PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Nitrosomonas TRONG NƯỚC THẢI

Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật để xử lý nước thải bị ô nhiễm ngày một phổ biến. Quá trình loại bỏ nitơ dư thừa trong nước chủ yếu nhờ vào hoạt động của các nhóm vi khuẩn AOB và NOB qua các quá trình amon hóa, nitrat hóa và phản nitrat hóa. Sự phát hiện ra vi khuẩn Nitrosomonas đã mở ra một phương pháp xử lý amonia mới và hiệu quả thay vì những phương pháp xử lý truyền thống. Nghiên cứu được thực hiện theo 3 giai đoạn, giai đoạn một là phân lập vi khuẩn Nitrosomonas từ nguồn nước thải sản xuất thuộc da, nước thải chế biến nước mắm, nước thải lò mổ và nước thải chế biến thủy sản, giai đoạn hai là thử nghiệm khả năng chuyển hóa amonia và kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas trên môi trường có nồng độ muối khác nhau giai đoạn ba, định danh loài Nitrosomonas có khả năng chuyển hóa amonia tốt, sinh trưởng và phát triển mạnh bằng phương pháp sinh học phân tử.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Nitrosomonas TRONG NƯỚC THẢI Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành : D420201 Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÔI TRƯỜNG Sinh viên thực : HUỲNH THỊ ĐIỆP Niên khóa : 2011 – 2015 Tháng 02 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Nitrosomonas TRONG NƯỚC THẢI Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ CÔNG NHẤT PHƯƠNG HUỲNH THỊ ĐIỆP Tháng 02 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Lê Công Nhất Phương người bảo, hướng dẫn, giúp đỡ em thực hoàn thành tốt đề tài Em xin cảm ơn anh chị viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực đề tài Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô môn Công nghệ Sinh học tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình theo học trường Em xin cảm ơn Công ty Hai Thành Food Co LTD, khu Hiệp Phước, Công ty TNHH Tỷ Cao Thắng, khu Hiệp Phước, Công ty nước mắm Liên Thành Công ty Vissan tạo điều kiện cho em trình thu thập mẫu nước thải để em hồn thành đề tài thời hạn Cảm ơn bạn lớp DH11SM gắn bó, chia sẻ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Con xin chân thành cảm ơn gia đình tạo điều kiện cho học tập đến ngày hôm Con cảm ơn ba mẹ sinh thành, nuôi dưỡng, dạy bảo nên người, yêu thương động viên lúc khó khăn Kính chúc tất sức khỏe thành đạt! Sinh viên thực HUỲNH THỊ ĐIỆP i TÓM TẮT Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật để xử lý nước thải bị ô nhiễm ngày phổ biến Quá trình loại bỏ nitơ dư thừa nước chủ yếu nhờ vào hoạt động nhóm vi khuẩn AOB NOB qua trình amon hóa, nitrat hóa phản nitrat hóa Sự phát vi khuẩn Nitrosomonas mở phương pháp xử lý amonia hiệu thay phương pháp xử lý truyền thống Nghiên cứu thực theo giai đoạn, giai đoạn phân lập vi khuẩn Nitrosomonas từ nguồn nước thải sản xuất thuộc da, nước thải chế biến nước mắm, nước thải lò mổ nước thải chế biến thủy sản, giai đoạn hai thử nghiệm khả chuyển hóa amonia kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas môi trường có nồng độ muối khác giai đoạn ba, định danh lồi Nitrosomonas có khả chuyển hóa amonia tốt, sinh trưởng phát triển mạnh phương pháp sinh học phân tử Phân lập thành công vi khuẩn Nitrosomonas từ bốn nguồn nước thải Mơi trường có nồng độ muối khác nhau, hai loài Td2 Ts1 vừa có khả chuyển hóa amonia cao vừa sinh trưởng phát triển mạnh Lồi Td2 có độ tương đồng 92% so với vi khuẩn Nitrosomonas sp (AJ005546) phát Na Uy có độ tương đồng 92% so với vi khuẩn Nitrosomonas europaea ATCC 25978 (HE862405) phát Đức Lồi Ts1 có độ tương đồng 90% so với vi khuẩn Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (AL954747) phát Mỹ tương đồng 90% so với vi khuẩn Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (NC004757) phát Mỹ Như vậy, loài Td2 Ts1 phân lập tương ứng từ mẫu nước thải thuộc da thủy sản có khả chuyển hóa amonia cao sinh trưởng mạnh mơi trường có nồng độ muối khác Hai lồi Td2 Ts1 có độ tương đồng với vi khuẩn Nitrosomonas sp Nitrosomonas europaea dược phát giới ii SUMMARY The topic: “Isolation and identification of bacteria Nitrosomonas in wastewater” Today, the use of microorganisms to treat contaminated wastewater