Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa đƣợc phân tích dựa vào phƣơng pháp của Bao và cộng sự, 2010. [9].
Nguyên tắc:
Hệ tác nhân Fenton là một hỗn hợp gồm các ion sắt hóa trị 2 (thông thƣờng dùng muối FeCl2) và hydroperoxit (H2O2), chúng tác dụng với nhau sinh ra gốc tự do OH * , còn Fe2+ bị oxy hóa thành Fe3+ theo phản ứng:
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH * (k=63l.mol-1s-1)
Gốc tự do OH * khơi mào cho phản ứng oxy hóa lipid tạo ra các Malondialdehyde (MDA). Các MDA sinh ra khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 535nm. Đo cƣờng độ màu của phức suy ra lƣợng MDA có trong mẫu. Phƣơng trình phản ứng nhƣ sau:
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Chitosan (C)
Chitosan sử dụng trong nghiên cứu này do Ths Vũ Lệ Quyên – Bộ môn công nghệ Chế biến Thủy sản, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Nha Trang cung cấp có các chỉ tiêu chất lƣợng nhƣ sau:
Độ deacetyl : 83%
Trạng thái : dạng bột
Màu sắc : trắng
Độ ẩm : 11%
Khối lƣợng phân tử: 301kDa
2.1.1.2. Chitosan olygosacharied (COS1)
Chitosan olygosacharied (COS1) sử dụng trong nghiên cứu này do Ths Vũ Lệ Quyên – Bộ môn công nghệ Chế biến Thủy sản, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Nha Trang cung cấp có các chỉ tiêu chất lƣợng nhƣ sau:
Độ deacetyl : 83%
Trạng thái : dạng bột
Màu sắc : trắng đục
Độ ẩm : 10%
Khối lƣợng phân tử: 291kDa
2.1.1.3. Chitosan olygosacharied (COS2)
COS2 sử dụng trong nghiên cứu này do Ths Vũ Lệ Quyên – Bộ môn công nghệ Chế biến Thủy sản, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Nha Trang cung cấp có các chỉ tiêu chất lƣợng nhƣ sau:
Độ deacetyl : 83%
Trạng thái : dạng bột
Màu sắc : trắng ngà
Độ ẩm : 10%
Khối lƣợng phân tử: 38kDa
2.1.1.4. Chitosan olygosacharied (COS3)
COS3 sử dụng trong nghiên cứu này do Ths Vũ Lệ Quyên – Bộ môn công nghệ Chế biến Thủy sản, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Nha Trang cung cấp có các chỉ tiêu chất lƣợng nhƣ sau:
Độ deacetyl : 83% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Màu sắc : vàng
Độ ẩm : 10%
Khối lƣợng phân tử: 27kDa.
2.1.1.5. Hóa chất
Methanol, ethanol sử dụng trong đề tài có độ tinh khiết cao, đạt yêu cầu trong phân tích thí nghiệm.
DPPH đƣợc mua từ công ty Sigma-Aldrich INC, PO.Box 14508, st.Louis, MO 63178 USA+1-314-771-5750.
Tween 20 đƣợc mua từ công ty Loba chemie Pvt.Ltd 107, Wondehouse Road, Mumbai 400005, India.
TBARS đƣợc mua từ công ty Wako Pure chemical Industries, Ltđ.
Na2HPO4, NaH2PO4, K3Fe(CN)6, CCl3COOH, FeCl3, H2O2 , KCl, H3PO4 đƣợc mua từ công ty Guanghua Chemical Factory Co.Ltđ.
Dung môi : axit acetic 99.5% xuất xứ từ trung quốc.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS lipid/FeCl2/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS
Trong hệ lipid/FeCl2/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do OH* tạo thành từ phản ứng giữa Fe2+ và H2O2. Cơ chế phản ứng xảy ra nhƣ sau:
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH* RH + OH* R* + H2O R* + O2 → ROO* ROO* + RH → ROOH + R* R* + R* → R-R R* + ROO* → ROOR
ROO* + ROO* → ROOR + O2
Lipid hydroperoxide tạo thành bị phân hủy tạo thành malondialde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 535nm. Cơ chế phản ứng xảy ra nhƣ sau:
+
MDA TBA Phức (màu đỏ son)
Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cƣờng độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ màu đỏ để phân tích hoạt tính của chất chống oxy hóa.
