Nghiên cứu thành phần hóa học của loài nấm vân chi (trametes versicolor) ứng dụng trong thực phẩm chức năng

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒ SƠ BÁO CÁO Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA LỒI NẤM VÂN CHI (Trametes versicolor) ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Mã số đề tài: 184.TP11 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngần Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh - 2018 BỘ CÔNG THƢƠNG CỘNG HÕA X HỘI CHỦ NGH A VIỆT NAM TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TP HCM Đ c Lập – Tự Do – H nh Ph c Viện Cơng nghệ sinh học thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 12 năm 2019 BẢN TỰ NHẬN XÉT VỀ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học loài nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức Mã số: 184.TP11 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngần Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Cơng nghệ sinh học thực phẩm Thời gian thực (Bắt đầu – Kết thúc): 1/2018 đến 1/2019 Tổng kinh phí thực đề tài: 45 triệu đồng Trong đó, kinh phí từ NSNN: 35 triệu đồng Nhận xét kết thực Đề tài so với Hợp đồng: 7.1/ Về mức độ hồn thành khối lƣợng cơng việc: - Đã hồn thành đầy đủ nội dung cơng việc đề tài với sản phẩm đăng ký - Sản phẩm dạng 1: 10 gam bột hòa tan chứa hoạt tính sinh học - Sản phẩm dạng 2: Thành phần hóa học Trametes versicolor Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ Trametes versicolor Quy trình chiết tách ứng dụng vào thực phẩm - Sản phẩm dạng 3: đăng hai báo tạp chí Tạp chí Khoa học Cơng nghệ (Trƣờng Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh - Sản phẩm đào tạo: sinh viên đại học bảo vệ đồ án tốt nghiệp thành công ( tháng 5/2018) 7.2/ Về yêu cầu khoa học tiêu sản phẩm KHCN Đề tài: - Các sản phẩm loại 1, 2, 3, sản phẩm đào tạo đạt yêu cầu theo tiêu đăng ký 7.3/ Về tình hình sử dụng kinh phí Đề tài: Đã sử dụng số tiền đƣợc tạm ứng đợt để mua hoá chất, nguyên vật liệu cho nghiên cứu đề tài Nhóm nghiên cứu chủ động tạm ứng trƣớc kinh phí đợt để thực nội dung đề tài 7.4/ Các nhận xét khác trình thực kết Đề tài: Trong trình thực đề tài, nhóm nghiên cứu nghiêm túc thực nội dung nghiên cứu Do vài yếu tố khách quan, tiến độ thực gia hạn thêm tháng Ngày 23 tháng 12 năm 2019 Ngƣời tự nhận xét Nguyễn Thị Ngần BỘ CÔNG THƢƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƢỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học lồi nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức Mã số đề tài: 184.TP11 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngần - Đơn vị thực hiện: Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm Tp Hồ Chí Minh, 2019 LỜI CÁM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu thực đề tài, nhóm nghiên cứu nhận đƣợc nhiều hỗ trợ từ phía nhà trƣờng, ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học –Thực phẩm, đồng nghiệp môn Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn đến nhà trƣờng, Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm tạo điều kiện thời gian phòng thí nghiệm, dụng cụ, thiết bị hóa chất để thực khảo sát đề tài Chúng xin chân thành cảm ơn thầy Trịnh Ngọc Nam cô Đàm Sao Mai dành thời gian góp ý hỗ trợ nhóm nghiên cứu quy trình thực kinh nghiệm xử lý tình phát sinh đề tài Mặc dù cố gắng hoàn thành tốt báo cáo nhiên trình thực khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong nhận đƣợc góp ý quý báu thành viên Hội Đồng Chúng xin chân thành cảm ơn! NHĨM NGHIÊN CỨU PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thông tin tổng quát 1 Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học lồi nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức Mã số: 184.TP11 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) TS Nguyễn Thị Ngần Viện Công Nghệ Sinh Chủ nhiệm đề tài thực Học & Thực Phẩm nội dung sau: - Tổng quan nấm Vân chi (Trametes versicolor) - Thu mẫu - Nghiên cứu phƣơng pháp phân - Phân lập chất từ mẫu nấm lập chất - Viết đăng tạp chí trƣờng -Báo cáo tổng kết đề tài TS Nguyễn Ngọc Tuấn Viện Công Nghệ Sinh Thành viên tham gia thực Học & Thực Phẩm nội dung sau: - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc - Thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc - Tạo đƣợc sản phẩm dạng bột hòa tan - Viết đăng tạp chí trƣờng Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 06 năm 2019 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 06 năm 2019 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng thay đổi nội dung so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: 35 triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Nấm vân chi (Trametes) thuộc họ Polyoracaea, mọc vùng ôn đới Bắc Mỹ, Á châu Âu châu có lẽ loại nấm mọc mạnh, phát triển khắp vùng Bắc Bán cầu Ở Việt Nam, nấm vân chi mọc chủ yếu khu vực phía Bắc Bắc Trung Bộ.Nấm vân chi dƣợc thảo quý truyền thống Phƣơng Đông, tác dụng nấm đƣợc xác minh lâm sàng qua hàng ngàn năm Trong tài liệu đƣợc để lại từ ký 15 mô tả cụ thể tác dụng nấm nhƣ tiếp thêm sinh lực sống, tăng tuổi thọ cho thể đặc biệt sau dùng thuốc kéo dài Hiện chúng đƣợc sử dụng để điều trị bệnh ung thƣ, giải độc tác hại q trình điều trị hóa trị xạ trị, tăng cƣờng khả miễn dịch, giảm nguy di căn, giảm loại nhiễm trùng thứ cấp, tạo điều kiện thuận lợi cho phục hồi chức tăng tỉ lệ sống, ức chế phát triển virut HIV… Mặc dù vậy, có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi chi Trametes chủ yếu tập trung nghiên cứu Trametes versicolor (Turkey Tail), Trametes cubensis Trong loài nấm này, nhà khoa học tìm thấy lớp chất polysaccarit có khả tăng cƣờng hệ miễn dịch thể ngƣời, hỗ trợ việc điều trị ung thƣ, điều trị khối u ác tính, ngồi ra, lớp chất nấm vân chi cịn có khả chống lại virut HIV Ngồi hợp chất có khối lƣợng lớn, hợp chất chuyển hóa thứ cấp có khối lƣợng nhỏ nhƣ terpenoit, flavonoid, phenlic…cũng đƣợc tìm thấy nấm vân chi, hợp chất có khả kháng ung thƣ, kháng khối u hay kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm… Ở Việt Nam có vài cơng trình nghiên cứu nấm vân chi, tập trung chủ yếu vào lớp chất polysaccarit, thành phần hóa học khác nấm vân chi có 1, cơng trình, có cơng trình công bố năm 2015 Trên thị trƣờng nay, nấm vân chi chủ yếu đƣợc bán dƣới dạng nấm thơ bên cạnh có số thực phẩm chức đƣợc bào chế từ nấm vân chi (Trametes versicolor) bán thị trƣờng, sản phẩm dùng để hỗ trợ điều trị ung thƣ, viêm gan, tăng cƣờng hệ miễn dịch đƣợc sản xuất nƣớc Những thƣc phẩm chức chủ yếu sử dụng hoạt tính lớp chất polysaccarit trong nấm vân chi Chính tác dụng lớn nấm vân chi sức khỏe ngƣời tình hình sử dụng điều trị bệnh chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học lồi nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức năng” Mục tiêu a Mục tiêu tổng quát: thành phần hóa học lồi nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức b Mục tiêu cụ thể: - Tìm dung mơi thích hợp để chiết hỗn hợp chất từ thể nấm Vân chi (Trametes versicolor); - Sử dụng phƣơng pháp sắc ký để phân lập hợp chất từ dịch chiết hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc; - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập đƣợc - Ứng dụng hợp chất có hoạt tính sinh học vào thực phẩm dƣới dạng bột hòa tan, sirup viên nén Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp thu mẫu Mẫu nấm Vân chi (Trametes versicolor) đƣợc thu hái từ Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An Mẫu thể nấm Vân chi đƣợc thu hái vào thời điểm thích hợp năm Vận chuyển mẫu đƣờng hàng không vào TPHCM Mẫu nấm tƣơi đƣợc rửa làm khô nhiệt độ 30-40o C Mẫu Nấm sau khô đem xay nhỏ Bột mẫu bảo quản túi PE hút chân không, tối màu, điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm, khơng tiếp xúc ánh sáng mặt trời Phƣơng pháp xác định tiêu hóa lý Đ ẩm mẫu Phƣơng pháp: Độ ẩm hàm lƣợng chất khô đƣợc xác định lần (5g) phƣơng pháp sấy mẫu đến trọng lƣợng không đổi 103 ± 20C với thiết bị sấy hồng ngoại hãng Scaltec (Đức) Kết quả: Độ ẩm mẫu nấm Vân chi: W (%) = 13.4 ±1.21 (phụ lục B) Bảng 3.1 Kết hàm lƣợng chất có nấm Vân chi Chỉ tiêu phân tích Hàm lƣợng (mg/g DW) Triterpene 2.13±0.21 Phenolics 1.59±0.03 Flavonoid 8.25±0.40 Polyshacharide 61.83±4.25 3.2.2 M t số tiêu hóa học Cân 0.5g mẫu bào tử trích ly với 100 ml ethanol thời gian lọc lần tới ngày thứ bỏ bã thu dịch lọc cô quay định mức lên 100ml đem xác định flavonoids, polyphenols, triterpenes [61], [62] Phƣơng pháp xác định độ Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid Nguyên tắc: Hàm lƣợng flavonoids tổng đƣợc xác định phƣơng pháp UV-VIS với thuốc thử nhôm clorua [63] Flavonoids nấm Vân chi tạo phức màu vàng với dung dịch nhôm clorua Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với hàm lƣợng flavonoids đƣợc xác định bƣớc sóng 510nm [64] Làm mẫu trắng đối chứng nƣớc cất Đồ thị đƣờng chuẩn đƣợc trình bày phụ lục B.1 Cách tiến hành: Lấy ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 0.3 ml dung dịch NaNO2 vào lắc để yên phút Sau đó, cho thêm 0.3 ml dung dịch AlCl3 vào lắc để yên phút, bổ sung thêm ml dung dịch NaOH 1M lắc thêm nƣớc cất cho đủ 10 ml đem đo quang bƣớc sóng λ = 510nm Làm mẫu trắng đối chứng nƣớc cất Tổng hàm lƣợng flavonoids đƣợc biểu thị gam quercetin tƣơng đƣơng (QE) Bảng 2.4: Xây dựng đƣờng chuẩn quercetin đo mẫu Số ống Nồng độ Quercetin (ppm) Quercetin (100ppm) 20 40 60 80 100 0,05 0,2 0,4 0,6 0,8 Dịch mẫu (ml) NaNO2 5% (ml) AlCl3 10% (ml) NaOH 2M (ml) Nƣớc cất (ml) 7.4 7.35 7.2 0.3 Lắc đều, để yên phút 0.3 Lắc đều, để yên phút 7.0 6.8 6.6 6.4 M1 M2 M3 0 1 6.4 6.4 6.4 Hàm lƣợng flavonoids tổng đƣợc tính theo cơng thức: mgQE/ g DW = Trong : Cx nồng độ flavonoids ống (ppm), Vđo: thể tích ống đo (ml), đổi, w: độ ẩm mẫu (%), m: khối lƣợng mẫu ban đầu (g), F: hệ số pha loãng : hệ số qui Phương pháp xác định hàm lượng triterpene Nguyên tắc: Hàm lƣợng triterpene tổng (TTC) đƣợc xác định đƣờng chuẩn acid oleanolic, đƣợc biểu thị miligam oleanolic aicd tƣơng đƣơng/ gram chất khô dựa vào độ hấp thụ đƣợc đo 550nm [62] Cách tiến hành: Hút 0.2ml dung dịch mẫu cho vào bình định mức 10ml, hút thêm 0.2ml dung dịch acid acetic 5% 1,2ml acid perchloric đƣợc thêm vào, trộn ủ bể điều nhiệt 15 phút Sau