Tóm tắt Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xác định được điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, đồng thời xác được một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NĂM 2019

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học khoa học, Đại học Huế

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Thị Bích Thủy

Phản biện 1: PGS TS Vũ Đình Hoàng – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Phản biện 2: PGS TS Lý Nguyễn Bình – Trường Đại học Cần Thơ

Phản biện 3: PGS TS Phạm Xuân Núi – Trường Đại học Mỏ - Địa chất Hà Nội

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115] Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp Đây là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung

và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích

để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59] Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat, Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic

(LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide,

vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…

Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng

Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”

Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được

điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum hiệu quả

nhất; khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, đồng thời xác được một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về polysaccharide

1.1.1 Giới thiệu chung về polysaccharide

1.1.2 Ứng dụng của polysaccharide trong công nghiệp

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus fermentum

1.3 Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

1.3.1 Khái niệm

1.3.2 Phân loại và tính chất lý hóa của exopolysaccharide 1.3.3 Tính chất chức năng và ứng dụng của EPS

1.4 Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB

1.4.1 Về điều kiện nuôi cấy

1.4.2 Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS

1.4.3 Về đặc tính hóa lý của EPS

1.4.4 Tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD)

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối

2.3.3 Phương pháp thu nhận và tách EPS

2.3.4 Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum 2.3.5 Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – sulfuric

2.3.6 Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ

một số chủng Lb fermentum

3.1.1 Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb fermentum sinh tổng hợp EPS cao

Hình 3.1 Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic

(Trong đó: - TC12: Lb fermentum TC12 - TC20: Lb fermentum TC20

100,768 b

56,581 f

88,776 c 58,939 69,508 ef d

Kết quả Hình 3.1 cho thấy, các chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21 và Lb fermentum MC2, MC3) và Lb fermentum

MC3 có khả năng sinh tổng hợp tốt hơn so với các chủng còn lại

Từ kết quả này, bốn chủng được chúng tôi lựa chọn để tiến

hành các nghiên cứu tiếp theo trong luận án sẽ là Lb fermentum

(TC13, TC16, TC21, MC3)

3.1.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh EPS của các chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)

3.1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng

Kết quả từ Hình 3.2 cho thấy rằng, quá trình sinh tổng hợp

EPS của Lb fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 xảy ra tốt

hơn khi bổ sung các loại đường với nồng độ tương ứng lần lượt

là 4% glucose, 3% sucrose, 4% lactose và 4% glucose

0 50 100 150 200 250

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào

môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum

* Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.1

3.1.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng

Lượng EPS sinh tổng hợp đạt cao nhất bởi các chủng Lb

fermentum TC16, TC21 đều ở trong môi trường chứa 0,8% cao thịt

và ở nồng độ cao nấm bổ sung là 0,4% cho chủng Lb fermentum

TC16 và 0,3% cho chủng Lb fermentum MC3 (Hình 3.3)

3.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng

hợp EPS của các chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3

3.1.3.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu

Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất đối với các chủng Lb

fermentum TC16, TC21, MC3 khi mật độ tế bào nuôi cấy ban

đầu là 106 cfu/ml và của chủng Lb fermentum TC13 là 107 cfu/ml

(Hình 3.4)

Các chủng L

fermentum

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào

MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum

* Các mức 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ pepton, cao thịt là

0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1,0% và cao nấm là 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%;

0,5% bổ sung vào MTTH

3.1.3.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu

Lượng EPS sinh ra của các chủng Lb fermentum TC16,

TC21, MC3 đều đạt cực đại tại pH 6,0 và tại pH 5,5 đối với chủng

TC13 (Hình 3.5)

3.1.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Hình 3.4 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ĐC

Kết quả Hình 3.6 cho thấy, quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khảo sát đều xảy ra tốt trong khoảng nhiệt độ

từ 35 – 40 oC

3.1.4 Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian lên men

Lượng EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb fermentum

TC13, TC16, MC3 đạt cực đại sau 48 giờ lên men và sau 36 giờ

lên men với chủng Lb fermentum TC21 Thời điểm EPS tổng

hợp được đạt cực đại cũng chính là thời điểm mà giá trị OD của môi trường đạt được là cao nhất

Kết quả Hình 3.7 cũng chỉ ra những mối quan hệ nhất định giữa hàm lượng EPS tổng hợp được, OD và pH của môi trường trong suốt thời gian lên men

Kết luận 1 :

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Bảng 3.1 Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb

fermentum nghiên cứu trong luận án

so với MRS (%)

Thành phần môi

trường

Mật

độ tế bào nuôi cấy ban đầu (cfu/m l)

pH ban đầu

Nhiệt

độ nuôi cấy ( o C)

Thời gian lên men (giờ)

Nguồn

C

Nguồn

N TC13 4% glc 0,4%

cao nấm

3.1.5 Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men

3.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên khả năng loại bỏ protein

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ

protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC13

Kết quả trên các Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy, khi nồng

độ TCA bổ sung vào tăng lên, lượng protein còn lại trong dịch nuôi cấy đều có xu hướng giảm dần

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ

protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC21

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ

protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum MC3

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ

protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC16

3.1.5.2 Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS

Lượng EPS thu được từ các dịch nổi của các chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đạt tốt nhất khi tỉ lệ dịch

nổi và EtOH là 1:1 (Hình 3.12)

3.1.5.3 Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS

Kết quả từ Hình 3.13 cho thấy thời gian áp dụng thích hợp

và hiệu quả để thu EPS tủa bằng EtOH trong quá trình tách chiết

EPS từ dịch nổi là 24 giờ

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến

Tỉ lệ dịch nổi:

ethanol (v/v)

Thời gian tủa bằng Ethanol (giờ)