Theo nghiên cứu của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013) đã đề xuất phƣơng pháp nhƣ ở sơ đồ hình 2.1 [2]
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa phƣơng pháp đánh giá hoạt tính chống oxy bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2.
Để đánh giá khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton cho việc phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS, thí nghiệm này đã tiến hành phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS bằng mô hình phản ứng Fenton và so sánh với 3 phƣơng pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa thƣờng đƣợc áp dụng là: Khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử H2O2. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sơ đồ hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng áp dụng môi hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS.
Khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton cho việc phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS đƣợc đánh giá dựa vào mối tƣơng quan giữa khả năng chống oxy hóa lipid đƣợc xác định từ mô hình phản ứng Fenton với khả năng khử gốc tự do DPPH, tổng năng lực khử và khả năng khử H2O2 của chitosan và COS ở các nồng độ nhƣ nhau.
2.2.2. Các phƣơng pháp phân tích
2.2.2.1. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của chiosan và COS đƣợc phân tích dựa vào phƣơng pháp của Fu và cộng sự (2002) [12].
a. Nguyên tắc:
Chitosan và COS
Khả năng chống oxy hóa lipit trong mô hình phản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ứng Fenton 0.1% 0.12% 0.14% 0.16% 0.2% Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Khả năng khử gốc tự do DPPH Tổng năng lực khử Khả năng khử H2O2
Phân tích tƣơng quan giữa kết quả đánh giá bằng mô hình phản ứng Fenton với các phƣơng pháp khác
Kết luận khả năng áp dụng mô hình phản ứng Fenton để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH+ bằng cách cho hydrogen, làm giảm cƣờng độ hấp phụ của dung dịch DPPH tại bƣớc sóng hấp thụ cực đại 517nm, màu dung dịch sẽ chuyển dần từ màu tía sang màu vàng nhạt.
Hình 2.3. Phản ứng bắt gốc tự do DPPH.
b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH của dung dịch chitosan và COS
c. Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: mẫu chitosan và COS đƣợc hòa tan trong dung dich axit acetic 0.5% ta đƣợc dung dịch A. từ dung dịch A ta sẽ pha thành các nồng độ mong muốn.
Lắc đều dung dịch và ủ trong bóng tối 30 phút Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 517nm 0.5ml dd mẫu 1ml DPPH 0.1mM 1ml ethanol 1.5ml nƣớc cất Chitosan và COS 0.1% 0.12% 0.14% 0.16% 0.2%
Cho vào 5 ống nghiệm 20ml mỗi ống 0.5ml dung dịch chitosan và COS với các nồng độ (0.1%; 0.12%; 0.14%; 0.16%; 0.2%). Sau đó, cho 1ml dung dịch DPPH 0,1mM pha trong ethanol, 1ml ethanol và cho thêm 1,5ml nƣớc cất. Lắc đều rồi để phản ứng xảy ra trong bóng tối 30 phút, lắc đều trở lại rồi đƣa đi đo ở bƣớc sóng 517nm trên máy đo UV- Vis.
Mỗi thí nghiệm sẽ tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) đƣợc tiến hành song song bằng cách cho 1ml dung dịch DPPH 0,1mM, 1ml ethanol, 1,5ml nƣớc cất và 0,5ml dung dich axit acetic 0.5%. Lắc đều, để phản ứng xảy ra ở cùng điều kiện với mẫu thí nghiệm rồi cũng đem dung dịch đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 517nm.
Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan và COS vào đƣờng chuẩn:
y = 2.4448x - 0.0058 R2 = 0.9988 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 Nồng độ DPPH (mM ) Độ h ấp th ụ ở bư ớc s ón g 51 7 nm Hình 2.5. Đƣờng chuẩn DPPH
2.2.2.2. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS dựa tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử của dung dịch chitosan và COS đƣợc phân tích dựa vào phƣơng pháp của Oyaizu 1985 [13].
a. Nguyên tắc:
Các chất có khả năng chống oxy hóa có thể khử Fe3+ trong phân tử K3[Fe(CN)6 thành Fe2+ có khả năng tạo phức màu xanh dƣơng với FeCl3. Phức chất tạo thành có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 700nm.