đó, dung dịch hỗn hợp đƣợc làm lạnh pha loãng đến 5ml etyl acetat Độ hấp thụ đƣợc đo 550nm so với mẫu trắng máy quang phổ Đồ thị đƣờng chuẩn đƣợc trình bày phụ lục B.2 Bảng 2.1: Các bƣớc xây dựng đƣờng chuẩn acid oleanolic Số ống nghiệm M1 M2 Nồng độ acid 10 oleanolic (ppm) Acid oleanolic 0.2 0.4 0.6 0.8 0 (100ppm) Dịch mẫu (ml) 1 Acid acetic 5% 0.2 (ml) HClO4 (ml) 1.2 Lắc ủ 70 C 15 phút sau làm lạnh nhanh phút Etyl Acetat (ml) 3.6 3.4 3.2 2.8 2.6 2.6 2.6 Lắc đem đo quang bước sóng λ = 550 nm M3 2.6 Hàm lƣợng triterpene tổng đƣợc tính theo cơng thức: mgTTC/g DW = Trong : Cx nồng độ triterpene ống (ppm), Vđo: thể tích ống đo (ml), : hệ số qui đổi, w: độ ẩm mẫu (%), m: khối lƣợng mẫu ban đầu (g), F: hệ số pha loãng Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol Hàm lƣợng polyphenols tổng số đƣợc xác định phƣơng pháp UV-VIS với thuốc thử Folin – Ciocalteu [63], [64] Nguyên tắc: Phƣơng pháp dựa khả phản ứng với hợp chất phenolic thuốc thử Folin – Ciocalteu, hỗn hợp muối phức sodium tungstene (Na2WO4) sodium Hình B 1: Phổ 1H-NMR chất axit trans-p-hydroxy coumaric Hình B 3: Phổ UV chất methyl ferulat 49 Hình B 5: Phổ 1H-NMR chất methyl ferulat Hình B 6: Phổ IR chất methyl (2-hidroxyphenyl) axetat 50 Hình B 7: Phổ UV chất methyl (2-hidroxyphenyl) axetat Hình B 7: Phổ 1H-NMR chất methyl (2-hidroxyphenyl) axetat 51 Hình B 7: Phổ IR chất umbelliferone Hình B 8: Phổ 13C-NMR chất umbelliferone 52 Hình B 8: Phổ 1H-NMR chất umbelliferone Hình B Phổ 1H-NMR hợp chất oospolacton 53 Hình B 10 Phổ 13C-NMR hợp chất oospolacton Hình B 11: Phổ UV chất ergosterol 54 Hình B 12: Phổ IR chất ergosterol Hình B 13: Phổ 1H-NMR chất ergosterol 55 Hình B 14: Phổ 13C-NMR chất ergosterol Hình B 15: Phổ DEPT chất ergosterol 56 Hình B.16: Phổ HMBC chất ergosterol Hình B 17: Phổ COSY chất ergosterol 57 Hình B 18 Phổ khối lƣợng hợp chất ergosterol peoxit Phụ lục B.19 Phổ 1H-NMR hợp chất ergosterol peoxit 58 Phụ lục B.20 Phổ 13C-NMR hợp chất ergosterol peoxit Phụ lục B.21 Phổ DEPT hợp chất ergosterol peoxit 59 Phụ lục B.22 Phổ HMBC hợp chất ergosterol peoxit Phụ lục B.23 Phổ HSQC hợp chất ergosterol peoxit 60 Phụ lục B.24: Hình 4.2 Phổ 1H-NMR hợp chất Metyl 3,4 dihydroxylbenzoate Phụ lục B.25: Phổ 13C-NMR hợp chất Metyl 3,4 dihydroxylbenzoate 61 Phụ lục C Hình ảnh mẫu cao phân đo n Hình C.1 Bốn cao phân đoạn sau trích ly lỏng- lỏng 62 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM (tất văn có sẵn, chủ nhiệm cần photo đính kèm sau nội dung trên, sử dụng lý hợp đồng với phịng kế toán Khi lý, báo cáo in thành 03 cuốn, đó, 01 đóng bìa mạ vàng, 02 đóng bìa cứng thường) Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài đƣợc phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mơ hình .) 63 ... phần hóa học lồi nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức năng? ?? Mục tiêu a Mục tiêu tổng quát: thành phần hóa học lồi nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức b... từ nấm vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng vào thực phẩm Phân lập số chất từ nấm vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng vào thực phẩm Phân lập số chất từ nấm vân chi (Trametes versicolor) ứng. .. (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức năng? ?? Đề tài nhằm thực mục tiêu a Mục tiêu tổng quát: thành phần hóa học lồi nấm Vân chi (Trametes versicolor) ứng dụng thực phẩm chức b Mục tiêu cụ