increase rapidly The process of removing excess nitrogen is mainly due to the activity of AOB and NOB bacteria through the process of amonia, nitrification and denitrification reactors The discovery of Nitrosomonas bacteria has opened a new processing method and efficient amonia instead of the traditional processing methods The experiment was arranged in three stages Firstly, Nitrosomonas bacteria isolated from four wastewater processing tanning, fish sauce processing wastewater, abattoirs wastewater and seafood processing wastewater Secondly, the ability to handle amonia and the density of bacteria Nitrosomonas cell on environment containing different salt concentrations were tested Finally, identification of Nitrosomonas bacteria that grow and treat amonia well by molecular biological methods Isolation of Nitrosomonas bacteria from four wastewater processing tanning, fish sauce processing wastewater, abattoirs wastewater and seafood processing wastewater was done Two strains of TD2 and TS1 had the ability to metabolize ammonia well, growth and strong development in environments with different concentrations Strain TD2 shared 92% similarity compared with Nitrosomonas sp (AJ005546) was isolated in Norway and 92% similarity with Nitrosomonas europaea ATCC 25,978 (HE862405) was isolated in Germany Strain TS1 has 90% similarity compared with Nitrosomonas europaea ATCC 19,718 (AL 954747) was isolated in the America or United State and 90% similarity with Nitrosomonas europaea ATCC 19,718 (NC004757) was isolated in the America or United State Keywords: Nitrosomonas bacteria, Identification, Isolated, Wastewater iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH xiii Chương MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Yêu cầu đề tài 1.3.Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự chuyển hóa hợp chất nitơ nhờ vi sinh vật môi trường nước .3 2.2.Sơ lược nước thải có hàm lượng amonia cao .4 2.2.1.Nước thải chế biến thuộc da 2.2.2 Nước thải chế biến nước mắm 2.2.3.Nước thải lò mổ 2.2.4.Nước thải chế biến thủy sản 2.3.Tổng quan vi khuẩn AOB 2.3.1.Vi khuẩn AOB .7 2.3.2.Vi khuẩn Nitrosomonas .8 2.3.4.Sinh học phân tử vi khuẩn AOB 10 2.3.5.Vai trò vi khuẩn AOB 12 2.3.6.Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Nitrosomonas 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 NGHIÊN CỨU 15 3.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.2.Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1.Đối tượng nghiên cứu .15 3.2.2.Nguồn phân lập dụng cụ thiết bị 15 iv 3.2.3.Hóa chất 15 3.3.Phương pháp 17 3.3.1.Bố trí thí nghiệm .17 3.3.2.Phương pháp phân lập khiết giống vi khuẩn Nitrosomonas 17 3.3.3.Thử nghiệm khả chuyển hóa amonia kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas 18 Trong trình phân lập làm loài Nitrosomonas, loại nước thải chọn lồi Nitrosomonas có khả sinh trưởng phát triển mạnh (hình dạng khuẩn lạc có hình dạng trịn đều, đồng nhất, thời gian mọc nhanh q trình ni cấy) để tiến hành thử nghiệm khả chuyển hóa amonia kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas 18 3.3.4.Định danh vi khuẩn Nitrosomonas phương pháp sinh học phân tử 19 3.3.5.Một số phương pháp xử lý số liệu .21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1.Kết phân lập vi khuẩn Nitrosomonas .23 4.1.1.Vi khuẩn Nitrosomonas mọc môi trường có nồng độ muối cao 23 4.1.2.Vi khuẩn Nitrosomonas mọc mơi trường có nồng độ muối thấp 24 4.2.Kết thử nghiệm khả chuyển hóa amonia kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas mơi trường có nồng độ muối khác 25 4.2.1.Vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa amonia mơi trường có nồng độ muối cao 25 4.2.2.Vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa amonia mơi trường có nồng độ muối thấp .29 4.2.3.Kết kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas 33 4.3 Kết định danh phương pháp sinh học phân tử 34 4.3.2.Khuếch đại gen 16S rDNA loài phân lập phản ứng PCR .34 4.3.3.Giải trình tự xây dựng phát sinh lồi 35 4.3.4.So sánh độ tương đồng trình tự gen lồi Nitrosomonas 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1.Kết luận 38 5.2.Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .39 v 17.Annette Bollmann, Christopher J., Sedlacek, Jeanette Norton, Hendrikus J., Laanbroek, Yuichi Suwa, Lisa Y., Stein, Martin G., Klotz, Daniel Arp, Luis Sayavedra-Soto, Megan Lu, David Bruce, Chris Detter, Roxanne Tapia, James Han, Tanja Woyke, Susan M., Lucas, Sam Pitluck, Len Pennacchio, Matt Nolan, Miriam L., Land Marcel Huntemann, Shweta Deshpande, Cliff Han, Amy Chen, Nikos Kyrpides, Konstantinos Mavromatis, Natalia Ivanova, Natalia Mikhailova, Ioanna Pagani, Amrita Pati, Galina Ovchinnikova, and Lynne A., Goodwin, 2013 Complete genome sequence of Nitrosomonas sp Is79, an ammonium oxidizing bacterium adapted to low ammonium concentrations Stand Genomic Sci.7 : 469 – 482 40 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AOB : Amonia Oxidizing Bacterria BOD : Biochemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy sinh hóa) BTNMT: Bộ Tài Nguyên Môi Trường COD : Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học) Ctv : cộng tác viên CFU : Colony Forming Unit DNA : DeoxyriboNucleic Axit DO : Dissolved Oxygen (oxy hòa tan) EtBr : Ethium Bromide Lm3 : Lị mổ (tên lồi Nitrosomonas phân lập từ nước thải lò mổ) Lm4 : Lò mổ (tên lồi Nitrosomonas phân lập từ nước thải lị mổ) Lm5 : Lị mổ (tên lồi Nitrosomonas phân lập từ nước thải lò mổ) N : Nitơ Nm1 : Nước mắm (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải nước mắm) Nm4 : Nước mắm (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải nước mắm) Nm5 : Nước mắm (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải nước mắm) NOB : Nitrobacter Oxidizing Bacterria NXB : Nhà Xuất Bản P : Phosphos PCR : Polymerase Chain Reaction QCVN : Quy Chuẩn Việt Nam rDNA : Ribosomal deoxyribonucleic acid TAE : Tris Acetate EDTA Td1 : Thuộc da (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thuộc da) Td2 : Thuộc da (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thuộc da) Td5 : Thuộc da (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thuộc da) Ts1 : Thuỷ sản (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thủy sản) Ts3 : Thuỷ sản (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thủy sản) Ts4 : Thuỷ sản (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thủy sản) vii DANH MỤC BẢNG Trang LỜI CẢM ƠN .i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH xiii Chương MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Yêu cầu đề tài 1.3.Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự chuyển hóa hợp chất nitơ nhờ vi sinh vật môi trường nước .3 Hình 2.1 Chu trình hợp chất chuyển hóa nitơ (Lê Cơng Nhất Phương, 2012) 2.2.Sơ lược nước thải có hàm lượng amonia cao .4 2.2.1.Nước thải chế biến thuộc da 2.2.2 Nước thải chế biến nước mắm 2.2.3.Nước thải lò mổ 2.2.4.Nước thải chế biến thủy sản 2.3.Tổng quan vi khuẩn AOB 2.3.1.Vi khuẩn AOB .7 2.3.2.Vi khuẩn Nitrosomonas .8 Hình 2.2 Vi khuẩn Nitrosomonas ( Brenner D J, 2005) Yếu tố pH Hàm lượng DO (oxy hòa tan) 10 Bảng 2.3 Giá trị số bán tốc độ quá trình nitrat hóa 10 ( Park Hee-Deung, 2004) 10 viii Hình 4.7 Biến thiên nồng độ nitrit vi khuẩn Nitrosomonas mẫu thuộc da Giai đoạn đầu (0 giờ), nghiệm thức bổ sung vi sinh tương ứng lồi Td1, Td2 Td5 có nồng độ amonia 500 mg/l, lúc vi khuẩn cấy vào môi trường nên môi trường khơng có nồng độ nitrit Sau 24 theo dõi nồng độ amonia nghiệm thức có xu hướng giảm dần theo thời gian biểu rõ sau 72 (Hình 4.5) Kết cho thấy nồng độ amonia giảm tỷ lệ nghịch với tăng dần nồng độ nitrit theo thời gian (Hình 4.7) Theo kết bảng phân tích ANOVA (phụ lục 1), khả chuyển hóa amonia lồi Td2 cao (có khác biệt mặt thống kê với loài Td1, Td5) Điều thể rõ so sánh hiệu suất chuyển hóa amonia lồi Td1, Td2 Td5 (Hình 4.6) Sau 72 giờ, hiệu suất chuyển hóa amonia lồi Td2 cao đạt 48,6%, loài Td1 đạt 28,7% thấp loài Td5 đạt 22,4 % Theo kết trên, hiệu suất chuyển hóa amonia lồi Td2 cao hiệu suất chuyển hóa amonia lồi Td1 Td4 gấp 1,7 2,2 lần Bên cạnh đó, nồng độ nitrit sinh q trình chuyển hóa amonia tăng dần theo thời gian đạt nồng độ cao 189,1 mg/l (loài Td2), đạt nồng độ thấp 57,1 mg/l (lồi Td5) Dựa vào hiệu suất chuyển hóa amonia nồng độ nitrit sinh chứng tỏ loài Td2 có khả chuyển hóa amonia