Phân Lập, Chọn Lọc Và Định Danh Các Chủng Vi Khuẩn Quang Hợp Có Khả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG HẤP THỤ CO2 VÀ ĐỊNH HƯỚNG LÀM GIẢM HIỆU ỨNG NHÀ KÍNH Ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS HỒNG QUỐC KHÁNH HVCH NGƠ ĐỨC DUY Sinh viên thực MSSV: 1411100262 : CHÂU TUẤN VĂN Lớp: 14DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2018 LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn thầy Ngô Đức Duy, thực Viện Sinh học Nhiệt đới Những số liệu kết phân tích đề tài hồn tồn trung thực, khơng chép từ nguồn tài liệu tham khảo khác hình thức Một số nội dung đồ án tốt nghiệp có tham khảo sử dụng liệu trích dẫn cơng bố cơng khai báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo đồ án Nếu có chép khơng trung thực báo này, người thực đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Viện Khoa học ứng dụng Hutech trước ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ngày … tháng … năm 2018 Sinh viên thực Châu Tuấn Văn LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, hướng dẫn tận tình Thầy cô, anh chị bạn , em hoàn thành tốt báo cáo Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: TS Hoàng Quốc Khánh, Trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo điều kiện cho em làm đề tài Thầy Ngơ Đức Duy, TS Nguyễn Hồng Dũng chị Loan phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tận tình bảo, giảng dạy giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Các bạn lớp 14DSH01 đồng hành, chia sẻ giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực đề tài Cuối cùng, xin cám ơn Ba Mẹ, nuôi nấng, chăm sóc tạo điều kiện cho ăn học thành người có ích cho xã hội Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ẢNH .ii DANH MỤC BẢNG iii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Tình hình nghiên cứu ngồi nước Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan khí CO2 (Carbon dioxide) 1.1.1 Khái niệm nguồn gốc khí CO2 1.1.2 Lợi ích khí CO2 1.1.3 Tác hại khí CO2 1.1.4 Tình hình phát thải khí CO2 giới Việt Nam 1.1.5 Các biện pháp giảm thiểu khí thải CO2 10 1.2 Tổng quan vi khuẩn quang hợp 12 1.2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn quang hợp 12 1.2.2 Nguyên lý chung trình quang hợp khả cố định CO2 14 1.2.3 Ảnh hưởng nhân tố hóa lý đến sinh trưởng vi khuẩn quang hợp 16 1.2.4 Ứng dụng vi khuẩn quang hợp 16 1.3 Phương pháp định danh kỹ thuật sinh học phân tử………………………….18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Thời gian, địa điểm đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 19 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 19 2.1.3 Đối tưởng nghiên cứu 19 Đồ Án Tốt Nghiệp 2.1.4 Nguồn mẫu 19 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 20 2.2.1 Hóa chất 20 2.2.2 Dụng cụ 21 2.2.3 Thiết bị 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 21 2.3.2 Quy trình phân lập định danh 23 2.3.3 Phương pháp tăng sinh mẫu 23 2.3.4 Phương pháp phân lập mẫu 23 2.3.5 Phương pháp, kỹ thuật nhuộm Gram 23 2.3.6 Phương pháp khảo sát tăng trưởng vi khuẩn nồng độ muối khác nhau……………………………………………………………………………… 24 2.3.7 Phương pháp khảo sát tăng trưởng sử dụng nguồn CO2 vi khuẩn quang hợp………………………………………………………………………….24 2.3.8 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn……………………… …………….25 2.3.9 Khuyếch tán DNA phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)…………………………………………………………………………… 26 2.3.10 Gỉai trình tự DNA định danh…………………………… ………….