Hình 2.6. Phản ứng tạo phức màu xanh dƣơng b. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Lắc đều, ủ ở 50 0C trong 20 phút 0,5ml CCl3COOH 0,1% 2ml nƣớc cất 0,4ml FeCl3 0,1%
Lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 700nm 0.5ml mẫu Hỗn hợp phản ứng Chitosan và COS 0.1% 0.12% 0.14% 0.16% 0.2% 0,5ml K3 Fe(CN)6 10% 0,5ml đệm phosphate pH=6,6
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích tổng năng lực khử của dung dịch chitosan và COS.
b. Cách tiến hành:
Chuẩn bi mẫu: mẫu chitosan và COS đƣợc hòa tan trong dung dich axit acetic 0.5% ta đƣợc dung dịch A, từ dung dịch A ta sẽ pha thành các nồng đô mong muốn.
Cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống 0.5ml dung dịch chitosan và COS với các nồng độ (0.2%; 0.16%; 0.14%; 0.12%; 0.1%). Sau đó, cho vào mỗi ống 0,5ml K3[Fe(CN)6] 1% (w/v) và thêm 0,5ml dung dịch đệm phosphate ( pH=6,6; CM= 0,2M). Lắc đều rồi đem đi ủ ở 50oC trong 20 phút. Lấy ra, cho 0,5ml tricloacetic (CCl3COOH) 0,1% (v/v) và 2ml nƣớc cất. Cuối cùng cho 0,4ml FeCl3 0,1% (w/v) rồi lắc đều và đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 700nm trên máy đo UV-Vis.
Mỗi thí nghiệm sẽ tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) đƣợc tiến hành song song bằng cách thay số ml mẫu thêm vào ống nghiệm bằng số ml axit acetic 0.5% và để phản ứng xảy ra cùng điều kiện với mẫu thí nghiệm và cũng đem dung dịch đi đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng 700nm trên máy đo màu UV-Vis.
Xác định tổng năng lực khử của dịch chiết tim sen dựa vào độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bƣớc sóng 700nm. Hỗn hợp phản ứng có độ hấp thụ càng cao thì tổng năng lực khử càng lớn.
2.2.2.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS dựa vào khả năng khử hydroperoxide (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khả năng khử hydroperoxide của chitosan và COS đƣợc phân tích theo phƣơng pháp của Nabavi và cộng sự 2008 [8] [14].
a. Nguyên tắc:
Bản thân H2O2 là chất oxy hóa mạnh nên dễ hình thành gốc tự do hydroxyl gây kích hoạt cho quá trình oxy hóa lipid thông qua phản ứng Fenton. Vì vậy, có thể đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một chất thông qua khả năng khử H2O2.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân tích khả năng khử H2O2 của dung dịch chitosan và COS
c. Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu: mẫu chitosan hoặc COS đƣợc hòa tan trong dung dich axit acetic 0.5% ta đƣợc dung dịch A. từ dung dịch A ta sẽ pha thành các nồng đô mong muốn.
Cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống 0.5ml dung dịch chitosan hoặc COS với các nồng độ (0.2%; 0.16%; 0.14%; 0.12%; 0.1%). Sau đó, cho vào mỗi ống nghiệm 2,5ml H2O2 40mM và 1ml dung dịch đệm phosphate ( pH=7,4; CM=50mM). Lắc đều rồi để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó, đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 230nm trên máy UV-Vis.
Mỗi thí nghiệm sẽ tiến hành lặp lại 3 lần.
Ở mỗi thí nghiệm( ứng với từng nồng độ dung dịch mẫu) ta tiến hành chuẩn bị mẫu Autozero bằng cách cho 0.5ml dung dịch mẫu (ứng với từng nồng độ nhƣ trên) và 3,5ml đệm phosphate (pH=7,4; CM=50mM), (tiến hành trong điều kiện tƣơng tự nhƣ các mẫu làm thí nghiệm ).
