Phân Lập Và Định Danh Vi Khuẩn Acid Lactic Có Khả Năng Sinh Chất Kháng Khuẩn Từ Men Tiêu Hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN ACID LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ MEN TIÊU HÓA VÀ THỰC PHẨM LÊN MEN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG SINH VIÊN THỰC HIỆN HUỲNH THỊ YẾN LY MSSV: 3062845 LỚP: CNSH TT K32 Cần Thơ, Tháng 11/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) TS Ngô Thị Phƣơng Dung SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Huỳnh Thị Yến Ly DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) TS NGUYỄN VĂN THÀNH LỜI CẢM TẠ Trong q trình thực đề tài, tơi nhận nhiều giúp đỡ động viên từ quý Thầy Cô bạn sinh viên Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Tôi chân thành cảm ơn giúp đỡ quý Thầy Cô Viện NC&PT Công nghệ Sinh học tận tình hướng dẫn, giảng dạy trình học tập tạo điều kiện tốt cho đề tài thực hoàn thành thời hạn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Ngô Thị Phương Dung tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn KS Huỳnh Xuân Phong, Anh Nguyễn Ngọc Thạnh Bùi Duy Nhân tạo điều kiện cho thực đề tài giúp đỡ tơi hồn thành nội dung báo cáo đề tài luận văn tốt nghiệp Tôi biết ơn bạn Yến, Chi, Tú, Mai, Phương, Quyên, Lập, Hồng, Tuấn, Trinh anh, chị Cao học Công nghệ Sinh học K15, bạn ngành Công nghệ Sinh học khóa 32 Tiên tiến, bạn sinh viên khóa 33 34, tận tình động viên giúp đỡ thời gian qua Tôi xin cảm ơn gia đình người thân ln động viên tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Ngƣời thực hi n Huỳnh Thị Yến Ly Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƢỢC Vi khuẩn acid lactic hệ vi khuẩn quan trọng phổ biến số sản phẩm lên men truyền thống bột men tiêu hóa, mà cịn có khả sinh chất kháng khuẩn ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm Đề tài thực với mục tiêu phân lập dòng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men men tiêu hóa Kiểm tra khả kháng khuẩn hợp chất acid lactic, H2O2 bacteriocin từ dòng phân lập hai phương pháp “nhỏ giọt” “khuếch tán giếng thạch” kết hợp với vi khuẩn thị Bacillus subtilis Định danh cấp độ giống dịng phân lập có hoạt tính kháng khuẩn bacteriocin thông qua việc khảo sát phát triển chúng nhiệt độ, pH, nồng độ muối (NaCl), mơi trường có bổ sung natri azide (NaN3), khả sinh khí CO2 lên men đường glucose thử nghiệm indole Kết phân lập 46 dòng vi khuẩn acid lactic định danh sơ qua thử nghiệm sinh hóa Kiểm tra tính kháng khuẩn dịng phân lập, 23 dịng biểu tính kháng vi khuẩn thị B subtilis, 10 dòng (6 dòng từ dưa chua dòng men tiêu hóa) có khả tổng hợp bacteriocin, dịng DC213A có tính kháng mạnh với đường kính vịng vơ khuẩn 22mm Kết định danh cấp độ giống 10 dòng thuộc giống Leuconostoc, Enterococcus, Lactobacillus Streptococcus Từ khóa: Bacteriocin, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus vi khuẩn acid lactic Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học i Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu vi khuẩn acid lactic 2.2 Một số giống điển hình vi khuẩn acid lactic 2.2.1 Enterococci 2.2.2 Lactobacilli 2.3 Định danh vi khuẩn acid lactic phương pháp hình thái học 2.4 Hệ thống phân loại chế hoạt động chất kháng khuẩn bacteriocin 2.4.1 Nisin 10 2.4.2 Acidolin 11 2.4.3 Lactacin B 11 2.5 Các sản phẩm lên men acid lactic 11 2.5.1 Kim chi 11 2.5.2 Sữa chua 12 2.5.3 Dưa cải muối chua 13 2.6 Men tiêu hóa 13 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Phương tiện nghiên cứu 14 3.1.1 Địa điểm thời gian thực 14 3.1.2 Vật liệu 14 