Hiệu suất thu nhận tăng (%)

năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

3.2.1 Khả năng hòa tan trong nước

Bảng 3.3 Độ hòa tan trong nước của EPS

Các EPS thu được từ các chủng Lb fermentum (TC13,

TC16, TC21, MC3) đều có khả năng hòa tan trong nước rất tốt

3.2.2 Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu

Kết quả Bảng 3.4 cho thấy rằng, EPS thu được từ các chủng

Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng giữ nước

tốt

Khả năng giữ dầu tương ứng của các EPS từ các chủng Lb

Fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 thể hiện ở Bảng 3.5 Bảng 3.4 Khả năng giữ nước của EPS từ các chủng Lb

3.2.3 Khả năng chống oxy hóa

Bảng 3.6 Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được

TC21

MC3

EPS-Nồng độ (mg/mL)

Hoạt lực chống oxy hóa (%)

0,52

27,34 ± 0,32

67,41 ± 0,30

47,66 ±

27,05 ± 0,12

0,37

35,95 ± 0,52

78,99 ± 0,30

68,05 ±

58,3 ± 0,17

Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy, các EPS sinh tổng hợp từ 4

chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng

chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa tăng dần theo chiều tăng của nồng độ EPS và sự thay đổi này là không giống nhau khi so sánh giữa các EPS từ các chủng khác nhau

3.3 Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm

về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb fermentum MC3

3.3.1 Khối lượng phân tử

EPS sinh tổng hợp từ Lb fermentum MC3 có khối lượng

phân tử khoảng 98,5 kDa (Hình 3.14)

3.3.2 Đặc điểm về cấu trúc của các EPS

- Thành phần monosaccharide của các EPS

Bảng 3.7 Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh

Khối lượng trung bình (kDa)

Hình 3.14 Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng

phương pháp sắc ký thẩm thấu gel

Kết quả Bảng 3.7 cho thấy thành phần monosaccharide tương ứng trong cấu trúc của EPS-MC3 gồm D-glucose, D-mannose

Dữ liệu Bảng 3.8 thể hiện tỷ lệ và thành phần phần trăm của các monosacharide có trong cấu trúc của EPS-MC3

Bảng 3.8 Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu

trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3

STT Thành phần Tỷ lệ Thành phần (%)

- Xác định vị trí liên kết glycoside trong các EPS bằng GC-MS

Bộ khung của EPS-MC3 sinh tổng hợp được có dạng glucan với hai liên kết chủ yếu là (1→6) glucoside và (1→3) mannoside (Bảng 3.9)

manno-Bảng 3.9 Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide

thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp

- Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3

Kết quả phân tích phổ NMR thể hiện ở hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18, hình 3.19, hình 3.20, hình 3.21

Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của EPS-MC3 cho thấy, trong vùng từ  4,5 đến  4,9 có sự hiện diện của 2 thành phần đường thông qua các tín hiệu đặc trưng của hai proton anomer ở

độ chuyển dịch 4,87 ppm và 4,55 ppm; các proton của nhóm methyl từ H 3,00 đến 3,62 ppm (Hình 3.16) Hai monosaccharide này được chúng tôi kí hiệu là A và B theo chiều giảm dần của độ chuyển dịch hóa học Từ giá trị về độ chuyển dịch của proton anomer trong 1H NMR, cấu trúc của EPS-MC3 chỉ chứa liên kết glycoside dạng β-pyranose [9]

O-Hình 3.17 Phổ 13C-NMR của EPS-MC3

Hình 3.16 Phổ 1 H-NMR của EPS-MC3

Kết quả ở Hình 3.17 của phổ 13C –NMR cho thấy EPS-MC3

có sự xuất hiện của hai tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học là 94,1 và 94,0 ppm và các vùng carbon trong mạch vòng của nó từ 61,5 đến 77,2 ppm Kết hợp các kết quả công bố trước đây [9], [41], [49], [108] và từ phổ 1H, 13C-NMR của EPS-MC3 có tín hiệu carbon anomer ở  94,1 nên có thể được quy cho là của β-D-mannopyranose và tín hiệu ở C1 94,0 sẽ là β-D-glucopyranose

Các đỉnh của đường cắt ngang trong phổ HSQC giúp xác định được vị trí của các phân tử carbon anomer và proton anomer trong cấu trúc dạng vòng từ 1 đến 6 của chúng (Hình

c)

Hình 3.18 Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3

b) a)

3.18) Điều này cho phép xác định vị trí của proton nối với

nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3

Những tương tác 1H → 1H trong phổ COSY đã chỉ ra các tương tác giữa các proton của carbon cận kề nhau trong cấu trúc

EPS-MC3 sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3 Từ đó cho

phép thiết lập trật tự liên kết carbon trong các thành phần đường tương ứng trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3 là (Hình 3.19)

Bảng 3.10 Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO

COSY và HSQC, chúng tôi đã xác định được độ chuyển dịch hóa

học của các thành phần đường trong EPS-MC3 (Bảng 3.10)

Các tương tác của proton anomer và các nguyên tử C trên

phổ HMBC (Hình 3.20) và NOESY (Hình 3.21) đã chỉ ra các mối

liên kết glycoside trong cấu trúc của EPS-MC3 tương ứng là

A(1→3)B và B(1→6)A Thông tin này cho phép chúng tôi định

A: H 1 với B: H 3 A: H 1 với B: C 3 (1→3)-β-D-

mannopyranoside

B: H 1 với A: H 6 B: H 1 với A: C 6

Từ kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phân

tích thành phần monosacharide của EPS-MC3 cho phép sắp xếp

Hình 3.20 Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 Hình 3.21 Phổ đồ NOESY của EPS-MC3