Đánh giá khả năng áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và chitosan phân tử lượng thấp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM -------- NGUYỄN ĐỨC NHẪN ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG PHẢN ỨNG FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CHITOSAN VÀ CHITOSAN

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



NGUYỄN ĐỨC NHẪN

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG PHẢN ỨNG FENTON

ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CHITOSAN VÀ CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

GVHD: TS HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

Nha Trang, năm 2013

Trang 2

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN 4

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 5 DANH MỤC HÌNH 6 LỜI MỞ ĐẦU 9

Chương 1: TỔNG QUAN 11 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN 11

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN 12

1.2.1 Tính chất của Chitosan 13

1.2.2 Ứng dụng của chitosan 15

1.3 TỔNG QUAN VỀ COS 16

1.3.1 Một số ứng dụng của COS 17

1.3.2 Một số phương pháp sản xuất chitosan phân tử lượng thấp 19

1.3.3 Sản xuất Chitosan phân tử lượng thấp bằng H 2 O 2 20

1.4 QUÁ TRÌNH OXY HÓA VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA 21

1.4.1 Gốc tự do 21

1.4.2 Định nghĩa chất chống oxy hóa 21

1.4.3 Ảnh hưởng của gốc tự do tới cơ thể [16] 22

1.4.4 Chất chống oxy hóa [8], [9], [18] 23

1.4.5 Cơ chế chống oxy hóa của chitosan [4] 24

1.4.6.Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hoá của chitosan trên thế giới và Việt Nam 25

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 26

1.5.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH 27

1.5.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử 28

1.5.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa và khả năng khử gốc hydroxyl tự do 28

1.5.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử H 2 O 2 28

1.5.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl 2 /H 2 O 2 29

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 30

2.1.1 Nguyên vật liệu 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl 2 /H 2 O 2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS 31

2.2.2 Các phương pháp phân tích 33

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 41

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 KHẢ NĂNG KHỬ GỐC TỰ DO DPPH CỦA CHITOSAN VÀ CÁC COS 42

3.1.1 Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan 42

3.1.2 Khả năng khử gốc tự do DPPH của COS1 42

3.2 TỔNG NĂNG LỰC KHỬ CỦA CHITOSAN VÀ CÁC COS 46

3.2.1 Tổng năng lực khử của chitosan 46

3.2.2 Tổng năng lực khử của COS1 47

Trang 3

3.3 KHẢ NĂNG KHỬ H 2 O 2 CỦA CHITOSAN VÀ COS 50

3.3.1 Khả năng khử H 2 O 2 của chitosan 50

3.3.2 Khả năng khử gốc tự do H 2 O 2 của COS1 50

3.4 PHÂN TÍCH KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CHITOSAN VÀ COS DỰA VÀO CHỈ SỐ TBARS THEO MÔ HÌNH PHẢN ỨNG FENTON 54

3.4.1 Khả năng chống oxy hóa lipid của chitosan 54

3.4.2 Khả năng chống oxy hóa lipid của COS1 54

3.5 SỰ TƯƠNG QUAN GIỮA KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA LIPID THEO MÔ HÌNH PHẢN ỨNG FENTON VÀ KHẢ NĂNG KHỬ GỐC TỰ DO DPPH 58

3.5.1 Tương quan giữa Fenton và DPPH (mẫu chitosan) 58

3.5.2 Tương quan giữa Fenton và DPPH (mẫu COS1) 59

3.6 TƯƠNG ĐƯƠNG GIỮA KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA LIPID THEO MÔ HÌNH PHẢN ỨNG FENTON VÀ PHƯƠNG PHÁP TỔNG NĂNG LỰC KHỬ 61

3.6.1 Tương quan giữa Fenton và tổng năng lực khử (mẫu chitosan) 61

3.6.2 Tương quan giữa Fenton và tổng năng lực khử (mẫu COS1) 62

3.7 TƯƠNG QUAN GIỮA KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA LIPID THEO MÔ HÌNH PHẢN ỨNG FENTON VÀ KHẢ NĂNG KHỬ H 2 O 2 65

3.7.1 Tương quan giữa Fenton và phương pháp khử H 2 O 2 (mẫu chitosan) 65

3.7.2 Tương quan giữa Fenton và phương pháp khử H 2 O 2 (mẫu COS1) 66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 70 1 KẾT LUẬN 70

2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 73

Trang 4

LỜI CÁM ƠN

Trải qua 4 năm dưới mái trường Trường Đại học Nha Trang, đó là khoảng thời gian

vô cùng ý nghĩa đối với mỗi sinh viên, tại đây em đã được học tập, nghiên cứu và tìm tòi những kiến thức mới góp phần cũng cố và nâng cao tầm hiểu biết của mình trong lĩnh vực chuyên môn Em xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hỗ trợ để em hoàn thành khóa học và làm tốt đồ án tốt nghiệp

Lời cám ơn chân thành tới TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo đã trực tiếp hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian làm thực tập tốt nghiệp

Xin chân thành cám ơn quý thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang đã nhiệt tình giải đáp những thắc mắc khó khăn gặp phải trong quá trình thực hiện đồ án

Cám ơn cán bộ phòng thí nghiệm các bộ môn Công nghệ Chế biến, Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Hóa-Vi sinh, viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài của mình

Cám ơn sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ và hỗ trợ trong thời gian vừa qua

Nha Trang, tháng 06 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đức Nhẫn

Trang 5

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan 73

2 Bảng 2 Khả năng khử gốc tự do DPPH của COS1 73

9 Bảng 9 Khả năng khử H2O2 của chitosan 77

13 Bảng 13 Phân tích khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chitosan theo mô hình Fenton trong hệ FeCl

BẢNG MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Trang 6

DANH MỤC HÌNH

4 Hình 1.4 Minh họa cơ chế cắt mạch chitosan bằng H2O2 21

5 Hình 1.5 Cơ chế tác động của gốc tự do đến tế bào 22

7 Hình 1.7 Phương trình phản ứng giữa MDA và thiobarbituric 30

8 Hình 2.1 Sơ đồ minh họa phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl

2/H2O2. 33

9

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng áp dụng môi

hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 để phân tích hoạt

11 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH của dung dịch chitosan và COS 35

13 Hình 2.6 Phản ứng tạo phức màu xanh dương 37

14 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích tổng năng lực khử của dung dịch chitosan và COS. 37

15 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích khả năng khử H2O2 của

16 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl

2/H2O2 41

17 Hình 3.1: Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan ở các nồng độ khác 43

18 Hình 3.2: Khả năng khử gốc tự do DPPH của cos1 ở các nồng độ khác nhau 44

19 Hình 3.3 Khả năng khử gốc tự do DPPH của COS2 ở các nồng độ khác nhau 45

20 Hình 3.4 Khả năng khử gốc tự do DPPH của COS3 ở các nồng độ khác nhau 46

21 Hình 3.5 Tổng năng lực khử của chitosan ở các nồng độ khác nhau 47

22 Hình 3.6 Tổng năng lực khử của COS1 ở các nồng độ khác nhau 48 Error! Bookmark not defined

Trang 7

23 Hình 3.7 Tổng năng lực khử của COS2 ở các nồng độ khác nhau 49

24 Hình 3.8 Tổng năng lực khử của cos3 ở các nồng độ khác nhau 50

25 Hình 3.9 Khả năng khử H2O2 của chitosan 51

26 Hình 3.10 Khả năng khử H2O2 của COS1 52

28 Hình 3.11 Khả năng khử H2O2 của COS2 53

29 Hình 3.12 Khả năng khử H2O2 của COS3 54

30 Hình 3.13 Khả năng chống oxy hóa lipid cua chitosan 55

31 Hình 3.14 Khả năng chống oxy hóa lipid của COS1 56

34

Hình 3.17 Sự tương quan giữa khả năng chống oxy hóa

lipid theo phản ứng Fenton và khả năng khử gốc tự do

35

lipit theo phản ứng Fenton và khả năng khử gốc tự do

36

37

Hình 3.20: Sự tương quan giữa khả năng chống oxy hóa

38

lipid theo mô hình phản ứng Fenton và phương pháp tổng

39

40

41

42

lipid theo mô hình phản ứng Fenton và khả năng khử gốc

43 Hình 3.26: Sự tương quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid theo mô hình phản ứng Fenton và khả năng khử gốc 68

Trang 8

tự do H2O2 của mẫu COS1

44 Hình 3.27 Sự tương quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid theo mô hình phản ứng Fenton và khả năng khử gốc

45 Hình 3.28 Sự tương quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid theo mô hình phản ứng Fenton và khả năng khử gốc

tự do H2O2 của mẫu COS3

70

Trang 9

LỜI MỞ ĐẦU

Như chúng ta đã biết gốc tự do là một thuật ngữ từ lâu đã quen thuộc với giới y khoa, nhưng vẫn còn rất mới mẻ đối với cộng đồng Phần lớn hiện vẫn chưa lường hết được sự nguy hiểm của gốc tự do đối với sức khỏe, đặc biệt là với bộ não – cơ quan quan trọng nhất của cơ thể.Vậy gốc tự do là gì và tại sao chúng lại có sự nguy hiểm rất lớn với cơ thể như vậy?

Gốc tự do (free radical) là những nguyên tử hay phân tử bị mất đi một điện tử ở lớp

vỏ ngoài cùng Chúng sinh ra liên tục trong quá trình chuyển hóa của cơ thể hoặc hình thành dưới tác động của các yếu tố bên ngoài như ô nhiễm môi trường, stress, rượu bia, thuốc lá…Do bị mất điện tử nên gốc tự do rất không ổn định và luôn có xu hướng chiếm đoạt điện

tử từ các cấu trúc lân cận, tạo ra hàng loạt gốc tự do mới Quá trình này diễn ra theo phản ứng dây chuyền, gây tổn thương màng tế bào, các phân tử protein và ngay cả ADN Hậu quả là xuất hiện những biến đổi làm tổn hại, rối loạn chức năng, thậm chí gây chết tế bào

Chính vì nguy hại như vậy, gốc tự do được xem là “sát thủ giấu mặt” gây ra quá trình lão hóa và phần lớn các bệnh tật Y học hiện đại đã thống kê, sự tấn công của gốc tự do gây

ra hơn 60 loại bệnh khác nhau, trong đó đặc biệt nguy hiểm là các bệnh ảnh hưởng đến não

bộ như suy giảm trí nhớ, sa sút trí tuệ, Alzheimer, tai biến mạch máu não

Theo thời gian, gốc tự do không ngừng sản sinh và gây hại Theo một nghiên cứu mới đây cho biết mỗi ngày một tế bào phải hứng chịu 10.000 đợt tấn công của các gốc tự

do Và trong suốt 70 năm cuộc đời, chúng ta sẽ phải liên tục chống chọi với 17 tấn gốc tự do,trong khi hệ thống phòng vệ của cơ thể lại từng bước suy yếu dần Do đó, để bảo vệ sức khỏe - đặc biệt là bộ não, cần hạn chế các yếu tố tăng sinh gốc tự do, và bổ sung các chất chống gốc tự do cho cơ thể

Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống "chất chống ôxy hoá nội sinh" không đủ sức cân bằng để vô hiệu hoá, các nhà khoa học đặt vấn đề dùng các "chất chống ôxy hóa ngoại sinh" (tức là từ bên ngoài đưa vào cơ thể) với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khoẻ, chống lão hoá Các chất chống ôxy hoá ngoại sinh đó đã được xác định, đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenol Các chất ôxy hoá ngoại sinh đó thật không xa lạ, chúng có từ các nguồn thiên nhiên là thực phẩm như rau cải, trái cây tươi và một số loại dược thảo.và gần đây, các nhà khoa học Mỹ

đã chiết xuất thành công chất chống gốc tự do từ thiên nhiên, nổi bật như Anthocyanin, Pterostilbene có trong Blueberry sinh trưởng ở Bắc Mỹ Anthocyanin, Pterostilbene có khả năng tiêu diệt gốc tự do mạnh mẽ, hạn chế sự tổn thương thành mạch, cải thiện lưu lượng máu lên não, giảm thiểu các triệu chứng của bệnh lý mạch máu não, cải thiện tình trạng đau đầu, chóng mặt, hoa mắt, mất thăng bằng, mất ngủ, ù tai, rối loạn cảm giác, yếu liệt nửa người Đồng thời, các chất chống gốc tự do này giúp bảo vệ và tăng cường hoạt động tế bào thần kinh, cải thiện trí nhớ, tăng khả năng tập trung, chống căng thẳng/stress

Song hành cùng với sự phát triển của con người là những nhu cầu sử dụng thực phẩm

có chất lượng cao mà đi kèm với nó là những yêu cầu, những đòi hỏi tuyệt đối về nguồn gốc, chất lượng và giá trị của thực phẩm Để đáp ứng được những nhu cầu đó thì trong công nghệ chế biến và bảo quản cần hạn chế những biến đổi, trong đó quá trình oxy hóa gây ra nhiều ảnh hưởng đến thực phẩm Nên việc tìm ra và sử dụng hợp lý các chất chống oxy hóa

Trang 10

là rất cần thiết

Hiện nay trong quá trình sản xuất đã sử dụng các chất chống oxy hóa tổng hợp như: BHA, BHT, Propyl gallate… Tuy nhiên, các chất chống oxy hóa tổng hợp dù ít hay nhiều cũng đều có ảnh hưởng gây hại tới sức khỏe con người Vì vậy, tìm kiếm và sử dụng chất chống oxy hóa từ tự nhiên để hạn chế sự oxy hóa của thực phẩm là rất cần thiết

Bên cạnh các chống oxy hóa từ tự nhiên như: Anthocyanin, Pterostilbene, caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenol… còn có một hợp chất polymer trong tự nhiên nữa cũng có khả năng chống oxy hóa, khử gốc tự do… và quan trong hơn hết là chúng tồn tại rất nhiều trong tự nhiên, sản lượng khoảng lên tới khoảng vài nghìn tấn mỗi năm Đó là chitin, chitosan và các dẫn xuất của nó

beta-Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghệ sinh học, y tế,

xử lý nước, mỹ phẩm, nông nghiệp, thực phẩm và ngành dệt Tuy nhiên, chitosan có trọng lượng phân tử lớn do khả năng hoà tan thấp của nó trong nhiều dung môi Điều này đã giới hạn những ứng dụng của nó đặc biệt trong ngành thực phẩm và y tế Để cải thiện khả năng hoà tan và đặc tính sinh học, hoá học và vật lý nhiều phương pháp đã được tiến hành để sản xuất ra loại chitosan có trọng lượng phân tử thấp với việc không làm biến đổi cấu trúc hoá học

Chitosan trọng lượng phân tử thấp có một số đặc tính đặc biệt như kết hợp với lipid, ngăn cản sự phát triển của u biếu, là tác nhân miễn dịch và có nhiều các ứng dụng trong y

tế Chitosan có trọng lượng phân tử thấp (5-20kDa) dường như có tác dụng lên chức năng sinh hoá so với chitosan có trọng lượng phân tử cao hơn Chitosan có trọng lượng phân tử thấp trong khoảng 5-10kDa có khả năng ức chế mạnh với nhiều loại tác nhân gây bệnh bao

gồm: Fusarium oxyporum, Phomopsis fukushi, Alternaria alternate

Với đặc tính kháng khuẩn và chống oxi hóa, chitosan được coi là hoạt chất sinh học

rẻ tiền, sẵn có và có nguồn gốc tự nhiên ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Đã có một vài nghiên cứu ứng dụng tính kháng khuẩn của chitosan trong bảo quản thực phẩm như các loại hoa quả và rau, các loại thịt cá, nước quả Tuy vậy các nghiên cứu còn chưa nhiều và chưa đưa ra được các quy trình ứng dụng chitosan và dẫn xuất trong bảo quản thịt Các nghiên cứu ứng dụng khả năng chống oxi hóa của chitosan và COS trong bảo quản thực phẩm còn rất hiếm Gần đây, khi chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: Đại học Nha Trang, Đại học Nông Lâm, Đại học Bách khoa Hà Nội… đã tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng hợp chất này Tuy nhiên, chất lượng sản xuất và ứng dụng của nó chưa được đánh giá đầy đủ Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng chitosan và dẫn xuất của chitosan là hướng đi mới, có cơ sở khoa học và đúng đắn

Xuất phát từ những lý do trên nên đề tài: “Đánh giá khả năng áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và chitosan phân tử lượng thấp’’

là một hướng nghiên cứu cần thiết và mang tính khoa học rất cao

Nội dung của đề tài bao gồm:

 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và chitosan phân tử lượng thấp áp dụng mô hình phản ứng Fenton

 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và chitosan phân tử lượng thấp dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử H2O2

 Phân tích mối tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa áp dụng theo mô hình phản ứng Fenton với khả năng khử DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử

Trang 11

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN

Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin tồn tại cả ở động vật, thực vật

Đối với cơ thể động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong thế

giới thực vật chitin có ở thành tế bào của một số nấm và tảo như nấm Zygemycether, một số tảo Chlorophiceae, nấm bất toàn (Fugiimperfecti), tảo khuẩn (Phycomycetes),

Trong động vật thủy sản đặc biệt trong vỏ tôm, cua, ghẹ và xương mực hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ cao, từ 14 – 35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ, xương mực là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng

Chitin là polysaccharide chứa đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là một tập hợp các phân tử liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Chitin rất hiếm tồn tại ở trạng thái tự do, hầu như luôn liên kết bởi các cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác trong vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ [6] chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị N – acetyl – β –

D Glucosamin nối với nhau nhờ cầu nối β – 1,4 Glucozit Có công thức phân tử là [C8H13O5]n , trong đó n thay đổi phụ thuộc vào nguyên liệu

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Chitin

Trang 12

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN

Chitosan là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β – D Glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β – 1,4 Glucozit Có công thức phân tử là [C6H11O4N]n với phân tử lượng : Mchitosan = (161.07)n [6]

Hình 1.2 : Công thức cấu tạo của Chitosan

Trong thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan khoảng 10% Vì vậy công thức chính xác của phân tử chitosan như sau [7]

Trong đó tỷ lệ thuộc vào mức độ đề acetyl hóa

Công thức phân tử của chiotan là: ( C6H11O4 )n Phân tử lượng: M=1000-5000 Dalton tùy loại Trong mỗi mắt xích phân tử của chitosan có chứa nhóm amin nên nó là một polyamin Chitosan là dẫn xuất của chitin, được sản xuất từ chitin sau khi xử lý chitin trong môi trường kiềm đặc nóng Chitosan có những tính chất đặc biệt hơn chitin: có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng tan trong môi trường acid acetic loãng tạo thành dung dịch dạng keo, nhớt và trong suốt, chitosan có thể kết hợp với aldehyde để tạo gel Vì vậy, khả năng ứng dụng của chitosan rất rộng rãi

Trang 13

1.2.1 Tính chất của Chitosan

Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic pKa của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 Khi hòa tan

Trang 14

chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo dương Đây là một điểm rất đặc biệt vì

đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm Chitosan tích điện dương sẽ có khả năng bám dính bề mắt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các kim loại và tương tác tốt với các polyme tích điên âm

Tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt hơn Tương tự, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl cao Cụ thể, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có độ deacetyl trên 90% Tuy nhiên, khả năng hút nước chỉ chitosan thì giảm đi khi tăng độ deacetyl Kết quả nghiên cứu của Trung và cộng sự (2006) cho thấy khả năng hút nước của chitosan có độ deacetyl thấp (75%) đạt đến 659% cao hơn nhiều so với chitosan có độ deacetyl hóa cao (96%) chỉ đạt 486%

1.2.1.1 Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan

Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương và vi nấm Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương ở vị trị carbon thứ 2 ở pH nhở hơn 6 Chitosan có độ deacetyl cao trên 85% thì có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt

Chitosan có phân tử lượng dưới 2000 dalton thì khả năng tức chế vi sinh vật kém Chitosan có phân tử lượng trên 9000 dalton có khả năng ức chế vi sinh vật cao (Jeon và cộng sư, 2000) Tuy nhiên, chitosan có phân tử lượng lớn thì khả năng kháng khuẩn cũng thấp Chitosan được hòa tan trong dung môi hữu cơ như acid acetic, acid lactic và được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm

Chitosan có khả năng ức chế Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia

coli, saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutensis, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger Nồng độ ức chế phụ thuộc vào loại chitosan, loài vi sinh vật,

điều kiện áp dụng, và thường được sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5% Ngoài ra các dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn tốt N-carboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1-5 mg/ml trong môi trường pH 5,4 làm giảm khả năng

sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Shahidi và cộng sự,

1999)

1.2.1.2 Khả năng tạo màng của chitosan

Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt Tính chất cơ lý của màng chitosan như độ chịu kéo, độ rắn , độ ngấm nước, phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng và độ deacetyl hóa của chitosan Chitosan độ deacetyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài hạn cao hơn màng chitosan độ deacetyl thấp Tuy nhiên, chúng có độ trương nở thấp hơn

Ngoài ra, tính chất của màng chitosan phụ thuộc rất nhiều vào dung môi sử dụng hòa tan chitosan Để tạo màng, độ rắn (crystallinity) của màng chitosan cũng phụ thuộc vào dung môi sử dụng

1.2.1.3 Các tính chất khác của chitosan

Ngoài các tính chất nêu trên, chitosan còn có khả năng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của chitosan cũng phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan Chitosan có độ nhớt thấp thì có khả năng chống oxy hóa cao

Trang 15

Hơn nữa, Chitosan có thể gắn kết tốt với lipid, protein, các chất màu Do chitosan không tan trong nước nên chitosan ổn định hơn trong môi trường nước so với các polymer tan trong nước như alginat, agar Khả năng tạo phức, hấp phụ với protein, lipid và chất màu phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng, độ deacetyl hóa, độ rắn và độ tinh khiết của chitosan và thường biến động lớn với các mẫu chitosan Chitosan có độ deacetyl cao thì thường hấp phụ màu tốt

1.2.2 Ứng dụng của chitosan

1.2.2.1 Ứng dụng chitosan trong thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan là hợp chất polymer tự nhiên an toàn với những tính chất đặc trưng như khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, tạo màng, tạo gel, hấp phụ màu nên chitosan được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chế biến vào bảo quản thực phẩm

Nhiều kết quả nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về khả năng kéo dài thời gian bảo quản cảu nhiều đối tượng rau quả tươi, thịt, nước quả của chitosan và các dẫn xuất của nó Chitosan cũng được sử dụng để bảo quản quả tươi (đào, lê, kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà chua, quả vải, xoài, nho ) Ở Việt nam, chitosan cũng đã được sử dụng trong bảo quản xúc xích sản xuất chả giò [7]

1.2.2.2 Ứng dụng chitosan trong nông nghiệp và thủy sản

+ Trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để tăng cường sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất và tăng cường khả năng nẩy mầm của hạt, giảm stress cho cây, kích thích sinh trưởng và tăng năng suất thu hoạch Đặc biệt, chitosan có đóng vai trò là chất kích thích hệ miễn dịch của cây (plant defence booster) và sự hoạt động của enzyme chitinase Chitosan được nghiên cứu thử nghiệm phun lên rau cải (Brassica campestrissp.) cho lượng cải thu hoạch tăng lên Hạt giống ngâm bằng chitosan và phun chitosan lên lá có thể tăng năng suất lên 1,6 lần Đối với hạt giống lúa mì, khi được xử lý trong dung dịch chitosan thì tỷ lên nảy chồi hình thành cây con tăng lên 25%, rễ và lá phát triển mạnh hơn so với mấu không xử lý chitosan

Để mở rộng ứng dụng của chitin, chitosan cần phát triển nghiên cứu thử nghiệm trên các đối tượng cây trồng khác nhau, thử nghiệm nhiều loại chitosan, tìm ra loại chitosan, lương sự dụng cho từng loại cây và từng giai đoạn phát triển của cây Phát triển lợi thế đa chức năng, đa tác dụng khi sử dụng chitosan như bảo vệ hạt giống, bảo vệ cây trồng, tăng năng suất

+ Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản:

Chitosan được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá để kích thích sinh trưởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trường ao nuôi Thức ăn bổ sung chitosan có khả năng làm tăng sự phát triển và tỷ lệ sống của cá so với thức ăn bình thường Ngoài ra chitosan cũng được ứng dụng làm màng bao, làm chất kết dính để làm tăng độ ổn định của thức ăn tôm

1.2.2.3 Ứng dụng chitosan trong xử lý môi trường

Chitosan được ứng dụng khá phổ biến trong xử lý môi trường nhờ khả nănghấp phụ, tạo phức với các ion kim loại (Pb, Hg, Cd, Fe, Cu …), các chất màu, khả năng keo tụ, tạo bông rất tốt với các chất hữu cơ Do đó, chitin, chitosan được sử dụng như là một trong các tác nhân chình để xử lý nước thải

Trang 16

1.2.2.4.Ứng dụng chitosan trong y học và công nghệ sinh học

Chitosan và dẫn xuất có các tính chất quan trọng như tương thích sinh học cao, tự phân hủy sinh học, khả năng tạo màng, không độc, có khả năng làm lành vết thương, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus nên chúng được nghiên cứu và triển khai ứng dụng nhiều trong y học Hiện nay, chitin và chitosan đã được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực kiểm soát quá trình giải phóng thuốc (drug release control), vận chuyển làm chất mang DNA trong liệu pháp gene, thuốc giảm béo, thuốc chữa khớp, trị bỏng, da, chỉ nhân tạo, kháng viêm Tượng tự, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chitin, chitosan và dẫn xuất được ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào động thực vật, cố định enzyme, cố đinh tế bào, làm chất mang DNA

1.2.2.5 Ứng dụng của chitosan trong công nghiệp

Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in, phim ảnh: Chitosan dung làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm Trong công nghiệp giấy, do cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn [6]