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) đƣợc tiến hành song song bằng cách: cho vào ống nghiệm 2,5ml H2O2 40mM và 1ml đệm phosphate( pH=7,4, CM=50mM) và 0,5ml dung dịch axit acetic 0.5%. Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút rồi đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 230nm trên máy UV-Vis.
2,5ml H2O2 40mM 1ml dung dịch đệm phosphate pH=7,4
Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút
Lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 230nm Hỗn hợp phản ứng 0.5ml mẫu Chitosan và COS 0.1 % 0.12 % 0.14% 0.16% 0.2%
Kết quả đƣợc tính dựa vào công thức sau: % (H2O2) bị khử =[(A0 - A1)/Ao]x100
Trong đó: A0: Giá trị hấp thụ của mẫu đối chứng ở bƣớc sóng 230nm. A1: Giá trị hấp thụ của mẫu chitosan hoặc COS ở bƣớc sóng 230nm.
2.2.2.4. Phương pháp phân tích khả năng chống oxy hóa của chitosan và COS dựa vào mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2.
Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và COS bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ lipid/FeCl2/H2O2 đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2013) [2].
a. Nguyên tắc:
Trong hệ lipid/FeCl2/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do (OH*)tạo thành từ phản ứng giữa FeCl2 và H2O2. Sản phẩm oxy hóa lipid tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành phức màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 535nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cƣờng độ màu đỏ son giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ màu đỏ son để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa.
Phản ứng Fenton:
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH*
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2.
b. Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: mẫu chitosan hoặc COS đƣợc hòa tan trong dung dich axit acetic 0.5% ta đƣợc dung dịch A. từ dung dịch A ta sẽ pha thành các nồng đô mong muốn.
Cho vào 5 ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 40µl FeCl2 và 40µl H2O2 100µM. Lắc đều để phản ứng xảy ra trong 3 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm 80µl EPA 50µM pha trong Tween 20, 40µl dung dịch chitosan hoặc COS đã pha thành các nồng độ 0.2%; 0.16%; 0.14%; 0.12%; 0.1%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút. Sau đó, cho thêm vào mỗi ống nghiệm 0,3ml KCl 1,15% (w/v), 4,5ml H3PO4 1% (v/v), 1ml thiobarbituric (TBA) 0,6%. Đậy nắp ống nghiệm, lắc đều rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 95oC trong 45 phút. Sau đó, làm nguội đến nhiệt độ phòng và đem đi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 535nm trên quang phổ kế UV-VIS.
Lắc đều, ủ ở 95oC trong 45 phút
Làm nguội ở nhiệt độ phòng, rồi đem đi đo độ hấp thụ ở λ=535nm
40µl FeCl2100µM 40µlH2O2100µM
Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút
80µl Tween 20 có chứa 50µM EPA và 40 µl dung dịch mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lắc đều, ủ ở 37oC trong 30 phút
Cho vào mỗi ống nghiệm: 0,3ml KCl31,15%; 4,5ml H3PO41%; 1ml TBARS 0,6%
Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) đƣợc tiến hành song song bằng cách thay 40µl dung dịch mẫu bằng 40µl dung dịch axit acetic 0.5%.
Tính kết quả:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(A0 – A)/A0]*100 Trong đó:
Ao: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng ở bƣớc sóng 535nm
A: Độ hấp thụ của mẫu có chứa chất chống oxy hóa ở bƣớc sóng 535nm.
2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu trình bày trong báo cáo này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Tính giá trị trung bình, vẽ đồ thị và so sánh sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05) của các giá trị trung bình sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2007.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KHẢ NĂNG KHỬ GỐC TỰ DO DPPH CỦA CHITOSAN VÀ CÁC COS 3.1.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan
Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan đƣợc trình bày trên hình 3.1.
Hình 3.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan ở các nồng độ khác nhau.
Từ kết quả trên hình 3.1 ta thấy chitosan có hoạt tính chống oxy hóa vì có khả năng khử gốc tự do DPPH và hoạt tính chống oxy hóa của chitosan phụ thuộc vào nồng độ của nó