3.1.3 Thiết bị dụng cụ 14 3.1.4 Hóa chất môi trường 14 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học ii Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 3.2 Phương pháp nghiên cứu 15 3.2.1 Thu thập mẫu 15 3.2.2 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn acid lactic từ men tiêu hóa thực phẩm lên men 15 3.2.3 Thí nghiệm 2: Kiểm tra chọn lọc dòng vi khuẩn acid lactic phân lập có tính kháng khuẩn cao 16 3.2.4 Thí nghiệm 3: Định danh cấp độ giống dòng vi khuẩn acid lactic chọn lọc 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Phân lập vi khuẩn acid lactic từ men tiêu hóa thực phẩm lên men 20 4.2 Kiểm tra chọn lọc dịng vi khuẩn acid lactic phân lập có tính kháng khuẩn cao 29 4.3 Định danh cấp độ giống dòng vi khuẩn acid lactic chọn lọc 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh thí nghiệm Phụ lục Phương pháp phân tích Chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học iii Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng Vitamin chất cần thiết cho vi khuẩn acid lactic Bảng Bảng phân loại vi khuẩn acid lactic phương pháp hình thái học Axelsson (2004) Bảng Những loại peptide bacteriocin vi khuẩn acid lactic theo Meyer et al (1997) 10 Bảng Tính chất số bacteriocin phổ biến theo Soomro et al (2002) 10 Bảng Thành phần dinh dưỡng kim chi 12 Bảng Tên mẫu phân lập vi khuẩn acid lactic 15 Bảng Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn acid lactic 21 Bảng Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn acid lactic (tt) 22 Bảng Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn acid lactic (tt) 23 Bảng 10 Khả kháng B subtilis dòng vi khuẩn acid lactic phân lập 31 Bảng 11 Kết tính kháng khuẩn bacteriocin từ dịng phân lập 33 Bảng 12 Kết khảo sát phát triển dòng vi khuẩn acid lactic sinh bacteriocin 35 Bảng 13 Kết định danh cấp độ giống dòng LAB sinh bacteriocin 38 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học iv Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Mẫu nhuộm Gram dịng phân lập .20 Hình Thử nghiệm oxydase mẫu phân lập 24 Hình Mẫu nhuộm bào tử dòng phân lập DC213A .24 Hình Khả phân giải CaCO3 dòng phân lập DC213A 24 Hình Hình thái dịng DC21322 25 Hình Hình thái dịng SC123 25 Hình Hình thái dòng KF12 26 Hình Hình thái dịng KC11 26 Hình Hình thái dịng YK22 27 Hình 10 Hình thái dịng Lac1 28 Hình 11 Hình thái dịng TF31 28 Hình 12 Hình thái dòng phân lập từ nem chua .28 Hình 13 Hình thái dịng phân lập từ dưa chua hỗn hợp 29 Hình 14 Các dịng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn mạnh 30 Hình 15 Các dịng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn trung bình 30 Hình 16 Các dịng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn yếu 30 Hình 17 Khả sinh bacteriocin dòng lactic phân lập .33 Hình 18 Dịng DC2114 thuộc Leuconostocs 35 Hình 19 Dịng DC2113 thuộc Enterococcus 36 Hình 20 Dịng DC2112D thuộc Lactobacillus 37 Hình 21 Dịng DC213A thuộc Lactobacillus 37 Hình 22 Dịng DC213 thuộc Lactobacillus 37 Hình 23 Dịng DC2132 thuộc Lactobacillus 37 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học v Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, ngộ độc thực phẩm trở thành vấn đề cấp thiết cần giải để bảo vệ sức khỏe người Bên cạnh đó, việc dùng chất hóa học bảo quản thực phẩm bị hạn chế sử dụng tác dụng phụ khơng có lợi đến người tiêu dùng Vì vậy, việc tìm loại chất bảo quản vừa an tồn, vừa hiệu vấn đề thách thức cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Kết nghiên cứu năm gần cho thấy vi khuẩn acid lactic khơng lên men lactic