Trong công nghiệp dệt, dung dịch chitosan có thể thay hồ tinh bột để hồ vải Nó có tác dụng làm sợi tơ bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid và kiềm nhẹ Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải cold

Trong hoá mỹ phẩm: Chitosan được sử dụng để sản xuất kem giữ ẩm chống khô da, làm mềm da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm NH4+ Các nhóm này liên kết với tế bào sừng hoá của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da ngăn ngừa tia cực tím

1.3 TỔNG QUAN VỀ COS

COS có nguồn gốc từ chitin – chitosan bởi sự thủy phân của enzyme hoặc acid COS

có khối lượng phân tử thấp vì vậy có khả năng hòa tan tốt trong nước và là một chất có hoạt tính sinh học

COS được xem như một thực phẩm chức năng, có khả năng chống vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, chống cholesterol, chống ung thư, chống oxy hóa, có khả năng làm tăng chức năng miễn dịch, chống bướu, chống bệnh tim mạch

COS là một saccharide, được kết hợp bởi các monosaccharide từ 2 đến 10 trong cấu trúc của chitin và chitosan

COS ở dạng bột, có màu trắng hoặc hơi vàng, không có mùi, vị đặc biệt Chúng có khả năng tan tốt trong nước, độ nhớt thấp, phân tử lượng nhỏ và dễ kết tinh, có tính chất hoạt động sinh học: Tăng sức đề kháng, điều hòa lượng cholesterol, cải thiện thiếu máu, bệnh gan, điều hòa huyết áp trong máu, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, thúc đẩy quá trình bài tiết acid Uric chống thư, bướu, tham gia hình thành xương sụn, trị được các bệnh: viêm loét dạ dày, bệnh tiêu chảy, bệnh táo bón, chuột rút, đặc biệt có khả năng kết hợp với mangan tham gia vào quá trình hình thành xương sụn rất tốt Khi thủy phân chitin, chitosan bằng acid hoặc enzyme sẽ cắt đứt các liên kết glucozit giải phóng các COS

Cơ chế sản xuất COS từ chitosan [10]

Trang 17

1.3.1.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Ở Mehico, các loại bánh bắp thường được bảo quản nhân tạo không đảm bảo sức khỏe con người Trong một nghiên cứu sử dụng khả năng kháng nấm của chitosan oligosaccharide để bảo quản bánh bắp Người ta tiến hành phân cắt chitosan bằng chitosanase trong 2, 4, 8 và 14h Kết quả cho thấy khả năng kháng nấm Aspergillus của chitosan oligosaccharide được phân cắt sau 4h là tốt nhất.Vì thế, chitosan oligosaccharide

có thể được dùng thay thế các chất bảo quản nhân tạo trong bảo quan bánh bắp cũng như các thực phẩm khác Đối với thực phẩm chức năng, chitosan oligosaccharide có thể sử dụng làm thành phần trong thực phẩm tốt hơn chitosan và chitin do khả năng tan hoàn toàn trong nước Chất này có độ ngọt thấp, năng lượng thấp, không gây ra phản ứng phụ, có khả năng

hạ thấp lượng mỡ và đường trong máu và tăng cường khả năng của hệ miễn dịch Chitosan oligosaccharide không chỉ kích thích sự phát triển của nhóm bacillus mà còn kìm hãm quá trình sinh sản của vi sinh vật gây bệnh và nắm gây độc trong ruột người

Trang 18

1.3.1.2 Ứng dụng trong mỹ phẩm

Chitosan oligosaccharide phát huy tính năng giữ ẩm hiệu quả trong lĩnh vực này Chất này được sử dụng trong các sản phẩm sữa rửa mặt và kem Chitosan oligosaccharide trong thành phần mỹ phẩm không những ngăn ngừa được sự mất đi độ ẩm của sản phẩm trước và sau khi sử dụng trên da mà còn dễ dang thâm sâu vào da, mang theo các thành phần chăm sóc da khác trong sản phẩm và tăng tuần hoàn máu

ký sinh trùng gây bệnh)

Tác động tế bào: chitosan oligosaccharide tăng cường sự sinh sản và tiết ra kháng thể IgM của tế bào lai HB4C5 trên người trong thử nghiệm invitro Còn thử nghiệm in vivo, chitosan oligosaccharide có tác dụng tăng mức IgM và IgG trong huyết tương, tăng cường lượng lectin kích thích phân bào và khả năng tăng cường khả năng phân bào của chuột

Bảo vệ gan: trong khi chitosan thường chỉ có tác dụng trong vùng dạ dày và ruột và không được hấp thụ vào trong hệ thống tiêu hóa, chitosan oligosaccharide có thể đi đến ruột kết và được cắt nhỏ trước khi hấp thụ vào trong cơ thể

Chitosan oligosaccharide bảo vệ gan rất hiệu quả Một ví dụ điển hình là khi uống rượu, thông thường, sau khi vào cơ thể, rượu sẽ được chia nhỏ và sẽ thành các acetaldehyde gây ra nhức đầu, mệt mỏi và hại gan Chitosan oligosaccharide có thể phân cắt nhanh các acetaldehyde thành những chất không độc, giảm được độ thấm của rượu và acetaldehyde, giảm nồng độ rượu trong máu và thúc đẩy quá trình hồi phục trong những rối loạn sau khi uống rượu Vì thế, chitooligosaccharide có thể được thêm vào thức uống có cồn như bia, rượu

Tác động đến các chỉ số huyết học: chitooligosaccharide có khả năng giảm lượng mỡ

và đường trong máu, hạ cholesterol, giảm nồng độ uric acid trong máu, điều chỉnh huyết áp, tăng sự hấp thụ canxi vào cơ thể, ngăn ngừa táo bón và bệnh tim Hiệu quả chống bệnh tiểu đường của chitooligosaccharide đã được chứng minh dựa trên mô hình chuột sơ sinh bị tiểu đường không phụ thuộc insulin do kích thích streptozotocin Hàm lượng đường trong máu giảm khoảng 19% khi cho chuột uống 0,3% chitooligosaccharide Sau khi uống chất này trong 4 tuần, hàm lượng đườngtriglyceride giảm 49% so với nhóm đối chứng Mức cholesterol trong máu chuột thí nghiệm giảm khoảng 10% Các triệu chứng của bệnh tiểu đường như tạo không bào ti thể, hiện tượng phân tách và thoái hóa cơ giảm hẳn nhờ uống chito-oligosaccharide

Chitosan trọng lượng phân tử thấp có một số đặc tính đặc biệt như kết hợp với lipid, ngăn cản sự phát triển của u bướu, là tác nhân miễn dịch và có nhiều các ứng dụng trong y

tế Chitosan có trọng lượng phân tử thấp (5-20kDa) dường như có tác dụng lên chức năng sinh hoá so với chitosan có trọng lượng phân tử cao hơn

Những chitosan có trọng lượng phân tử khoảng 20 kDa ngăn ngừa được sự phát triển của bệnh đái tháo đường và biểu hiện ái lực cao với lipopolysaccharides hơn là chitosan có

Trang 19

trọng lượng phân tử 140 kDa Chitosan có trọng lượng phân tử thấp trong khoảng 5-10kDa

có khả năng ức chế mạnh với nhiều loại tác nhân gây bệnh bao gồm Fusarium oxyporum, Phomopsis fukushi, Alternaria alternate trong máu chuột thí nghiệm giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng Bên cạnh đó, hàm lượng insulin được tạo thành do sự hiện diện của đường tăng rõ rệt, mức Chitosan với trọng lượng phân tử thấp (khoảng 5kDa) ngăn ngừa được sự gia tăng của cholesterol của chuột khi sử dụng thức ăn đã được bổ sung cholesterol

Suzuki và cộng sự, 1986 đã phát hiện rằng chito-hexamer ngăn chặn sự phát triển của khối u Sarcoma-180 và Meth-A trong chuột Chitosan oligomer cũng như chitosan thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nhiều nấm mốc và vi khuẩn và đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh Hinaro và Nagao đã nghiên cứu về mối quan hệ giữa mức độ polymer hoá (DP) của chitosan với hiệu quả kháng khuẩn của chitosan Nghiên cứu kết luận rằng chitosan oligome (DP 2÷8), như chitosan trọng lượng phân tử thấp, thể hiện khả năng ức chế hiệu quả hơn chitosan phân tử lượng cao đối với hầu hết vi khuẩn gây bệnh như Fusariumoxyporum, Phomopsis fukushi, Alternaria alternata và nhiều chủng khác Kendra cũng đã giải thích rằng sự hiện diện của một số chitosan oligome có hoạt tính sinh học trên đậu hà lan đã hạn chế sự phát triển của nấm mốc