….27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN………………………………………….28 3.1 Kết thu mẫu……………………………………………………………….….33 3.2 Kết tăng sinh mẫu 33 3.3 Kết phân lập đặc điểm hình thái 36 3.4 Kết quan sát hình thái vi khuẩn 38 3.5 Kết khảo sát khả chịu mặn 41 3.6 Kết khảo sát khả hấp thụ CO2……………………………………… …46 3.7 Định danh 49 3.7.1 Ly trích, thu nhận DNA 49 3.7.2 Kết PCR 49 3.8 kết định danh………………………………………………………………….50 3.8.1 Trình tự vung gene chủng RL1, CM23, CM24, CM34.3………….… 50 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.8.2 Thiết lập phát sinh loài……………………………………………….….52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 56 Đồ Án Tốt Nghiệp Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BIM : Basic Isolation Media LHQ : Liên Hợp Quốc NCBI : National Center for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction rDNA : Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid i Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ chu trình Calvin………………………………………………… 15 Hình 2.1 Mơ vị trí lấy mẫu Đức Hòa (A) Ngọc Hiển (B)………………19 Hình 2.2 Quy trình phân lập định danh vi khuẩn quang hợp…………………… 22 Hình 2.3 Mơ hình thí nghiệm thổi khí vào mơi trường lỏng………………………….25 Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA……………………………………… 27 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn phân lập làm mơi trường BIM agar…………………………………………………… 38 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái số chủng vi khuẩn quan sát ống kính hiển vi với vật kính 100X…………………………………………………………… 40 Hình 3.3 Giá trị OD660nm nồng độ muối 5‰ chủng vi khuẩn sau ngày 41 Hình 3.4 Giá trị OD660nm nồng độ muối 10‰ chủng vi khuẩn sau ngày 42 Hình 3.5 Giá trị OD660nm nồng độ muối 15‰ chủng vi khuẩn sau ngày 42 Hình 3.6 Giá trị OD660nm nồng độ muối 20‰ chủng vi khuẩn sau ngày 43 Hình 3.7 Giá trị OD660nm nồng độ muối 25‰ chủng vi khuẩn sau ngày 43 Hình 3.8 Giá trị OD660nm nồng độ muối 30‰ chủng vi khuẩn sau ngày 44 Hình 3.9 Giá trị OD660nm nồng độ muối 35‰ chủng vi khuẩn sau ngày 44 Hình 3.10 Giá trị OD660nm nồng độ muối 40‰ chủng vi khuẩn sau ngày.45 Hình 3.11 Kết ly trích DNA chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8 gel agarose 1% .49 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm PCR chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 gel agarose 1% .49 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm PCR sau tinh kit chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 gel agarose 1% 50 Hình 3.14 Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gene…………….……52 ii Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Khí thải CO2 toàn cầu, giai đoạn 2000 – 2017……………………….……9 Bảng 1.2 Một số đặc điểm vi khuẩn tía lưu huỳnh không lưu huỳnh ……….13 Bảng 2.1 Các thành phần môi trường nuôi cấy………………………….21 Bảng 3.1 Danh sách nguồn mẫu từ Long An Cà Mau………………….… 29 Bảng 3.2 Danh sách mẫu tăng sinh từ nguồn mẫu Long An Cà Mau…… ….33 Bảng 3.3 Hình ảnh số ống mẫu tăng sinh có thay đổi màu rõ rệt……… … 34 Bảng 3.4 Danh sách chủng phân lập từ 38 ống mẫu tăng sinh…….… 36 Bảng 3.5 Kết đặc điểm hình thái vi khuẩn…………………………………… 38 Bảng 3.6 Giá trị OD660nm chủng cao 0,3 nồng độ 4% sau ngày….