rau tạo ăn truyền thống thơm ngon, mà cịn có tác động hiệu bảo quản thực phẩm Vi khuẩn lactic có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe người chúng kích thích hệ miễn dịch giảm gia tăng mật số vi khuẩn có hại đường ruột Hơn nữa, chúng cịn biết đến nguồn vi sinh vật sinh bacteriocin, dạng chất kháng khuẩn có khả chống lại xâm nhập mầm bệnh ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm Hầu hết vi khuẩn lactic tổng hợp bacteriocin nên thành phần kháng khuẩn đa dạng Latacin, Nisin, Acidolin, Từ lâu bacteriocin ứng dụng rộng rãi bảo quản thực phẩm, điển hình Nisin Năm 1953, thương phẩm Nisaplin xuất thị trường chất bảo quản thực phẩm đến năm 1969, World Health Organization (WHO) công nhận Nisin chất bảo quản an tồn có nguồn gốc sinh học Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất chủ yếu sản phẩm lên men truyền thống dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua số men vi sinh đông khô Với mục tiêu bước đầu phân lập tuyển chọn nguồn vi khuẩn acid lactic có khả sinh chất kháng khuẩn từ nguồn sản phẩm lên men men tiêu hóa có sẵn thị trường Qua tiến hành định danh tiếp tục nghiên cứu điều kiện sinh chất kháng khuẩn cao để ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực phẩm tự nhiên nên thực đề tài “Phân lập định danh vi khuẩn acid lactic có khả sinh chất kháng khuẩn từ men tiêu hóa thực phẩm lên men” Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài thực với mục tiêu phân lập dòng vi khuẩn acid lactic từ men tiêu hóa thực phẩm lên men qua tuyển chọn dịng lactic có tính kháng khuẩn cao để định danh cấp độ giống Để thực mục tiêu này, đề tài tiến hành với nội dung sau: - Phân lập dòng vi khuẩn acid lactic từ nguyên liệu thu thập - Kiểm tra tính kháng khuẩn dòng phân lập dòng thị Bacillus subtilis - Chọn lọc dòng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn cao - Định danh cấp độ giống dòng vi khuẩn acid lactic chọn lọc Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DC2122 DC21322 DC213 Dƣa chua DC2113 DC2114 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 15: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ sữa chua Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn SC123 SC124 Bảng 16: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ Kefir Dòng phân lập KF12A Mẫu Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Kefir KF12 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 17: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ sữa kim chi Dòng phân lập KC11 Mẫu Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn KC12A Kim chi KC13 KC4 KC32 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 18: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ Yakult Dịng phân lập YK222 Mẫu Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Yakult YK11 YK22 Bảng 19: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ nem chua Hình thái dịng phân lập từ nem chua NC121 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học NC132 NC2122 Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 20: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ men tiêu hóa Dịng phân lập Mẫu Hình thái Bio3 Anti Men tiêu hóa Lac Lac1 Lac3 Chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Zin Probio Probactil Bio1 Bảng 21: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ nƣớc chua tàu hủ Dòng phân lập TF31 Mẫu Hình thái TF22 Nƣớc chua tàu hủ Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TF1 TF13 TF233 TF23 Bảng 22: Các dòng vi khuẩn LAB phân lập từ mẫu dƣa chua lên men A, B C Hình thái dịng phân lập \ A3 B313 A113 A111 B11 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học C21 Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 23: Các dịng lactic có tính kháng khuẩn mạnh Dịng phân lập Tính kháng khuẩn A3 KC32 Anti DC213 DC2114 Lac3 DC213A Bảng 24: Các dịng lactic có tính kháng khuẩn yếu Dịng phân lập Hình thái Zin Bio TF233 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học TF22 TF31 Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 25: Dịng phân lập có tính kháng trung bình Dịng phân lập Tính kháng khuẩn KC4 Probactil KC2 Probio DC2112 DC2113 DC2132 KC11 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học SC123 DC21322 Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 26: Dịng phân lập có tính kháng bacteriocin Dịng phân lập Tính kháng bacteriocin DC2112D DC2132 DC2114 DC213A Probio Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học DC213 DC2113 Antibio Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 a Trường ĐHCT b e f Hình 27 Các mẫu men tiêu hóa dùng để phân lập LAB c d g h a: Bioacimin; b: Lactominplus; c: Biosubtyl II; d: Probactil e: Antibio; f: Zincibio; g: Probio; h: Thuốc thử oxydase Công ty Nam Khoa Biotek Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Đếm mật số vi khuẩn buồng đếm hồng cầu Nguyên tắc Lắc ống nghiệm chứa mẫu pha loãng, dùng ống hút hút giọt vào mặt kính, đậy kính lên lưới đếm Chú ý khơng để tạo thành bọt khí lưới đếm tràn dịch mẫu xuống rãnh Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi, sau tiến hành đếm tế bào lớn góc Trong lớn, đếm từ ô thứ đến ô thứ 16 Chỉ đếm tế bào nằm bên ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều Ghi số lượng tế bào đếm ô lớn Đếm buồng đếm sau lấy giá trị trung bình Sau dùng xong buồng đếm kính phài đem rửa lau khơ Tính kết Số lượng tế bào 1ml mẫu dịch tính cơng thức: Số tế bào/ml = (a*4000*103*c)/b Trong đó: a – số tế bào ô lớn b – số ô ô lớn 103 – chuyển mm3 ml (1000mm3 = 1ml) c – độ pha loãng (100 lần) (Nguyễn Xuân Thành, 2005) Nhuộm Gram Nguồn: Phan Thanh Phong (2006) Các dịng phân lập ni ủ sau 48 30oC cố định trên, để thực nhuộm Gram Quy trình nhuộm Gram - Lấy sinh khối mơi trường thạch MRS, cho vài giọt nước vô trùng miếng lam vô trùng Dùng que cấy trải dịch mẫu, làm khô tự nhiên hơ nhẹ miếng lam cách đưa miếng lam qua lại đầu lửa (khoảng - lần) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT - Nhỏ khoảng - giọt crystal violet lên dịch mẫu khô, để yên phút, rửa nước, để khô tự nhiên - Tiếp tục, nhỏ - giọt dung dịch Iod vào dung dịch mẫu, để yên khoảng phút, rửa nước, để khô tự nhiên - Nhỏ dung dịch khử màu (ethanol aceton theo tỷ lệ 1:1) giọt dung mơi khơng có màu, rửa bẳng nước, để khô tự nhiên - Nhỏ khoảng - giọt Fushin, để yên phút, rửa nước, để khô tự nhiên - Xem mẫu sau nhuộm kính hiển vi vật kính X100 Kết quả: Vi khuẩn Gram (–): bắt màu hồng (fushin) Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím xanh (violet - iod) Vi khuẩn lactic Gram dương xác định vi khuẩn bắt màu phức violet - iod Thử nghi m catalase Nguồn: Phan Thanh Phong (2006) Quy trình - Lấy sinh khối tâm khuẩn lạc môi trường thạch MRS sau 24 - 48 ủ Chuyển sinh khối lên miếng lam, nhỏ lên sinh khối giọt H2O2 3% (dùng ống nhỏ giọt hay pippette) - Quan sát hình thành bọt khí ghi nhận kết Kết Dương tính: Có hình thành bọt khí (O2) Âm tính: khơng hình thành bọt khí Vi khuẩn lactic xác định vi khuẩn có catalase âm tính Thử nghi m oxidase Nguồn: Phan Thanh Phong (2006) Quy trình - Thuốc thử oxydase cơng ty Nam Khoa Biotek sử dụng thí nghiệm Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT - Đặt sản phẩm giấy lọc, có tẩm sẵn thuốc thử lên miếng lam vô trùng, tiếp tục nhỏ giọt nước cất lên vị trí đặt giấy lọc cho vừa thấm ướt giấy - Dùng que cấy, lấy sinh khối vi khuẩn sau 18 - 24 ủ, đặt lên giấy lọc thấm nước trước Quan sát phản ứng đến phút Kết Dương tính: Giấy lọc đổi màu xanh dương đậm Âm tính: Giấy lọc khơng đổi màu Vi khuẩn lactic xác định dòng phân lập có kết oxydase âm tính Nhuộm bào tử (Nguyễn Đức Lượng, 2006) - Làm vết bôi phiến kính - Cố định tiêu lửa đèn cồn - Nhuộm dung dịch Xanh Methylen 1%, phút có hơ nóng từ bên - Rữa lại nước cất hết màu - Nhuộm mẫu dung dịch đỏ trung tính 0,5%, phút - Rữa lại nước cất, để khơ - Quan sát mẫu kính hiển vi với vật kính dầu (x100) Kết quả: Bào tử : bắt màu xanh Khơng có bào tử: bắt màu đỏ Phân giải CaCO3 Những dòng phân lập cấy chuyển mơi trường MRS agar có bổ sung 1,5% CaCO3 Vi khuẩn lactic có khả sinh acid lactic phân giải CaCO nên tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc Sau ủ chọn dịng vi khuẩn có khả tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc Cách thực hi n kiểm tra phản ứng sinh indole Nguồn: Phan Thanh Phong (2006) Cấy chuyển lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc làm môi trường MRS agar sang môi trường MRS broth, ủ 37oC 24 Sau ủ, thêm dung dịch thuốc thử IAA Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Kết quả: Dương tính: Xuất vịng trịn đỏ bề mặt mơi trường Âm tính: Khơng xuất vịng trịn đỏ bề mặt môi trường Lactobacilli không sinh indole nên cho kết âm tính Phƣơng pháp kiểm tra kháng kháng Herna´ndez, D et al., (2004) 8.1 Phƣơng pháp nhỏ giọt (agar spot test) Những dòng lactic phân lập nuôi 5ml MRS lỏng 30oC/ 16 Dung dịch sau ủ trải đĩa có chứa 10ml MRS agar Sau nuôi ủ 30oC/18 giờ, đĩa trộn chung với 5ml agar (khoảng 1%) ủ với dịch huyền phù indicator chứa 105CFU/ml Những đĩa ủ 24 - 72 giờ, phụ thuộc vào sinh trưởng dòng indicator xuất vùng sáng 8.2 Phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar test) Bước 1: Dịch huyền phù indicator trữ -20oC Chủng nồng độ 105 CFU/ml dung dịch vào 16ml agar 1% Sau đồng hóa, agar đổ vào đĩa Petri (đường kính 90mm), làm lạnh 4oC 30 phút, tạo giếng nhỏ có đường kính 6mm với kim loại Bước 2: Những dịng lactic phát triển 2ml MRS lỏng điều kiện yếm khí tránh hình thành H2O2, tới giai đoạn pha tĩnh (khoảng 48 giờ) Dung dịch ly tâm 3000rpm 10 phút, lấy the supernatants (phần nước trong), điều chỉnh pH 6,5, khử trùng microfiltration Dung dịch gọi CSF, trữ -20oC Lấy 50µl CSF đỗ vào giếng đĩa chuẩn bị bước Sau ủ 4oC/1 giờ, đĩa ủ điều kiện phù hợp cho loài thị Môi trƣờng nƣớc mắm - peptone (Cá peptone) Nguồn: Nguyễn Đức Lượng (2006) Các thành phần môi trường bao gồm: Peptone: 10g, nước mắm 35o đạm: 30ml, agar: 20g, nước cất: 1000ml Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC PT Công Nghệ Sinh Học ... men vi sinh đông khô Với mục tiêu bước đầu phân lập tuyển chọn nguồn vi khuẩn acid lactic có khả sinh chất kháng khuẩn từ nguồn sản phẩm lên men men tiêu hóa có sẵn thị trường Qua tiến hành định. .. Thí nghi m 1: Phân lập vi khuẩn acid lactic từ men tiêu hóa thực phẩm lên men a Mục đích: Phân lập dòng vi khuẩn acid lactic chủng b Phƣơng pháp: * Phƣơng pháp phân lập - Men tiêu hóa dạng đơng... lên men truyền thống bột men tiêu hóa, mà cịn có khả sinh chất kháng khuẩn ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm Đề tài thực với mục tiêu phân lập dòng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men men tiêu