1.3.2 Một số phương pháp sản xuất chitosan phân tử lượng thấp

Chitosan được nghiên cứu thủy phân bằng nhiều phương pháp, có thể sử dụng phương pháp sinh học hoặc hoá học Có hơn 30 loại enzyme có thể được sử dụng để cắt mạch chitosan Tuy vậy phương pháp này vẫn còn những hạn chế khi sản xuất ở quy mô lớn Chitosan có trọng lượng phân tử thấp đạt được bằng việc depolymer bởi enzyme đã được nghiên cứu bởi Nagasawa và cộng sự Acid hydrochloric đã được dùng để thuỷ phân chitosan và sau đó những nổ lực khác trong việc sử dụng acid nitrous, acetic acid, acid sulfuric và acid hydrofluoric để cắt mạch chitosan cũng đã được tiến hành Các tác giả Allan, Chang, Tanioka và cộng sự 1995, đã sản xuất thành công chitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng việc cắt mạch bởi các tác nhân oxy hóa như ozone, Natri nitrite và hydroperoxit Dưới đây là một số phương pháp sản xuất chitosan phân tử lượng thấp thông dụng:

- Lấy 2g chitosan hoà tan trong 100ml dung dịch acid acetic, sau đó sấy khô đến khối lượng không đổi thu được dạng keo Sau đó lấy 100ml dung dịch HCl(đđ) 37% bổ sung vào khuấy đều và nâng lên nhiệt độ 72 0C trong 30 phút khuấy đảo Phản ứng được kết thúc bằng cách cho vào trong nước đá Phần lớn các dung môi và acid HCl bay hơi trong điều kiện hút chân không Bã còn lại hoà tan trong nước và cô đặc, sau cùng tách ra làm hai, phần cặn hoà tan trong nước điều chỉnh pH=6,5 bằng NaOH 10M Dịch thuỷ phân sau khi trung hoà được kết tủa bằng metanol 90% và tách rửa sạch, sấy khô chân không thì thu được chitosan hoà tan trong nước

- Lấy 0,25g chitosan trộn với 25ml dung dịch acid H2SO4 có 72, 216 360mM trong bình thủy tinh 100ml đậy kín đun 120 0C trong 5-24 phút Hỗn hợp làm nguội bằng nước đá và điều chỉnh pH về 8-10 bằng dung dịch NaOH 30ml (150, 450, 750mM) kết tủa chitosan được tách ra và rửa bằng nước cho đến trung tính Sau đó lọc tách chitosan rửa về trung tính và sấy chân không thăng hoa

- Lấy chitosan hòa tan trong axit acetic 1% sau đó cho ENZYME

Trang 20

HEMICELLULASE vào thủy phân ở nhiệt độ 37 0C, trong thời gian 5 ngày, ở

pH = 5 và nồng độ của enzyme so với cơ chất là 2% Sau đó mang sản phẩm thủy phân đi đun cách thủy rồi đem di sấy phun ở 160 0C và thu được sản phẩm cuối cùng ở dạng bột min, màu trắng và độ ẩm thấp

1.3.3 Sản xuất Chitosan phân tử lượng thấp bằng H2O2

1.3.3.1 Quy trình sản xuất

Chitosan  Thủy phân bằng H2O2  Lọc Sấy

1.3.3.2 Cơ chế cắt mạch chitosan của H2O2 [11]

Trong qúa trình thủy phân chitosan bằng hydroperoxit, liên kiết glucoside 1,4 trong chuỗi polysaccharide bị bẻ gẫy làm giảm trọng lượng phân tử của chitosan

Quá trình cắt mạch chitosan diễn ra theo một loạt các phản ứng hóa học Chitosan ưu tiên nhận thêm một proton do H2O2 sinh ra để ion hóa nhóm NH2 trong phân tử thành NH3+

HOO-→ OH- + O*

H2O2 + HOO- → HO* + O2*- + H2O

Gốc hydroxyl có khả năng oxy hóa rất mạnh, nó phản ứng với carbohydrates rất nhanh Nhóm HO* lấy hydro nguyên tử của mạch phân tử chitosan và nước được hình thành tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân tạo thành glucosamine (GlcN) Phản ứng:

(GlcN)m−(GlcN)n + HO*→ (GlcN)m−(GlcN)n + H2O

(GlcN)m−(GlcN)n + H2O → (GlcN)m+(GlcN)n

Trang 21

Hình 1.4: Minh họa cơ chế cắt mạch chitosan bằng H2O2

(a) quá trình phá vỡ cấu trúc kết tinh, (b)quá trình phân cắt phần không kết tinh

Trong suốt quá trình phản ứng cấu trúc của chitosan không có sự thay đổi Mạch chitosan chỉ bị ngắn lại do liên kết glucoside 1,4 bị cắt đứt, còn các nhóm amino được bảo

vệ bởi axit

1.4 QUÁ TRÌNH OXY HÓA VÀ CHẤT CHỐNG OXY HÓA

Quá trình oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa

tử Một vài khi, trong diễn tiến hóa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử đó trở thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử Do đó, nó không cân bằng, đầy đủ

nên rất bất ổn, dễ tạo ra phản ứng Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinh hoạt bình thường của tế bào Trong cuộc đời của một người sống tới 70 tuổi, thì có chừng

17 tấn gốc tự do được tạo ra như vậy

Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào.Trước đó, người ta cho là gốc này chỉ có ở ngoài cơ thể

1.4.2 Định nghĩa chất chống oxy hóa

Chất chống oxy là chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác Làm giảm tác dụng của các quá trình oxy hóa nguy hiểm bằng cách liên kết với nhau và với các phân tử có hại, giảm sức mạnh phá hủy của chúng Chất chống oxy hóa ngăn quá trình

Trang 22

phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng

1.4.3 Ảnh hưởng của gốc tự do tới cơ thể [17]

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sanh

ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Ở tuổi trung niên,

cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ Nếu không bị kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên

Hình 1.5 Cơ chế tác động của gốc tự do đến tế bào

Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dường thất thoát, tế bào không tăng trưởng,

tu bổ, rồi chết Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc

tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham

Trang 23

Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già và sự chết của các sinh vật Ông ta cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng Do quan sát, người ta thấy gốc tự do có ít ở các sinh vật chết non, có nhiều hơn ở sinh vật sống lâu Người cao tuổi có nhiều gốc tự hơn là khi người đó còn trẻ

Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng

kể nhất gồm có: bệnh vữa xơ động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan

Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất phản ứng và gây ra nhiều tổn thương

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng

xạ mặt trời, thực phẩm có chất mầu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxygen

1.4.4 Chất chống oxy hóa [15], [16], [19]

Trong cơ thể, phản ứng oxy hóa tạo ra những gốc tự do Nhưng may mắn là cơ thể ta tạo ra được mấy loại enzym có khả năng trung hòa gốc tự do và mỗi phân tử enzym có thể

vô hiệu hóa nhiều ngàn gốc Các enzym đó túc trực trong cơ thể trước khi có phản ứng tạo

ra gốc tự do nên nó kịp thời đối phó với những gốc tự do này Các enzym chính là superoxide dismutase (SOD), catalase và glutathione Mỗi enzym liên hệ vào từng phản ứng hóa học riêng biệt

Ngoài ra ta có thể trung hòa gốc tự do bằng cách dùng chất chống oxy hóa (antioxidant) Các chất này chỉ mới được nhắc nhở nhiều trong dân chúng cũng như y giới khoảng mươi năm gần đây Đã có nhiều khoa học gia để tâm nghiên cứu về công dụng của chất chống oxy hóa và tây y học cũng đã có thái độ thiện cảm hơn với các chất này

Trong một cuộc hội thảo của các bác sĩ chuyên môn về tim năm 1995, 90 % tham dự viên nhận là mình có uống chất chống oxy hoá nhưng chỉ có 75 % biên toa cho bệnh nhân

Lý do là nhiều người vẫn cho là không có đủ dữ kiện xác đáng để khuyến khích bệnh nhân dùng thêm các chất này Hiệp Hội Tim Mạch Hoa Kỳ đã khuyến cáo: Một chỉ dẫn thận trọng và khoa học nhất về vấn đề này là người dân nên ăn thực phẩm có nhiều chất chống oxy hóa trong rau, trái cây và các loại hạt, thay vì uống thêm chất antioxidant

Chất này có khả năng làm mất hoạt tính của gốc tự do tích tụ trong cơ thể, biến chúng thành những phân tử vô hại, đồng thời cũng có khả năng duy trì cấu trúc và chức năng của tế bào

Tuy cơ thể có khả năng tổng hợp nên các emzyme có khả năng vô hiệu các gốc tự do nhưng các gốc tự do đó sinh ra quá nhiều khiến cơ thể không thể tổng hợp đủ các emzyme

để bảo vệ cơ thể trước nhưng mối nguy cơ này Do đó cần phải bổ sung cho cơ thể những chất có công dụng thay thế các emzym vô hiệu gốc tự do gây hại cho cơ thể

