Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng. Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm. Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, ... Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác. Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…. Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”. Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được: 1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; 2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm; 3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học.

FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Trần Thị Ái Luyến NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HUẾ - NĂM 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan polysaccharide 1.1.1 Giới thiệu chung polysaccharide 1.1.2 Ứng dụng polysaccharide 1.2 Tổng quan Lactobacillus fermentum 1.3 Tổng quan exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Đặc điểm phân loại số đặc tính lý hóa 1.3.3 Tính chất chức ứng dụng 14 1.4 Tình hình nghiên cứu exopolysaccharide từ LAB 20 1.4.1 Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS .20 1.4.2 Về trình tách chiết tinh chế EPS 23 1.4.3 Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết cấu trúc .24 1.4.4 Về tính chất cơng nghệ tác dụng sức khỏe 34 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 3.1 Đối tượng nghiên cứu 37 3.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ .37 2.2.1 Hóa chất 37 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 37 3.3 Phương pháp nghiên cứu .38 2.3.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn phương pháp đo mật độ quang (OD) 38 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] 38 2.3.3 Phương pháp thu nhận tách EPS 39 2.3.4 Sơ đồ tổng thể phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ số chủng Lb fermentum 40 2.3.5 Xác định hàm lượng EPS phương pháp phenol-sulfuric [37] 43 2.3.6 Xác định hàm lượng nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl [5] 44 iv 2.3.7 Phương pháp khảo sát số tính chất có tiềm ứng dụng cơng nghệ thực phẩm 45 2.3.8 Phương pháp xác định khối lượng phân tử đặc điểm cấu trúc EPS 47 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu .50 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 52 3.1 Kết nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ số chủng Lb fermentum 52 3.1.1 Kết tuyển chọn số chủng Lb fermentum sinh tổng hợp EPS cao 52 3.1.2 Kết khảo sát ảnh hưởng thành phần mơi trường lên q trình sinh tổng hợp EPS từ chủng Lb fermentum tuyển chọn 54 3.1.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp EPS chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 66 3.1.4 Kết khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men 82 3.2.1 Khả hòa tan nước 89 3.2.2 Khảo sát khả giữ nước giữ dầu 91 3.2.3 Khả chống oxy hóa 95 3.3 Kết phân tích khối lượng phân tử số đặc điểm cấu trúc EPS sinh tổng hợp từ Lb fermentum MC3 99 3.3.1 Khối lượng phân tử 99 3.3.2 Đặc điểm cấu trúc EPS-MC3 .103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128 Kết luận 128 Kiến nghị 130 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN ĐÃ CƠNG BỐ 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 133 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tổng quan số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ lồi Lactobacillus cơng bố 22 Bảng 1.2 Thông tin cấu trúc phương pháp NMR tương ứng 27 Bảng 1.3 Tổng quan nghiên cứu cấu trúc EPS sinh tổng hợp từ LAB công bố .29 Bảng 1.4 Tổng quan nghiên cứu liên quan đến sức khỏe EPS sinh tổng hợp từ LAB công bố 35 Bảng 2.1 Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu thiết bị sắc ký GC-MS 50 Bảng 3.1 Điều kiện thu nhận EPS cao chủng Lb fermentum nghiên cứu luận án .81 Bảng 3.2 Các điều kiện tách EPS từ dịch ni cấy thích hợp chủng Lb fermentum luận án 89 Bảng 3.3 Độ hòa tan nước EPS từ chủng Lb fermentum 90 Bảng 3.4 Khả giữ nước EPS từ chủng Lb fermentum 92 Bảng 3.5 Khả giữ dầu EPS từ chủng Lb fermentum 93 Bảng 3.6 Tỷ lệ bắt gốc tự DPPH (%) EPS thu từ chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) 96 Bảng 3.7 Các dẫn xuất monosaccharide thu từ EPS sinh tổng hợp Lb fermentum MC3 103 Bảng 3.8 Tỷ lệ, thành phần (%) monosaccharide cấu trúc EPS sinh tổng hợp Lb fermentum MC3 103 Bảng 3.9 Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu liên kết glycoside tương ứng EPS sinh tổng hợp Lb fermentum MC3 110 Bảng 3.10 Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR 13C – NMR EPS-MC3 đo DMSO .118 Bảng 3.11 Các dạng liên kết cấu trúc EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC 119 Bảng 3.12 Đặc điểm cấu trúc EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus công bố EPS-MC3 luận án 123 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc dạng vòng cạnh -pyranose (a) glucose cạnh -furanose (b) fructose Hình 1.2 Hình dạng khuẩn lạc Lb fermentum Hình 1.3 Cấu trúc dạng mạch thẳng (a) mạch nhánh (b) HoPS Hình 1.4 Mơ hình q trình sinh tổng hợp glucan fructan Hình 1.5 Sơ đồ phân loại đặc điểm cấu tạo HoPS sinh tổng hợp từ LAB .9 Hình 1.6 Cấu trúc dạng mạch thẳng (a) mạch nhánh (b) HePS 10 Hình 1.7 Sơ đồ trình sinh tổng hợp HePS tế bào LAB 11 Hình 1.8 Cấu tạo UDP-glucose TDP-glucose, TDP-rhamnose UDPglactose 12 Hình 1.9 Sơ đồ phân loại đặc điểm cấu tạo HePS sinh tổng hợp từ LAB 14 Hình 1.10 Sơ đồ biểu diễn tính chất tăng cường sức khỏe EPS từ LAB 15 Hình 2.1 Sơ đồ ni cấy thu nhận sinh khối 38 Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận tách EPS .39 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS 40 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu số tính chất có tiềm ứng dụng cơng nghệ thực phẩm .45 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside 48 Hình 2.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS 49 Hình 3-1 Khả sinh tổng hợp EPS số chủng vi khuẩn lactic 53 Hình 3.2 Ảnh hưởng nguồn carbon nồng độ bổ sung chúng vào môi trường MRS đến khả tổng hợp EPS chủng Lb fermentum 55 Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn N nồng độ bổ sung chúng vào MTTH đến khả tổng hợp EPS chủng Lb fermentum .61 Hình 3.4 Ảnh hưởng mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên trình sinh tổng hợp EPS chủng Lb fermentum 66 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH ban đầu lên trình sinh tổng hợp EPS chủng Lb fermentum 69 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy lên q trình sinh tổng hợp EPS chủng Lb fermentum 72 vii Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến trình sinh tổng hợp EPS chủng Lb fermentum 77 Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ TCA bổ sung lên khả loại bỏ protein lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC13 .83 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ TCA bổ sung lên khả loại bỏ protein lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC16 .83 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ TCA bổ sung lên khả loại bỏ protein lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC21 .83 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ TCA bổ sung lên khả loại bỏ protein lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum MC3 84 Hình 3.12 Ảnh hưởng thể tích ethanol so với dịch đến khả tách EPS 87 Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian tủa ethanol lên khả tách EPS .88 Hình 3.14 Sắc kí đồ khối lượng phân tử EPS-MC3 phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 100 Hình 3.15 Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR 111 Hình 3.16 Phổ 1H-NMR EPS-MC3 .112 Hình 3.17 Phổ 13C-NMR EPS-MC3 113 Hình 3.18 Phổ HSQC (a, b, c) EPS-MC3 .116 Hình 3.19 Phổ đồ COSY EPS-MC3 .117 Hình 3020 Phổ đồ HMBC EPS-MC3 .118 Hình 3.21 Phổ đồ NOESY EPS-MC3 119 Hình 3.22 Các đơn vị lặp lại cấu trúc EPS-MC3 thủy phân phần 120 viii MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên nhiều lĩnh vực tăng lên dẫn đến phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn Nhiều vi khuẩn tổng hợp polysaccharide (PS) ngoại bào tiết chúng bên ngồi mơi trường [115] Các PS tách chiết có đa dạng cấu trúc tính chất chức Chính vậy, nguồn EPS ngày sử dụng rộng rãi công nghệ thực phẩm mỹ phẩm Chúng tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, Hơn nữa, gần đây, hoạt tính sinh học khác liên quan đến EPS khả chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có nhiều đóng góp quan trọng cơng nghiệp y học EPS từ vi khuẩn tồn nhược điểm suất thu nhận thấp Đây lý khiến khả thương mại hóa EPS từ vi khuẩn nói chung từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng hạn chế Từ LAB "công nhận vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện trình thu nhận, tách chiết EPS coi phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng thực phẩm [59] Nhiều chủng LAB biết đến nguồn sản xuất EPS – với tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc sản phẩm lên men sữa chua, phomat, Bên cạnh đó, nhờ đặc điểm đa dạng cấu trúc an toàn sức khỏe người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) quan tâm nhiều so với EPS từ loài khác Nhiều nghiên cứu kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết cấu trúc tính chất có tiềm ứng dụng EPS sinh tổng hợp chủng thuộc LAB khác phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],… Như vậy, đa dạng cấu trúc loài vi khuẩn khác liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần chất dinh dưỡng trình lên men điều kiện nuôi cấy thu nhận Sự đa dạng tạo nên ảnh hưởng khơng nhỏ đến hoạt tính sinh học tính chất chức cơng nghệ thực phẩm Chính vậy, để nâng cao hiệu thu nhận EPS đặc biệt cung cấp số thơng tin chi tiết đặc tính cấu trúc EPS sinh tổng hợp từ chủng LAB nói chung số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc tính chất exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum” Với đề tài luận án này, xác định được: 1) Điều kiện thu nhận EPS từ số chủng Lb fermentum hiệu nhất; 2) Một số tính chất có tiềm ứng dụng cơng nghệ thực phẩm; 3) Một số thông tin phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết số EPS tách chiết từ chủng vi khuẩn nghiên cứu Với đặc tính phát hiện, chúng tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng y dược, thực phẩm thay cho hợp chất tổng hợp hóa học CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan polysaccharide 1.1.1 Giới thiệu chung polysaccharide Polysaccharide (PS) polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate thường coi polyme sinh học đa với chức biết đến nguồn lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững cho thực vật động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide vi sinh vật), [29] Trong chuỗi PS, monosaccharide liên kết với liên kết glycoside Sự khác PS thường liên quan đến monosaccharide cấu tạo nên chúng Các PS chứa loại monosaccharide gọi homopolysaccharide homoglycan Các PS chứa nhiều loại monosaccharide gọi heteropolysaccharide heteroglycan Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng cấu tạo nguyên tử oxy, hydro, carbon Sự phân loại monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, cạnh dạng mạch hở Các PS thường tạo nên đơn vị lặp lại, bao gồm nhiều monosaccharide phổ biến tự nhiên thường có cấu trúc vòng cạnh (pyranose) Các monosaccharide có cấu trúc dạng α β Trong đó, dạng β-D-glucopyranose phổ biến β-D-glucopyranose chuyển đổi lẫn tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a) Ngồi ra, vòng cạnh (furanose) coi thành phần có vai trò quan trọng mặt sinh học (Hình 1.1b) chúng có mặt acid nucleic số PS từ vi sinh vật b) a) Hình 1.1 Cấu trúc dạng vòng cạnh -pyranose (a) glucose cạnh -furanose (a) (b) (b) fructose [29] Trong năm gần đây, nhiều loại PS có vai trò quan trọng y học thương mại thu nhận từ trình lên men vi sinh vật Các PS sinh tổng hợp từ loài vi sinh vật gây bệnh khơng gây bệnh Trong đó, PS tổng hợp từ lồi vi sinh vật khơng gây bệnh khai thác chúng có nhiều ứng dụng quan trọng công nghiệp công nghệ sinh học với tính chất độc đáo lạ tạo gel, khả tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học, Một số PS phổ biến thu nhận từ vi sinh vật kể đến (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan lentinan (từ nấm); (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - glucan thương mại từ nấm men bia [67] 1.1.2 Ứng dụng polysaccharide Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp góp phần giúp hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,… Trong công nghệ thực phẩm: Các PS sử dụng chất phụ gia bổ sung vào q trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hồn thiện cấu trúc thực phẩm từ làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt, từ tạo nên ổn định nhũ tương giúp ngăn chặn tượng tách nước số sản phẩm có chất cấu trúc gel đặc biệt sữa chua [67] Trong dược phẩm: PS coi vật liệu sinh học phổ biến Chúng đóng góp vai trò quan trọng cho trình phát triển sản phẩm dược phẩm ứng dụng y tế chất kết dính đơn giản phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114] Trong công nghệ sinh học phòng thí nghiệm: Nhờ đặc tính tạo màng film, tạo gel khả gắn ion giúp cho PS sử dụng công cụ vô giá công nghệ sinh học cơng tác nghiên cứu phòng thí nghiệm Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho khuẩn lạc vi khuẩn phát triển; sử dụng PS hòa tan, khơng hòa tan dẫn xuất chúng giúp cố định protein, cố định enzyme tế bào động vật sử dụng dextran pullulan làm chất ... chung số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tơi thực đề tài Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc tính chất exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum Với đề tài luận... tương ứng 27 Bảng 1.3 Tổng quan nghiên cứu cấu trúc EPS sinh tổng hợp từ LAB công bố .29 Bảng 1.4 Tổng quan nghiên cứu liên quan đến sức khỏe EPS sinh tổng hợp từ LAB công bố ... 1.4 Tình hình nghiên cứu exopolysaccharide từ LAB Trong thập kỷ qua, có nhiều nghiên cứu giới EPS sinh tổng hợp từ LAB công bố [18], [22], [29] Những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tối