cao hai lồi Td1 Td5 mơi trường có nồng độ muối 6000 mg/l Trong mơi trường có nồng độ muối 4000 mg/l, chúng tơi theo dõi khả chuyển hóa amonia loài Nm1, Nm4 Nm5 phân lập từ mẫu nước thải chế biến nước mắm Khả chuyển hóa amonia lồi theo dõi qua hai tiêu tiêu amonia tiêu nitrit Theo kết phân tích ANOVA (phụ lục 1), thời gian 24 – 48 chuyển hóa amonia lồi Nm1, Nm4 Nm5 khơng có khác biệt lớn mặt ý nghĩa Trong thời gian này, khả chuyển hóa amonia loài Nm1 trội khả chuyển hóa amonia lồi Nm5 Sau 72 theo dõi, kết phân tích ANOVA cho thấy khả chuyển hóa amonia lồi Nm1 trội khả chuyển hóa amonia lồi cịn lại 27 Hình 4.8 Biến thiên nồng độ amonia vi khuẩn Nitrosomonas mẫu nước mắm Hình 4.9 Biến thiên hiệu suất chuyển hóa amonia vi khuẩn Nitrosomonas mẫu nước mắm Hình 4.10 Biểu đồ nồng độ nitrit mẫu nước mắm 28 Q trình chuyển hóa amonia loài Nitrosomonas phân lập từ mẫu nước thải chế biến nước mắm chia thành giai đoạn Giai đoạn – 48 giờ, giai đoạn thích nghi vi khuẩn Nitrosomonas cấy vào mơi trường có nồng độ muối 4000 mg/l, nên hiệu suất xử lý amonia khơng cao (Hình 4.9) Trong giai đoạn 48 – 72 giờ, hiệu suất xử lý amonia nghiệm thức tăng lên rõ rệt Điều đặc biệt hiệu suất xử lý amonia loài Nm1 cao gấp lần so với loài Nm4 3,8 lần so với loài Nm5 Trong giai đoạn nồng độ nitrit tăng lên đạt nồng độ cao 126,3 mg/l (lồi Nm1) (Hình 4.10) Như vậy, loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải chế biến nước mắm, lồi Nm1 có khả chuyển hóa amonia cao lồi Nm4 Nm5 Trong mơi trường có nồng độ muối cao, vi khuẩn Nitrosomonas phân lập từ mẫu nước thải chế biến thuộc da nước thải chế biến nước mắm có khả xử lý amonia tốt Giữa loài Nitrosomonas phân lập từ hai mẫu nước thải trên, khả chuyển hóa amonia lồi Td2 mạnh khả chuyển hóa amonia lồi Nm1 Thể rõ qua hiệu suất chuyển hóa amonia vi khuẩn Td2 cao gấp 1,5 lần so với lồi Nm1, bên cạnh nồng độ nitrit sinh cao xấp xỉ 1,5 lần Trong loài Nitrosomonas phân lập từ nguồn nước thải chế biến thuộc da nước thải chế biến nước mắm, lồi Td2 có khả chuyển hóa amonia tốt chọn tiến hành định danh phương pháp sinh học phân tử Vi khuẩn Nitrosomonas phân lập từ nguồn nước thải có nồng độ muối cao có khả chuyển hóa amonia tốt Grommen R ctv nghiên cứu vào năm 2005 Theo nghiên cứu Grommen R, môi trường nước biển nhân tạo, q trình oxy hóa amonia diễn sau bổ sung vi khuẩn Nitrosomonas 4.2.2 Vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa amonia mơi trường có nồng độ muối thấp Qua trình phân lập vi khuẩn Nitrosomonas mẫu nước thải lị mổ chúng tơi tuyển chọn lồi Lm3, Lm4, Lm5 có khả sinh trưởng phát triển mạnh Khả chuyển hóa amonia lồi thể rõ qua biểu đồ hình 4.11, hình 4.12 hình 4.13 29 Hình 4.11 Biến thiên nồng độ amonia vi khuẩn Nitrosomonas mẫu lị mổ Hình 4.12 Biến thiên hiệu suất chuyển hóa amonia vi khuẩn Nitrosomonas mẫu lị mổ Hình 4.13 Biến thiên nồng độ nitrit vi khuẩn Nitrosomonas mẫu lò mổ 30 Giai đoạn – 48 giờ, khả xử lý amonia nghiệm thức khơng có khác biệt mặt thơng kê (kết phân tích ANOVA) Hiệu suất chuyển hóa amonia nghiệm thức thấp khoảng 3,1 – 6,9% Giai đoạn 48 – 72 giờ, q trình chuyển hóa nitơ diễn mạnh mẽ hiệu xuất chuyển hóa amonia nghiệm thức khơng cao (Hình 4.12) Hiệu suất chuyển hóa cao nghiệm thức có bổ sung lồi Lm3 đạt 17,9%, nghiệm thức có bổ sung loài Lm4 đạt 8,8% thấp nghiệm thức có bổ sung lồi Lm5 đạt 6,3% Dựa vào kết phân tích ANOVA (phụ lục 1) giai đoạn hiệu suất chuyển hóa có khác biệt mặt thống kê loài Lm3, Lm4 Lm5 Lồi Lm3 có hiệu suất chuyển hóa amonia cao loài Lm4 Lm5 2,8 lần Vì lý giai đoạn đầu hiệu suất chuyển hóa amonia khơng cao nên nồng độ nitrit sinh không nhiều Sau 72 theo dõi, nồng độ nitrit sinh tăng dần đạt giá trị cao nồng độ 60 mg/l nhờ hoạt động lồi Lm3 q trình chuyển hóa amonia Như vậy, mơi trường có nồng độ muối 2000 mg/l lồi Lm3 có khả chuyển hóa amonia vượt trội hai loài Lm4 Lm5 phân lập từ mẫu nước thải lò mổ Khác với lồi Nitrosomonas phân lập từ mẫu nước thải lị mổ, loài Nitrosomonas phân lập từ mẫu nước thải chế biến thủy sản có khả chuyển hóa amonia mạnh Hình 4.14 Biến thiên nồng độ amonia vi khuẩn Nitrosomonas mẫu thủy sản 31 Hình 4.15 Biến thiên hiệu suất chuyển hóa amonia vi khuẩn