Chất chống oxy hóa được phân thành hai loại, tuỳ thuộc vào việc chúng được hòa tan trong nước hoặc trong lipid Các hợp chất này có thể được tổng hợp trong cơ thể hoặc đưa vào cơ thể qua thức ăn hoặc các loại thực phẩm bổ sung Chất chống oxy hóa được sử dụng rộng rãi như là thành phần trong chế độ ăn uống bổ sung để duy trì sức khỏe và ngăn ngừa bệnh như ung thư và bệnh tim mạch

Chất chống oxy hóa cũng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để giúp bảo vệ chống

Trang 24

lại hư hỏng thực phẩm Bởi vì oxy và ánh sáng mặt trời là hai yếu tố chính trong quá trình oxy hóa làm cho thực phẩm dễ bị hư hỏng Các chất chống oxy hóa thường dùng bao gồm các hợp chất tự nhiên có sẵn trong các loại thực phẩm cũng như các chất chống oxy hóa tổng hợp như propyl gallate (PG, E310) butylhydroquinone (TBHQ), butylated hydroxyanisole (BHA, E320) và butylated hydroxytoluene (BHT, E321) Ngoài ra, trong dịch chiết của một số thực phẩm, tertiary như trà, tim sen, rong biển và một số sản phẩm thủy sản cũng có khả năng chống oxy hoá [14]

Các yếu tố kìm hãm sự oxy hóa :

Kìm hãm sự oxy hóa bằng cách làm đứt mạch oxy hóa

RO2 + InH ROOH + In*

Gốc In* là gốc kém hoạt động, không thể tương tác với phân tử lipit Sau đó gốc In

sẽ bị vô hoạt bởi tổ hợp

RO2 + InH ROOH + In*

In* + In* In – In

RO* + In* ROIn (chất kém hoạt động)

Kìm hãm phản ứng oxy hóa bằng cách vô hoạt các hợp chất chứa kim loại có hoạt động xúc tác Các ion kim loại chuyển tiếp là yếu tố xúc tiến quá trình oxy hóa các phản ứng:

Fe2+ + ROOH Fe3+ + RO*+ OH*

Fe3+ + ROOH Fe3+ + RO2* + H*

Vì vậy, có thể chọn các chất có khả năng tạo phức với kim loại, qua đó loại trừ được khả năng chuyển hóa trị của kim loại Các chất chống oxy hóa dạng này như acid malic, acid fitic, BHT, BHA, chitosan…

1.4.5 Cơ chế chống oxy hóa của chitosan [5]

Cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể giải thích bằng nhiều cơ chế khác nhau:

- Park và cộng sự (2004) cho rằng chitosan có thể khử các gốc tự do khác nhau do tác động của nitơ vào vị trí cacbon số 2 của chitosan

- Xie và cộng sự (2001) báo cáo rằng cơ chế xử lý của chitosan có liên quan đến một thực tế là các gốc tự do có thể phản ứng với các ion hydro từ các ion amoni NH3+ để tạo thành một phân tử ổn định Các NH3+ được hình thành bởi các nhóm amin hấp thụ một ion hydro từ các dung dịch

- Jeon và cộng sự (2002) cũng cho rằng cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể là

do hoạt tính tạo phức với các ion kim loại hoặc do chitosan kết hợp với lipid Màng chitosan cũng thể hiện tác dụng hạn chế oxy hóa lipid do màng chitosan làm rào cản đối với oxy

- Trần Thị Luyến cho rằng do các nhóm amino của phân tử chitosan có thể kìm hãm sự oxy hóa lipid do tác động kiềm hãm vậy mới hạn chế được sự hoạt động oxy hóa của nhóm kim loại [7]

Trang 25

1.4.6.Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hoá của chitosan trên thế giới và Việt Nam

1.4.6.1.Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa chitosan trên thế giới

Nghiên cứu về ứng dụng của chitosan, rất nhiều tác giả cho rằng chitosan có hoạt tính sinh học tự nhiên, không độc được sử dụng trong thực phẩm với vai trò là một tác nhân tách chiết, tác nhân làm trong thành phần cho chế độ người ăn kiêng Ngoài ra, chitosan có khả năng hình thành màng đặc biệt để bao gói thực phẩm Các tính chất chức năng của màng bao chitosan bao gồm: khả năng tiêu diệt vi sinh vật, chống oxy hóa và là màng ngăn chặn sự xâm nhập của oxy rất tốt Thịt và các sản phẩm từ thịt rất dễ bị hư hỏng do vi sinh vật và quá trình oxy hóa lipid do đó các chất bảo quản thịt cần phải có cả hai đặc tính kháng khuẩn và chống oxy hóa lipid Chitosan có tính kháng khuẩn và hạn chế quá trình oxy hóa lipid nên được dùng để bảo quản thịt nhằm hạn chế quá trình hư hỏng của thịt Đặc biệt, chitosan rất phù hợp trong việc ứng dụng để bảo quản các sản phẩm khô, sản phẩm ăn liền

Sản phẩm thủy sản rất nhạy cảm với sự biến đổi giảm chất lượng do sự oxy hóa lipid của các acid béo chưa bão hòa, các acid chưa bão hòa là do sự có mặt với nồng độ cao của thành phần Hematin và các ion kim loại trong cơ thịt thủy sản Hơn nữa, chất lượng của thực phẩm thủy sản bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự tự phân giải, sự lây nhiễm và phát triển của

vi sinh vật và sự mất dần chức của protein Trong suốt quá trình bảo quản đông sự oxy hóa vẫn xảy ra làm thay đổi màu sắc, mùi vị của cá Màng chitosan rất quan trọng nhằm hạn chế

sự vận chuyển oxy từ môi trường bảo quản đến thực phẩm

Kamil và cộng sự (2002) đã nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của chitosan ở các nồng độ khác nhau đến thịt cá trích (Clupea harengus) được bảo quản ở 40C trong 8 ngày Tác dụng này được so sánh với các mẫu đối chứng sử dụng chất chống oxy hóa BHA, BHT

Các nghiên cứu tương tự của tác giả Kim và Thomas (2007) với việc sử dụng chitosan với nồng độ (0,2%, 0,5% và 1%) và trọng lượng phân tử (30, 90 và 120kDa) đến việc bảo quản cá hồi Jeon và công sự (2002) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của 3 độ nhớt khác nhau của chitosan: 360, 57 và 14cp tương ứng với trọng lượng phân tử 1800, 960 và 660kDa đến sự kéo dài thời gian bảo quản cá tươi fille đó là: cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) và cá trích (Clupea harengus) trên 12 ngày bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C Tác dụng của chitosan được so sánh với mãu đối chứng (không có màng bao).[5]

Khả năng chống oxy hóa của chitosan, các tác giả trên điều cho rằng sản phẩm được bào màng chitosan có tác dụng giảm đáng kể đến sự oxy hóa lipid, sự phân hủy (nitơ bay hơi, Trimethylamin, hypoxanthin) và sự phát triển vi sinh vật trên cá Mẫu sử dụng chitosan

có hiệu quả chống oxy hóa và giữ được chất lượng cá tốt hơn so với mẫu đối chứng Khả năng chống oxy hóa của chitosan đến cơ thịt cá phụ thuộc vào trọng lượng phân tử và nồng

độ chitosan Ở nồng độ cao trọng lượng phân tử thấp, chitossan có tác dụng chống oxy hóa cao hơn và ngược lại

Về cơ chế chống oxy hóa của chitosan theo Trần Thị Luyến thì do các nhóm amino của phân tử chitosan có thể kiềm hãm, hạn chế sự hoạt động oxy hóa của nhóm kim loại Jeon và cộng sự (2002) cho rằng, chitosan đóng vao trò như một tấm chắn chống lại sự xâm nhập oxy và vi sinh vật từ bên ngoài môi trường, vì vậy giúp cho quá trình bảo quản các sản phẩm được lâu hơn

