dịch chuyển hóa học của proton trong tetra methyl silan được chọn là pmm Tùy từng vị trí mà H gắn vào trong các cấu trúc hóa học mà độ dịch chuyển của proton khác nhau Đối với γ-PGA do có tính chất tan trong nước nên 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodimide hydrocloride như một tác nhân ngưng tụ Phổ H-NMR phát hiện ra các gốc CH2 đính ở vị trí gamma ở độ dịch

chuyển hóa học là 2,45-2,55 ppm và các gốc CH2 bậc 1 ở d = 3,25-3,40 và CH2 ở vị trí anpha ở d = 4,25 – 4,40 vị trí beta của nhóm CH2 ở 2,08 [49, 71, 83, 93, 107, 114]

1.8.4 Xác định khối lượng phân tử γ-PGA

1.8.4.1 Phương pháp điện di SDS-PAGE

Có thể sử dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide) của Laemmli để điện di xác định khối lượng phân tử của γ-PGA [43] Việc phân ly dựa trên độ lớn và hình thái các chất trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử cần dịch chuyển về phía cực dương với tốc độ tỉ lệ nghịch với khối lượng phân tử

Vì vậy, các phân tử có khối lượng càng lớn thì dịch chuyển càng chậm sau một khoảng thời gian dịch chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân tử có kích thước (trọng lượng) khác nhau sẽ dịch chuyển tách xa vị trí ban đầu và phân bố tại những khoảng khác nhau ,

do đó chúng phân bố tách biệt nhau ra Sau đó ta có thể phát hiện được chúng nhờ kỹ thuật nhuộm Trong kỹ thuật này cần chú ý trong việc sử dụng chất nhuộm màu là xanh methylen [13, 16, 43, 128] Thông thường kỹ thuật này được sử dụng đối với các γ-PGA

có khối lượng phân tử từ 100-1000 kDa, bởi các macker đối chiếu thường có giới hạn Các kết quả sau khi điện di γ-PGA bằng kỹ thuật này thường thể hiện dưới dạng các dải, bởi γ-PGA là một hỗn hợp nhiều loại khối lượng phân tử và không chạy thành các băng rõ nét như protein Hình 1.3 là một kết quả nghiên cứu về khối lượng phân tử của γ-PGA tạo

thành từ vi khuẩn B subtilis IFO3335 [128]

Hình 1.7 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE xác định khối lượng phân tử γ-PGA [128]

M: Marker hiển thị; các mẫu được đo ở thời điểm 36; 42 96 h

1.8.4.2 Phương pháp sắc ký thấm gel

Sắc ký thấm gel– Gel Permeation Chromatography (GPC) là một phương pháp sắc ký rây phân tử (size exclusion chromatography - SCE), chia tách các chất phân tích dựa trên cơ sở kích thước của chất phân tích Kỹ thuật này thường được dùng trong phân tích polymer

Sắc ký lọc gel dựa trên nguyên tắc loại trừ theo kích thước, các thành phần hỗn hợp mẫu phân tử polymer sau khi đi qua cột sắc ký gel, polymer có khối lượng phân tử lớn ra trước, polymer có khối lượng phân tử nhỏ ra sau Trong sắc ký lọc gel quan trọng nhất là pha động, vì pha động càng hòa tan tốt các phần tử polymer thì khả năng phân tách qua cột sắc

ký càng tốt Thông thường pha động sử dụng cho các polymer được sử dụng là tetrahydrofuran (THF), toluene, dimethylacetamide và dimethylformamide Trong những trường hợp có điều kiện về thiết bị các polymer có thể định lượng bằng cách ghép hệ thông sắc ký lọc gel với hệ thống sắc ký lỏng cao áp sử dụng detector cực tím

Khi phân tích đặc tính của một polymer bằng phương pháp sắc ký lọc gel (GPC) cho biết khối lượng phân tử, khối lượng phân tử trung bình của polymer (Mn), khối lượng phân tử trung bình có tính đến phân bố mole của các polymer có khối lượng khác nhau (Mw), kích thước trung bình phân tử (Mz) và độ nhớt trung bình của phân tử (Mv) [14, 17, 86, 106, 128]

1.9 Ứng dụng γ-PGA

Axit poly γ-glutamic có bản chất là polymer có khả năng phân hủy sinh học, không độc với

con người, có thể ăn được, có thể tạo muối với kim loại và không bị phân cắt bởi protease Chính nhờ những đặc điểm cơ bản này mà γ-PGA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau và trong nhiều năm trở lại đây đã có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới được tiến

hành với mục đích thu được hàm lượng γ-PGA cao nhất từ vi khuẩn Bacillus [5, 19, 32, 44]

Axit poly γ-glutamic có nhiều ứng dụng trong thực phẩm, y tế, môi trường, nông nghiệp và một số ngành công nghiệp khác Việc nghiên cứu và sản xuất γ-PGA ở Việt Nam là một công trình mới, nếu thành công sẽ mở ra một hướng phát triển trong việc sản xuất phụ gia thực phẩm quy mô công nghiệp để thay thế cho một số phụ gia có nguồn gốc hóa học hiện nay[50, 95]