Nitrosomonas mẫu thủy sản Hình 4.16 Biến thiên nồng độ nitrit vi khuẩn Nitrosomonas mẫu thủy sản Giai đoạn – 48 giờ, khả chuyển hóa amonia loài Ts1 vượt trội loài Ts3, Ts4 thể rõ hình 4.14, hình 4.15 hình 4.16 Khơng vượt trội hiệu suất chuyển hóa amonia mà nồng độ nitrit sinh q trình chuyển hóa amonia lồi Ts1 nhiều lồi cịn lại Sau 72 theo dõi, hiệu suất chuyển hóa amonia lồi Ts1 cao gấp 2,1 loài Ts3 gấp 1,5 lần so với lồi Ts4 Bên cạnh đó, nồng độ nitrit sinh q trình chuyển hóa amonia lồi Ts1 nhiều gấp 2,7 lần loài Ts3 gấp 1,7 lần lồi Ts4 (Hình 4.16) Như vậy, loài Nitrosomonas phân lập từ mẫu nước thải chế biến thủy sản, lồi Ts1 có khả chuyển hóa amonia tốt loài Ts3 Ts4 Sự suy giảm nồng độ amonia giải thích nhóm vi khuẩn 32 Nitrosomonas chuyển hóa amonia thành nitrit, điều thể qua tăng dần nồng độ nitrit theo thời gian thí nghiệm Tuy nhiên, khả chuyển hóa amonia loại vi khuẩn có khác phụ thuộc vào khả thích nghi hoạt động chúng mơi trường tăng sinh Trong mơi trường có nồng độ muối thấp (2000 mg/l), loài Nitrosomonas phân lập từ mẫu nước thải chế biến thuỷ sản có khả chuyển hóa amonia cao loài Nitrosomonas phân lập từ mẫu nước thải lị mổ Điều chứng minh qua hiệu suất chuyển hóa amonia nồng độ nitrit sinh thí nghiệm Hiệu suất chuyển hóa amonia loài Ts1 cao gấp 1,4 lần hiệu suất chuyển hóa amonia lồi Lm3, nồng độ nitrit sinh cao gấp 1,8 lần Như vậy, loài Nitrosomonas phân lập từ hai mẫu nước thải chế biến thủy sản nước thải lị mổ, lồi Ts1 chọn tiến hành định danh phương pháp sinh học phân tử Đối với mẫu đối chứng khơng có bổ sung vi sinh vật cho thấy nồng độ amonia giữ nguyên ban đầu (phục lục 1) 4.2.3 Kết kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas Từ kết phân lập vi khuẩn, 12 loài Nitrosomonas phân lập từ nguồn nước thải nuôi tăng sinh thu sinh khối Số khuẩn lạc đếm ml mẫu thể qua bảng 4.1 Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn Nitrosomonas (CFU/ml) theo thời gian Mật độ vi khuẩn Nitrosomonas (CFU/ml) Nguồn mẫu Mẫu 24 48 72 Td 9,35.10 9,42.10 7,40.107 Td 7,89.107 1,53.109 1,57.108 Thuộc da Td 5,84.106 7,67.107 5,30.107 Nm1 6,31 10 7,65 10 8,40 106 Nước mắm Nm4 4,43.106 1,06.107 6,46 106 Nm5 1,60.105 6,90.106 7,34.105 Lm 5,25 105 9,78 106 4,46 106 Lm 8,28.104 7,30.106 7,39.105 Lò mổ Lm 8,66.104 1,88.106 5,96.105 Ts 6,51.105 1,74.107 6,33.106 Thủy sản Ts 6,40.10 5,72.10 5,95.105 Ts 9,87.104 1,61.107 1,02.106 Nhìn chung, mật độ vi khuẩn Nitrosomonas mẫu cao (bảng 4.9) Sau 48 theo dõi mật độ vi khuẩn Nitrosomonas dao động từ 106 – 109 (CFU/ml) Trong thời gian 24 – 48 giờ, giai đoạn thích nghi sinh trưởng nhóm vi khuẩn nên 33 mật độ tăng tương đối ổn định Sau 72 mật độ vi khuẩn Nitrosomonas mẫu bắt đầu có xu hướng giảm Có thể lượng amonia giảm (dinh dưỡng giảm) làm tăng lượng nitrit chất ức chế nhóm vi khuẩn nitrit hóa nên mơi trường ni tăng sinh để lâu khả sống sót vi khuẩn giảm Theo kết bảng 4.1, mơi trường có nồng độ muối cao lồi Td2 có mật độ tế bào nhiều đạt tới 1,53.10 CFU/ml Trong môi trường có nồng độ muối thấp, lồi Ts1 có mật độ tế bào nhiều lồi cịn lại (mật độ tế bào đạt 1,74.10 CFU/ml) Kết hợp thí nghiệm song hành kiểm tra sinh hóa đếm mật độ vi khuẩn Nitrosomonas để chọn lọc nhóm vi khuẩn vừa có khả chuyển hóa amonia cao vừa sinh trưởng phát triển mạnh Nhóm vi khuẩn chọn định danh phương pháp sinh học phân tử phản ứng PCR Dựa vào kết thí nghiệm thí nghiệm 2, lồi Td2 Ts1 định danh phương pháp sinh học phân tử thí nghiệm 4.3 Kết định danh phương pháp sinh học phân tử 4.3.2 Khuếch đại gen 16S rDNA các loài phân lập phản ứng PCR Kết phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA loài phân lập với cặp mồi 357F 534R cho đoạn khuếch đại có kích thước 177 bp M 177 bp Hình 4.17 Kết khuếch đại gen 16S rDNA loài phân lập, M:100bp DNA ladder, 1: Loài Td2, 2: Loài Nm1 34 4.3.3 Giải trình tự xây dựng phát sinh lồi Tín hiệu giải trình tự gen 16S rDNA mẫu thuộc da thủy sản từ công ty Macrogen, Inc, Hàn Quốc (phụ lục2) Sau thực đảo ngược bổ sung trình tự hai mạch, cắt bỏ vị trí trùng lắp nối vào mạch cịn lại để có trình tự hoàn chỉnh 16S rDNA mẫu (phụ lục2) Bằng phần mềm chuyên dụng ClustalX TreeView, trình tự lồi xử lý hình thành phát sinh lồi