Trang 26

Ngoài ra, chitosan là màng bao không độc có ảnh hưởng tốt đến chất lượng của cá hồi hồng phile lột da trong suốt 3 tháng bảo quản đông Màng chitosan đã giảm được sự thoát ẩm của cá hồi hồng file đến 50% , màu sắc cá vẫn được giữ nguyên, kìm hãm sự oxy hóa lipid, kết quả này được so sánh với mẫu không sử dụng màng bao Tác giả cũng đã nhận xét, chitosan được sử dụng tạo thành lớp màng trên bề mặt miếng cá hồi hồng file, nó đóng vai trò như một tấm ngăn sự tiếp xúc của cá với môi trường, chính vì vậy sẽ giảm sự khuếch tán oxy vào bề mặt và bên trong miếng file Một nghiên cứu tương tự của L’opez-Caballero và cộng sự (2005) cũng cho rằng khi sử dụng màng bao chitosan đối với sản phẩm chả cá tuyết cũng kìm hãm sự hư hỏng của sản phẩm Ngoài ra, khi thêm bột chitosan vào chả cá tạo phức hợp chitosan-gelatin làm tăng độ dẻo dai, độ mịn và hạn chế quá trình

hư hỏng của sản phẩm

Ngoài ra, các nghiên cứu tương tự của các tác giả về ứng dụng chitosan trong bảo quản một số loại trái cây như: cà chua, táo, chuối, đào Các tác giả đều có nhận xét là màng chitosan có tác dụng giảm tốc độ hô hấp và sản phẩm ethylene, hạn chế được sự hư hỏng của rau quả, có khả năng kháng khuẩn cao đặc biệt với nấm mốc, vì vậy giữ trái cây được lâu, không những thế màng chitosan còn duy trì được độ bền rất lâu trên bề mặt sản phẩm

1.4.6.2 Tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của chitosan ở Việt Nam

Năm 2005, tác giả Lê Văn Khẩn trường Đại học Nha Trang đã nghiên cứu hiện tượng hao hụt khối lượng và chất lượng của mực trong cấp đông, bảo quản đông và các giải pháp hạn chế Trong đó tác giả đã nghiên cứu và đưa ra được khi nhúng mực trong dung dịch chitosan 1,8% trong 1 giờ, sau đó đem cấp đông và mạ băng dung dịch chitosan cho kết quả, chitosan có tác dụng giảm hao hụt trọng lượng của mực đáng kể, được so sánh với mẫu đối chứng (không sử dụng chitosan), không những thế còn cải thiện được chất lượng và giảm số lượng vi sinh vật có trên bề mặt mực

Năm 2006, Trần Thị Luyến và các cộng sự đã nghiên cứu đề tài cấp bộ “nghiên cứu các hợp chất sinh học biển trong công nghệ sau thu hoạch nông thủy sản và thay thế các hợp chất độc hại trong chế biến thực phẩm” Kết quả cho thấy đã sử dụng chitosan, COS (chitosan oligosaccharide) để bảo quản cà chua, cam, quýt, hành tím, cá ồ, cá ngân, thịt bò, thịt heo, xúc xích gà surimi; khả năng tiêu diệt vi sinh vật tổng số như sau: đối với chitosan tiêu diệt được 80-90%; đối với COS tiêu diệt được 85-99%, do đó làm tăng thời gian bảo quản sản phẩm cụ thể:

+ Khi nhúng vào dung dịch chitosan 1,5% hong khô bảo quản được 17-56 ngày đối với hành tím ở nhiệt độ thường, 28-36 ngày đối với cam tươi ở nhiệt độ 8-10 0C vẫn đạt độ tươi theo tiêu chuẩn chế biến

+ Đối với dứa chín: khi nhúng dứa vào dung dịch chitosan 1,5% có phụ liệu benzoatenatri 0,1%, hong khô sẽ bảo quản được 15 ngày ở nhiệt độ thường và 35 ngày ở nhiệt độ 8-10oC vẫn đạt được độ tươi theo tiêu chuẩn chế biến Trường hợp xử lý bằng COS 1% với phụ liệu benzoatnatri 0,1% thì bảo quản được 15 ngày ở nhiệt độ thường và 35 ngày

ở nhiệt độ 8-10 0C Nguyễn Thị Hằng Phương đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan đến khả năng bảo quản na, tác giả cho rằng với chitosan có độ deacetyl 75%, nhúng na vào dung dịch chitosan 1% kết hợp bao gói bằng màng film PE có độ dày 0,04mm, bảo quản ở 10 0C có thể làm chậm quá trình chín, giảm cường độ hô hấp và có thể kéo dài thời gian bảo quản đến 12 ngày

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

Trang 27

Có nhiều phương pháp khác nhau dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa nhưng có năm phương pháp sau đang được dùng phổ biến

1.5.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH

Đây là phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự

do Phương pháp này được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định Do đó phương pháp này được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa Khả năng khử gốc tự do DPPH của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Fu và cộng sự (2002) [12]

Nguyên tắc:

DPPH là một gốc tự do, có màu tím nhờ vào điện tử của Nitơ chưa ghép đôi Sự làm giảm màu tím đặc trưng của DPPH là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi

và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa BHT, nó sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH-H) do trung hòa gốc DPPH bằng cách cho

đi nguyên tử hydro, dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt Nghĩa là các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một nguyên tử hydro của chất chống chống oxy hóa để tạo thành DPPH dạng nguyên tử

Hoạt tính quét gốc tự do của chất chống oxy hóa tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH

Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa

Trang 28

1.5.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử tham gia vào phản ứng oxy hóa khử Khi xác định năng lực khử ta cũng có thể xác định khả năng kháng oxy hóa của một chất

Nguyên tắc:

Tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Oyaizu 1985 [13] Trong đó, chất khử (chất có hoạt tính oxi hóa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6 ]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]) Ion Fe3+ trong phân

tử potassium ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid

X + K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6]

Hay X + [Fe(CN)6]3+ [Fe(CN)6]4+

Khi bổ sung Fe3+ , Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức hợp ferric ferrocyanid màu xanh dương có công thức Fe4[Fe(CN)6]3 Phức hợp này có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 700 nm

4Fe3+ + 3[Fe(CN)6]4+ K4[Fe(CN)6] (Màu xanh)

Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành Do đó cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu thử càng cao

hydroxyl tự do

Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do được xác định theo phương pháp của Li và cộng sự (2007)

Nguyên tắc:

Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do được xác định trên nguyên tắc của phản

ứng Fenton Phản ứng Fenton là phản ứng hydroperoxid (H2 O2 ) với ion Fe2+ H2 O2 sẽ gây oxi hóa Fe2+ để tạo thành Fe3+ , một ion hydroxyl (OH- ) và một gốc hydroxyl tự do (OH* )

Fe2+ + H2 O2 Fe3+ + OH- + OH

Các chất có khả năng quét gốc hydroxyl tự do sẽ phân hủy các gốc hydroxyl mới sinh ra từ phản ứng Fenton Hàm lượng gốc hydroxyl còn lại sẽ làm giảm cường độ màu của thuốc thử Safranin-O Cường độ màu của thuốc thử Safranin-O càng cao thể hiện khả năng quét gốc hydroxyl tự do của mẫu càng cao

1.5.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử

H2O2 xuất hiện trong tự nhiên với hàm lượng thấp, có trong không khí, nước, cơ thể con người, thực vật, vi sinh vật, thực phẩm và nước uống Nó được sử dụng rộng rãi như một chất tẩy trắng trong ngành công nghiệp dêt, sản xuất giấy Con người tiếp xúc với H2O2

Trang 29

thông qua môi trường được ước tính là 0.28 mg/kg/ngày Hydroperoxide thâm nhập vào cơ thể con người thông qua con đường hô hấp, mắt và da Trong cơ thể, hydroperoxide bị phân hủy tạo ra oxy và nước và điều này có thể tạo ra gốc tự do hydroxyl Mà gốc này có làm kích hoạt oxy hóa lipid, làm phá hoại cấu trúc ADN Vì vậy, bản thân H2O2 không độc nhưng có thể gây độc tế bào bởi tạo ra các gốc hydroxyl trong tế bào Như vậy, loại bỏ H2O2

là rất quan trọng trong suốt hệ thống thực phẩm

1.5.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2.

Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Bao và cộng sự, 2010 [9]

Hình 1.6 Phương trình phản ứng giữa MDA và thiobarbituric

Trang 30

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

 Độ deacetyl : 83%

 Trạng thái : dạng bột

 Màu sắc : trắng

 Độ ẩm : 11%

 Khối lượng phân tử: 301kDa

2.1.1.2 Chitosan olygosacharied (COS1)

Chitosan olygosacharied (COS1) sử dụng trong nghiên cứu này do Ths Vũ Lệ Quyên – Bộ môn công nghệ Chế biến Thủy sản, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang cung cấp có các chỉ tiêu chất lượng như sau:

 Màu sắc : trắng đục

 Độ ẩm : 10%

COS2 sử dụng trong nghiên cứu này do Ths Vũ Lệ Quyên – Bộ môn công nghệ Chế biến Thủy sản, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang cung cấp có các chỉ tiêu chất lượng như sau:

 Màu sắc : trắng ngà

 Độ ẩm : 10%

COS3 sử dụng trong nghiên cứu này do Ths Vũ Lệ Quyên – Bộ môn công nghệ Chế biến Thủy sản, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang cung cấp có các chỉ tiêu chất lượng như sau:

Trang 31

TBARS được mua từ công ty Wako Pure chemical Industries, Ltđ

Na2HPO4, NaH2PO4, K3Fe(CN)6, CCl3COOH, FeCl3, H2O2 , KCl, H3PO4 được mua

từ công ty Guanghua Chemical Factory Co.Ltđ

Dung môi : axit acetic 99.5% xuất xứ từ trung quốc

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS

Trong hệ lipid/FeCl2/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do OH*tạo thành từ phản ứng giữa Fe2+ và H2O2 Cơ chế phản ứng xảy ra như sau:

Fe2+ + H2O2  Fe3+ + OH- + OH*

RH + OH*  R* + H2O

R* + O2 → ROO*ROO* + RH → ROOH + R*

R* + R* → R-R

R* + ROO* → ROOR ROO* + ROO* → ROOR + O2

Lipid hydroperoxide tạo thành bị phân hủy tạo thành malondialde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm Cơ chế phản ứng xảy ra như sau:

Lipid hydroperoxide MDA

Trang 32

+

MDA TBA Phức (màu đỏ son)

Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ giảm đi Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để phân tích hoạt tính của chất chống oxy hóa

Theo nghiên cứu của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013) đã đề xuất phương pháp như ở sơ đồ hình 2.1 [2]

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl 2 /H 2 O 2.