…46 Bảng 3.7 Giá trị OD660nm, khả hấp thụ CO2 chủng vi khuẩn ngày 1… 46 Bảng 3.8 Giá trị OD660nm, khả hấp thụ CO2 chủng vi khuẩn ngày 3… 47 Bảng 3.9 Giá trị OD660nm, khả hấp thụ CO2 chủng vi khuẩn ngày 5… 48 iii Đồ Án Tốt Nghiệp TATCTGGTCTGAGAGGATGATGCCCGCGTTTGCGACGGACACAGGGCCCACACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAA ATTCTTTCACCGGGGACGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGCGGACATTTAAGTCAGG GGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTTGATACTGGG CM23:ATAATCCCACCGATGGTCGGCTGCCTCCTCTTGCGAGGTTGGCGCACCGCCTTCGGGTAGAACCAATTC CCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGTCATGCTGTTACGCGATTACTAG CGATTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACAGCTTTTTGGGATTAACCCATTGT CACTGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCACACCTTCCTCC GGCTTATCACCGGCAGTTTCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGACGTGGGTTGCGCTCGTTGC CGGACTTAACCGAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGCGATCCAGCCGAACT GAAGGAACCATCTCTGGAACCGCGATCGCCATGTCAAGGGTTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAA CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT 51 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.8.2 Thiết lập phát sinh loài RL1 Rhodobacter sp JA487 38 Rhodobacter johrii Rhodobacter sphaeroides Rhodobacter sp KCI-b Rhodobacter sp UTW6 -29 CM23 CM24 CM23 CM24 CM34.3 68 Hình 3.14 Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gene Chủng RL1 có mối quan hệ gần với loài Rhodobacter sp JA487 Rhodobacter sphaeroides có mức độ tương đồng 100% Dựa vào kết so sánh trình tự gene so sánh kết đặc điểm hình thái chủng RL1 lồi Rhodobacter sphaeroides Chủng CM23 có mối quan hệ gần với lồi Rhodobacter sphaeroides Rhodobacter sp UTW6-29 có mức độ tương đồng 100% 99% Dựa vào kết qủa so sánh trình tự gene so sánh kết đặc điểm hình thái chủng CM23 lồi Rhodobacter sphaeroides Chủng CM24 có mối quan hệ gần với loài Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter johrii Rhodobacter sp JA487 có mức tương đồng 100%, 99%, 99% Dựa vào kết so sánh trình tự gene so sánh kết đặc điểm hình thái chủng CM2 lồi Rhodobacter sphaeroides Chủng CM34.3 có mối quan hệ gần với loài Rhodobacter KCI-b, Rhodobacter johrii Rhodobacter sp UTW6-29 có mức tương đồng 99%, 100%, 99% Dựa vào kết so sánh trình tự gene so sánh kết đặc điểm hình thái chủng CM34.3 lồi Rhodobacter johrii 52 Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận Từ 22 mẫu nước thu thập từ ao ruộng Long An 41 mẫu nước từ rừng Ngọc Hiển, Cà Mau, phân lập tổng cộng 44 chủng vi khuẩn Sau tiến hành kiểm tra hình thái khuẩn lạc thơng qua kỹ thuật nhuộm Gram, kết chọn lọc 33 chủng vi khuẩn bắt Gram(-) Những chủng vi khuẩn tiếp tục khảo sát khả chịu mặn, kết cho thấy nồng độ muối 40‰, có 14 chủng vi khuẩn phát triển tốt ổn định Từ 14 chủng vi khuẩn này, tiến hành khảo sát khả hấp thu CO2 chọn lọc chủng có khả tăng trưởng cao RL1, CM23, CM24, CM34.3 Kết hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty cho thấy chủng RL1, CM23, CM24 có khả thuộc lồi Rhodobacter sphaeroides Còn chủng CM34.3 có khả thuộc loài Rhodobacter johrii Các chủng cho kết tương đồng 100% so sánh liệu gene chủng ngân hàng NCBI Kiến nghị Do lượng thời gian có giới hạn nên q trình nghiên cứu số vấn đề chưa thực Cần thực thêm số khảo sát: • Tối ưu hóa điều kiện tăng trưởng chủng vi khuẩn quang hợp • Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng phân lập • Khảo sát hấp thụ CO2 qua tỉ lệ thời gian khác Qua xác định khả hấp thụ tối ưu lượng CO2 thông qua phương pháp phân tích, cụ thể phương pháp sắc kí khí 53 Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mỵ Trần Hương Trà 2015 Nghiên cứu nhân nuôi sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lý chất hữu Sulfide nước [2] Nguyễn Thị Hương 2012 Phân lập, đánh giá đặc điểm sinh học định danh phân tử chủng vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu [3] Fang LC, Huang XF, Du ZH, Yuan J, Wei H, Cheng HH, Liu Y 2005 Isolation and identification of a photosynthetic bacteria producing coenzyme Q10 [4] Prasertsan P, Choorit W, Suwanno S 1993 Isolation, identification and growth conditions of photosynthetic bacteria found in seafood processing wastewater [5] Michael Knaggs 2012 Air Products and Chemicals, Inc.: Demonstration of CO2 Capture and Sequestration of Steam Methane Reforming Process Gas Used for LargeScale Hydrogen Production [6] Maha Harbaoui Zrelli 2016 Renewable energy, non-renewable energy, carbon dioxide emissions and economic growth in selected Mediterranean countries [7] Washington, DC: The National Academies Press 2010 Ocean Acidification: A National Strategy to Meet the Challenges of a Changing Ocean [8] Viện Khoa Học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam 2013 Tác hại kinh hồng khí hậu tới người [9] International Energy Agency 2017 Global Energy & CO2 Status Report [10] Duy Hữu 2015 Việt Nam đứng Top quốc gia phát thải nhiều khí nhà kính [11] Thân Mạnh 2014 10 điều bạn làm để giảm nóng lên trái đất [12] Nguyen Uyen 2011 Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria) [13] Nguyễn Lân Dũng 2005 Các nhóm vi khuẩn chủ yếu [14] Nguyễn Như Khanh 2016 Qúa trình quang hợp vi khuẩn [15] Hunter, N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., Beatty, J.Th (Eds.) 2009 The Purple Phototrophic Bacteria [16] Beverly K Pierson and Richard W Castenholz 1974 A Phototrophic Gliding Filamentous Bacterium of Hot Springs, Chloroflexus aurantiacus, gen and sp nov 54 Đồ Án Tốt Nghiệp [17] Mack et al 1993 Rhodospirillum sodomense,sp.nov., a Dead Sea Rhodospirillum species [18] Hà Trang 2002 Tổng thuật theo Châu Giang Thuỷ sản, [19] Janda JM, Abbott SL 2007 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls 55 Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC A: Kết phân lập mẫu từ tỉnh Long An tỉnh Cà Mau 56 Đồ Án Tốt Nghiệp 57 Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC B: Hình ảnh lấy mẫu thực tế Long An Cà Mau 58 Đồ Án Tốt Nghiệp 59 Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC C: Kết vùng gene bảo tồn chủng định danh Chủng CM23 60 Đồ Án Tốt Nghiệp RL1 61 Đồ Án Tốt Nghiệp CM24 62 Đồ Án Tốt Nghiệp CM34.3 63 Đồ Án Tốt Nghiệp 64 Đồ Án Tốt Nghiệp 65 ... Mục tiêu đề tài Xây dựng sưu tập vi khuẩn quang hợp định danh tới mức lồi vi khuẩn quang hợp có khả hấp thụ CO2 Nội dung nghiên cứu − Phân lập vi khuẩn quang hợp, gram âm, hiếu kị khí, hóa tự... trình quang hợp khả cố định CO2 vi khuẩn Tất vi khuẩn quang hợp chứa sắc tố quang hợp Sắc tố quang hợp vi khuẩn gọi bacteriochlorophyll, chlorophyll bacteriochlorophyll gọi chất dệp lục chất khuẩn. .. đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập − Chọn lọc dòng vi khuẩn có khả cố đinh CO2 cách khảo sát tăng trưởng chúng điều kiện dinh dưỡng có sục khí CO2 − Định danh đến loài chủng phương pháp