hình 4.18 hình 4.19 NC_004757|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19718 AL954747|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19718 AJ005550|_Nitrosomonas_sp AJ005551|_Nitrosomonas_europaea JN099310|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19178 AJ005546|_Nitrosomonas_sp Td2 JN099309|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19178 AJ245759|_Nitrosomonas_europaea AJ245757|_Nitrosomonas_ureae HE862405|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_25978 AB070982|_Nitrosomonas_europaea_ATCC25978 AB070983|_Nitrosomonas_europaea_ATCC19178 NR_074774|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19718 AJ298738|_Nitrosomonas_cryotolerans AJ298731|_Nitrosomonas_halophila AJ298739|_Nitrosomonas_eutropha AJ298737|_Nitrosomonas_sp AJ298740|_Nitrosomonas_nitrosa AJ298734|_Nitrosomonas_aestuarii AJ298735|_Nitrosomonas_sp AJ298733|_Nitrosomonas_sp AJ298732|_Nitrosomonas_communis AJ298736|_Nitrosomonas_oligotropha AJ298730|_Nitrosomonas_ureae Hình 4.18 Cây phân loại vi khuẩn Nitrosomonas phân lập mẫu thuộc da 35 NC_004757|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19718 AL954747|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19718 JN099309|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19178 Ts1 AJ005550|_Nitrosomonas_sp AJ005551|_Nitrosomonas_europaea JN099310|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19178 AJ005546|_Nitrosomonas_sp AJ298735|_Nitrosomonas_sp AJ298737|_Nitrosomonas_sp AJ298734|_Nitrosomonas_aestuarii AJ298740|_Nitrosomonas_nitrosa AJ298733|_Nitrosomonas_sp AJ298732|_Nitrosomonas_communis AJ298738|_Nitrosomonas_cryotolerans AJ298736|_Nitrosomonas_oligotropha AJ298730|_Nitrosomonas_ureae AJ245757|_Nitrosomonas_ureae HE862405|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_25978 AB070983|_Nitrosomonas_europaea_ATCC19178 AB070982|_Nitrosomonas_europaea_ATCC25978 NR_074774|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_19718 GQ451713|_Nitrosomonas_europaea_ATCC_25978 AJ245759|_Nitrosomonas_europaea AJ298731|_Nitrosomonas_halophila AJ298739|_Nitrosomonas_eutropha Hình 4.19 Cây phân loại vi khuẩn Nitrosomonas phân lập mẫu thủy sản Cây phát sinh lồi hình 4.18 thể quan hệ di truyền gần gũi loài Td2 với phân lồi Nitrosomonas_europaea Nitrosomonas sp Đối với mẫu Ts1 có quan hệ di truyền gần gũi với phân loài Nitrosomonas_europaea thể qua hình 4.19 4.3.4 So sánh độ tương đồng trình tự gen các lồi Nitrosomonas Dựa vào phát sinh lồi hình 4.18 hình 4.19, cho phép xác định lồi giải trình tự có mối quan hệ di truyền gần gũi với lồi sau: 36 Bảng 4.2 Trình tự đoạn gen tương đồng với vùng 16S rDNA mẫu thuộc da STT Lồi vi khuẩn có độ tương đồng Nitrosomonas sp (AJ005546) Nitrosomonas europaea ATCC 25978 (HE862405) Độ tương đồng (%) 92 92 Bảng 4.3 Trình tự đoạn gen tương đồng với vùng 16S rDNA mẫu thủy sản STT Lồi vi khuẩn có độ tương đồng Độ tương đồng (%) Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (AL954747) 90 Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (NC004757) 90 Sản phẩm nhân 16S rDNA cặp mồi 357F 534R mẫu nước thải chế biến thuộc da nước thải chế biến thủy sản có độ tương đồng sau: Loài Td2 tương đồng 92% so với Nitrosomonas sp (AJ005546) phân lập Na Uy, tương đồng 92% so với Nitrosomonas europaea ATCC 25978 (HE862405) phân lập Đức Loài Ts1 tương đồng 90% so với Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (AL954747) phân lập Mỹ, tương đồng 90% so với Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (NC004757) phân lập Mỹ Hai loài Td2 Ts1 có độ tương đồng thấp so với lồi Genbank kết giải trình tự chưa tốt Nồng độ DNA có mẫu thấp trình ly trích DNA ngun nhân ảnh hưởng đến kết giải trình tự Bên cạnh đó, việc bảo quản mẫu q trình gửi mẫu quan trọng 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Loài Td2 Ts1 phân lập tương ứng từ mẫu nước thải thuộc da thủy sản có khả chuyển hóa amonia cao sinh trưởng mạnh mơi trường có nồng độ muố i khác Hai lồi Td2 Ts1 có độ tương đồng với vi khuẩn Nitrosomonas sp Nitrosomonas europaea dược phát giới 5.2 Đề nghị Tiến hành phân lập thử nghiệm khả chuyển hóa amonia vi khuẩn Nitrosomonas từ nguồn nước thải giàu amonia khác Bố trí thí nghiệm theo dõi mức ảnh hưởng tiêu khác như: nhiệt độ, pH, COD, BOD, DO, hàm lượng chất vi lượng, kim loại vi khuẩn Nitrosomonas Phối trộn chế phẩm sinh học từ loài Td2 Ts1 phân lập từ nước thải chế biến thuộc da nước thải chế biến thủy sản 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 10 11 12 13 14 15 16 Bộ công thương 2008 Dự thảo tài liệu hướng dẫn sản xuất – Ngành Thuộc da Chương trình hợp tác phát triển Việt Nam – Đan Mạch môi trường Bùi Thị Minh Thi 2008, Phân lập vi khuẩn Nitrosomonas từ nguồn nước thải giàu ammonia, Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Văn Lang Hoàng Phương Hà, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường Nguyễn Thị Kim Cúc 2008 Đặc điểm sinh học lồi vi khuẩn nitrat hóa phân lập từ nước lợ ni tơm Quảng Bình Hà Tĩnh Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn, số Hoàng Phương Hà, Trần Thị Nhị, Nguyễn Thị Kim Cúc 2010 Một số tính chất sinh học bốn lồi vi khuẩn nitrat hóa phân lập Hà Nội Tạp chí Cơng nghệ sinh học (2) : 241 – 251 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2003 Sinh học phân tử NXB Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh Lê Cơng Nhất Phương, Lê Thị Cẩm Huyền, Nguyễn Huỳnh Tấn Long 2012 Xử lý amonia nước thải giết mổ việc sử dụng kết hợp q trình nitrit hóa phần/anammox Tạp chí sinh học, 2012, 34(3SE) : 105 – 110 Lê Văn Cát 2007 Xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ photpho NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Lê Xuân Phương 2008 Khả chuyển hóa vật chất vi sinh vật môi trường tự nhiên Vi sinh vật môi trường NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Lương Đức Phẩm, Đinh Thị Kim Nhung Trần Cẩm Vân 2009 Cơ sở khoa học công nghệ bảo vệ môi trường Cơ sở vi sinh công nghệ bảo vệ môi trường Tập 2, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Hoài Hương 2009 Thực hành vi sinh ứng dụng Đại học kỹ thuật cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Hồng Thơm 2009 Thiết kế hệ thống xử lý nước thải Công ty CPCN Masan tái dụng cho sản xuất, công suất 300 m 3/ngày đêm Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Hoa Lý 2013 Ơ nhiễm mơi trường ngành chăn nuôi thú y biện pháp khắc phục Cục thú y Hải Phòng Nguyễn Việt Anh, Phạm Thúy Nga, Nguyễn Hữu Thắng, Trần Đức Hạ, Trần Hiếu Nhuệ 2004 Nghiên cứu xử lý nước ngầm nhiễm ammonium phương pháp nitrification kết hợp với denitrification bể phản ứng sinh học theo nguyên tắc màng vi sinh vật ngập nước với vật liệu mang sợi Acrylic Đề tài nghiên cứu khoa học, Mã số: 30, Trường đại học Xây dựng Hà Nội Nguyễn Việt Anh 2011 Thiết kế hệ thống xử lý nước thải thủy sản (cá, chả cá) Công ty cổ phần thủy sản Kiên Giang xí nghiệp chế biến thủy sản xuất Tắc Cậu Đồ án tốt nghiệp, đại học Kỹ thuật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thành Hổ 2004 Di truyền học NXB Giáo dục, Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Tuyết Ngân Nguyễn Hữu Hiệp 2010 Định danh vi khuẩn chuyển hóa đạm phép thử sinh hóa kỹ thuật sinh học phân tử Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Thủy sản lần : 42 – 54 39 Tài liệu tiếng nước 17 Annette Bollmann, Christopher J., Sedlacek, Jeanette Norton, Hendrikus J., Laanbroek, Yuichi Suwa, Lisa Y., Stein, Martin G., Klotz, Daniel Arp, Luis Sayavedra-Soto, Megan Lu, David Bruce, Chris Detter, Roxanne Tapia, James Han, Tanja Woyke, Susan M., Lucas, Sam Pitluck, Len Pennacchio, Matt Nolan, Miriam L., Land Marcel Huntemann, Shweta Deshpande, Cliff Han, Amy Chen, Nikos Kyrpides, Konstantinos Mavromatis, Natalia Ivanova, Natalia Mikhailova, Ioanna Pagani, Amrita Pati, Galina Ovchinnikova, and Lynne A., Goodwin, 2013 Complete genome sequence of Nitrosomonas sp Is79, an ammonium oxidizing bacterium adapted to low ammonium concentrations Stand Genomic Sci.7 : 469 – 482 18 APHA 1999 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater American Puplic Health Association, Wasshington DC, USA, 19th 19 Barry G Hall 2013 Molecular Biology And Evolution Building Phylogenetic Trees from Molecular Data with MEGA Vol 30:1229 – 1235 20 Boon N., DeWindt, W., Vertraete, W., Top, E.M 2002 Evaluation of nested PCR – DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group – specific 16S rRNA primer for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plants FEMS Microbiology Ecology Vol 39 : 101 – 12 21 Boopathy R, Bonvillain C., Fontenot Q., Kilgen M 2005 Biologial treatment of low – salinity shrimp aquaculture wastewater using sequencing batch reactor, Department of Biological Sciences, USA 22 Brenner D J., Krieg N R., Staley J T., Garrity G M 2005 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology – Part The Proteobacteria, pp 1414 23 Forstner U., Robert J., Murphy W., Rulkens H 2002 Wastewater Treatment Biological and Chemical Processes 24 Focht D D., and Chang A C 1975 Nitrification and Denitrification Processes Related to Wastewater Treatment Appl Microbial,19, 153 25 Grommen R., 2005 Elevated salinity selects for a less diverse amonia – oxidizing population in aquarium biofilters, FEMS Microbiology Ecology 52:1–11 26 Jordening H J and Pramer D, 2010 Enviromental Biotechnology concepts and applications 27 Koops, H.P and Pommerening – Roser, A, 2001 Distribution and ecophysiology of the nitrifying bacteria emphasizing cultured species FEMS Microbiol Ecol 37:1–9 28 Manuela Cocia, Daniela Riechmann, Paul L.E Bodelier, Stefania Stefani,Gabriel Zwart, Hendrikus J Laanbroek, 2005 Effect of salinity on temporal and spatial dynamics of amonia-oxidising bacteria from intertidal freshwater sediment 2005 FEMS Microbiology Ecology 53:359 – 368 29 Manju N J., Deepesh V., Avhuthan C., Rosama P., Singh I S B 2009 Immobilization of nitrifying bacterial, consortia on wood particles for bioaugmenting nitrification in shrimp culture system Original Research Articale 30 Pham Khac Lieu 2006 Nitrogen removal from landfill leachate using a single – stage process combining anammox and partial nitritation Kumamoto University 40 31 Painter H A 1970 A review of literature inorganic nitrogen metabolism in microorganisms Water Pollution Research Laboratory, Stevenage, England 32 Patrick Chain, Jane Lamerdin, Frank Larimer, Warren Regala, Victoria Lao, Miriam Land, Loren Hauser, Alan Hooper, Martin Klotz, Jeanette Norton, Luis Sayavedra – Soto, Dave Arciero, Norman Hommes, Mark Whittaker, and Daniel Arp 2003 Complete Genome Sequence of the Amonia – Oxidizing Bacterium and Obligate Chemolithoautotroph Nitrosomonas europaea 185: 2759 – 2773 33 Park Hee – Deung, Daniel R., Noguera 2004 Evaluating the effect of dissolved oxygen on amonia – oxidizing bacterial communities in activated sludge Department of Civil and Environmental Engineering, 1415 Engineering Drive, University of Wisconsin, Madison, WI 53706, USA Water Research 38: 3275 –3286 34 Purkhold U 2000 Phylogeny of All Recognized Species of Amonia Oxidizers Based on Comparative 16S rRNA and amoASequence Analysis : Implications for Molecular Diversity Surveys Appl Environ Microbiol; 66 : 5368 – 5382 35 Turk O., Mavinic D.S 1986 Preliminary Assessment of a shortcut in Nitrogen Removal from wastewater WEF – USA 36 Ulrike Purkhold, Andreas Pommerening – Röser, Stefan Juretschko, Markus C., Schmid, Hans – Peter Koops and Michael Wagner 2000 Phylogeny of All Recognized Species of Ammonium Oxidizers Based on Comparative 16S rRNA and amoASequence Analysis: Implications for Molecular Diversity Surveys Applied and Environmental 37 Villaverde S 1997.Influence of pH over nitrifying biofilm activity in submerged biofilters Environment Technology Group, Chemical Engineering Department, University of Valladolid, 47011 Valladolid, Spain 41 ... khuếch đại gen 16S rDNA Mồi Trình tự ( 5? ?-3 ’) Nhiệt Số nucleic Kích thước (bp) độ(Tm) 357F 5’-CCTACGGGAGGCTGCAG-3’ 59,6 17 177 534R 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’ 57,2 17 177 ( Phạm Khắc Liệu, 2006)... vi khuẩn Nitrosomonas - Nước thải chế biến thuộc da Công ty TNHH Tỷ Cao Thắng - Nước thải chế biến nước mắm Công ty nước mắm Liên Thành - Nước thải từ lị mổ Cơng ty Vissan - Nước thải chế biến...  Hóa chất dùng kiểm tra sinh hóa - Thuốc thử Griss A: axit sulfanilic (C6H7NO3S), axit acetic 10% (C2H4O2) - Thuốc thử Griss B: α – nathylamine (C10H7NH2) - Thuốc thử hỗn hợp 1: phenol natri