Để đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton cho việc phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS, thí nghiệm này đã tiến hành phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS bằng mô hình phản ứng Fenton và so sánh với 3 phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa thường được áp dụng là: Khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử H2O2 Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.2

Trang 33

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng áp dụng môi hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS

Khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton cho việc phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS được đánh giá dựa vào mối tương quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid được xác định từ mô hình phản ứng Fenton với khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử H2O2 của chitosan và COS ở các nồng độ như nhau

Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

Khả năng khử gốc tự

do DPPH

Tổng năng lực khử

Khả năng khử

H2O2

Phân tích tương quan giữa kết quả đánh giá bằng mô

hình phản ứng Fenton với các phương pháp khác

Kết luận khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton

để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

Trang 34

Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH+ bằng cách cho hydrogen, làm giảm cường độ hấp phụ của dung dịch DPPH tại bước sóng hấp thụ cực đại 517nm, màu dung dịch sẽ chuyển dần từ màu tía sang màu vàng nhạt

Chuẩn bị mẫu: mẫu chitosan và COS được hòa tan trong dung dich axit acetic 0.5%

ta được dung dịch A từ dung dịch A ta sẽ pha thành các nồng độ mong muốn

Lắc đều dung dịch và ủ trong bóng tối 30 phút

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517nm

0.5ml dd mẫu 1ml DPPH 0.1mM 1ml ethanol

1.5ml nước cất Chitosan và COS

Trang 35

Cho vào 5 ống nghiệm 20ml mỗi ống 0.5ml dung dịch chitosan và COS với các nồng

độ (0.1%; 0.12%; 0.14%; 0.16%; 0.2%) Sau đó, cho 1ml dung dịch DPPH 0,1mM pha trong ethanol, 1ml ethanol và cho thêm 1,5ml nước cất Lắc đều rồi để phản ứng xảy ra trong bóng tối 30 phút, lắc đều trở lại rồi đưa đi đo ở bước sóng 517nm trên máy đo UV-Vis

Mỗi thí nghiệm sẽ tiến hành lặp lại 3 lần

Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành song song bằng cách cho 1ml dung dịch DPPH 0,1mM, 1ml ethanol, 1,5ml nước cất và 0,5ml dung dich axit acetic 0.5% Lắc đều,

để phản ứng xảy ra ở cùng điều kiện với mẫu thí nghiệm rồi cũng đem dung dịch đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 517nm

Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan và COS vào đường chuẩn:

y = 2.4448x - 0.0058

R 2 = 0.9988

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

Các chất có khả năng chống oxy hóa có thể khử Fe3+ trong phân tử K3[Fe(CN)6 thành

Fe2+ có khả năng tạo phức màu xanh dương với FeCl3 Phức chất tạo thành có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 700nm

Trang 36

Hình 2.6 Phản ứng tạo phức màu xanh dương

b Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Lắc đều, ủ ở 50 0C trong 20 phút

0,5ml CCl3COOH 0,1%

2ml nước cất 0,4ml FeCl3 0,1%

Lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích tổng năng lực khử của dung dịch

chitosan và COS.

Trang 37

b Cách tiến hành:

Chuẩn bi mẫu: mẫu chitosan và COS được hòa tan trong dung dich axit acetic 0.5%

ta được dung dịch A, từ dung dịch A ta sẽ pha thành các nồng đô mong muốn

Cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống 0.5ml dung dịch chitosan và COS với các nồng độ (0.2%; 0.16%; 0.14%; 0.12%; 0.1%) Sau đó, cho vào mỗi ống 0,5ml K3[Fe(CN)6] 1% (w/v)

và thêm 0,5ml dung dịch đệm phosphate ( pH=6,6; CM= 0,2M) Lắc đều rồi đem đi ủ ở 50oC trong 20 phút Lấy ra, cho 0,5ml tricloacetic (CCl3COOH) 0,1% (v/v) và 2ml nước cất Cuối cùng cho 0,4ml FeCl3 0,1% (w/v) rồi lắc đều và đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm trên máy đo UV-Vis

Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành song song bằng cách thay số ml mẫu thêm vào ống nghiệm bằng số ml axit acetic 0.5% và để phản ứng xảy ra cùng điều kiện với mẫu thí nghiệm và cũng đem dung dịch đi đo độ hấp thụ tại bước sóng 700nm trên máy đo màu UV-Vis

Xác định tổng năng lực khử của dịch chiết tim sen dựa vào độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700nm Hỗn hợp phản ứng có độ hấp thụ càng cao thì tổng năng lực khử càng lớn

2.2.2.3 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS dựa vào khả năng khử hydroperoxide

Khả năng khử hydroperoxide của chitosan và COS được phân tích theo phương pháp của Nabavi và cộng sự 2008 [8] [14]

a Nguyên tắc:

Bản thân H2O2 là chất oxy hóa mạnh nên dễ hình thành gốc tự do hydroxyl gây kích hoạt cho quá trình oxy hóa lipid thông qua phản ứng Fenton Vì vậy, có thể đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một chất thông qua khả năng khử H2O2.

Trang 38

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích khả năng khử H2O2 của dung dịch chitosan

Ở mỗi thí nghiệm( ứng với từng nồng độ dung dịch mẫu) ta tiến hành chuẩn bị mẫu Autozero bằng cách cho 0.5ml dung dịch mẫu (ứng với từng nồng độ như trên) và 3,5ml đệm phosphate (pH=7,4; CM=50mM), (tiến hành trong điều kiện tương tự như các mẫu làm thí nghiệm )

Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành song song bằng cách: cho vào ống nghiệm 2,5ml H2O2 40mM và 1ml đệm phosphate( pH=7,4, CM=50mM) và 0,5ml dung dịch axit acetic 0.5% Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút rồi đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 230nm trên máy UV-Vis

2,5ml H2O2 40mM 1ml dung dịch đệm phosphate pH=7,4

Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút

Lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 230nm

Hỗn hợp phản ứng 0.5ml mẫu

Trang 39

Kết quả được tính dựa vào công thức sau:

% (H2O2) bị khử =[(A0 - A1)/Ao]x100

Trong đó: A0: Giá trị hấp thụ của mẫu đối chứng ở bước sóng 230nm

A1: Giá trị hấp thụ của mẫu chitosan hoặc COS ở bước sóng 230nm

2.2.2.4 Phương pháp phân tích khả năng chống oxy hóa của chitosan và COS dựa vào

mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl 2 /H 2 O 2

Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 được tiến hành theo phương pháp của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013) [2]

a Nguyên tắc:

Trong hệ lipid/FeCl2/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do (OH*)tạo thành từ phản ứng giữa FeCl2 và H2O2 Sản phẩm oxy hóa lipid tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành phức màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ son giảm đi Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ son để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa

Phản ứng Fenton:

Fe2+ + H2O2  Fe3+ + OH- + OH*

Trang 40

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong

độ 0.2%; 0.16%; 0.14%; 0.12%; 0.1% Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ

37oC trong 30 phút Sau đó, cho thêm vào mỗi ống nghiệm 0,3ml KCl 1,15% (w/v), 4,5ml

H3PO4 1% (v/v), 1ml thiobarbituric (TBA) 0,6% Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ

ở nhiệt độ 95oC trong 45 phút Sau đó, làm nguội đến nhiệt độ phòng và đem đi đo độ hấp thụ ở bước sóng 535nm trên quang phổ kế UV-VIS

Cho vào mỗi ống nghiệm: 0,3ml KCl31,15%; 4,5ml H3PO41%; 1ml TBARS 0,6%

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	2,04 MB

Đánh giá khả năng áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và chitosan phân tử lượng thấp

Các phƣơng pháp phân tích

PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU