Nghiên cứu quy trình sản xuất Oligochitin từ chitin sản xuất từ vỏ tôm thẻ bằng enzyme Hemicellulase

Vì thế để nâng cao giá trị sử dụng của chitin lên, người ta nghiên cứu theo hướng sản xuất các chế phẩm từ chitin như: oligochitin, glucosamine,… hòa tan nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng và

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-  -

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT

OLIGOCHITIN TỪ CHITIN SẢN XUẤT TỪ

VỎ TÔM THẺ BẰNG ENZYME HEMICELLULASE

Trước hết tôi xin gửi tới ban Giám hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Phòng Đào Tạo sự kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc, sự tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong 4 năm qua

Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy giáo hướng dẫn đồ án: Thạc sỹ Trần Văn Vương – giảng viên bộ môn Đảm bảo chất lượng – An toàn thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, các thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã chỉ dẫn, dạy bảo tôi trong suốt thời gian học tập và quá trình làm đồ án tại trường Và tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân đã quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đồ án

Do bước đầu tiến hành nghiên cứu nên không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong quý thầy cô và bạn bè đóng góp ý kiến để luận văn được hoàn chỉnh hơn Sinh viên

Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU iii

DANH MỤC CÁC HÌNH-ĐỒ THỊ-SƠ ĐỒ iii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN 3

1.1.1 Tổng quan về chitin 3

1.1.2 Tổng quan về oligochitin 8

1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin, oligochitin 10

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước: 12

1.3 Ứng dụng của chitin và oligochitin 14

1.3.1 Ứng dụng của chitin 14

1.3.2 Ứng dụng của oligochitin 16

1.4 Tổng quan về enzyme 16

1.4.1 Giới thiệu chung về enzyme 16

1.4.2 Một số nghiên cứu và ứng dụng của enzyme Hemicellulase 22

1.4.3 Một số ứng dụng của enzyme Hemicellulase 24

CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Vật liệu chính 26

2.1.2 Vật liệu phụ 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Phương pháp phân tích 27

2.2.2 Bố trí thí nghiệm 28

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 35

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 35

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 SẢN XUẤT CHITIN TINH SẠCH VÀ CHITIN HUYỀN PHÙ 36

3.1.1 Sản xuất chitin tinh sạch 36

3.1.2 xử lý chitin huyền phù 36

3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CỦA QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITIN 36 3.2.1 Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình sản xuất oligochitin 36

3.2.2 Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình sản xuất oligochitin 37 3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi oligochitin 39

3.3 QUY TRÌNH HOÀN THIỆN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG ENZYME HEMICELLULASE 40

3.3.1 Sơ đồ quy trình 40

3.3.2 Kết quả sản xuất thử nghiệm 42

3.3.3 Sơ bộ hoạch toán giá thành sản phẩm 43

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Đề xuất ý kiến 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC I 48

PHỤ LỤC II 50

PHỤ LỤC III 58

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Tính toán sơ bộ chi phí sản xuất 43

DANH MỤC CÁC HÌNH-ĐỒ THỊ-SƠ ĐỒ Hình1.1: sắp xếp các mạch trong phân tử chitin 6

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của chitin 6

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của oligochitin 9

Hình 1.4: Cấu trúc không gian của hỗn hợp enzyme hemicellulase 24

Hình 2.1: Vật liệu chitin 26

Hình 2.2: Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ Aspergillus niger 27

Hình 2.3 Quy trình tinh sạch chitin 28

Hình 2.4: Quy trình xử lí huyền phù chitin 29

Hình 2.5: Quy trình dự kiến sản xuất oligochitin 30

Hình 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân 32

Hình 2.7: Sơ đồ thí nghiệm xác định nhiệt độ của quá trình thủy phân 33

Hình 2.8: Sơ đồ thí nghiệm xác định thời gian thủy phân 34

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thu hồi oligochitin 36

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá trình sản xuất oligochitin 38

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thu hồi oligochitin 39

Hình 3.4: Sơ đồ quy trình sản xuất thực nghiệm oligochitin 41

Hình 3.5: Hình ảnh oligochitin 42

MỞ ĐẦU

Chitin không có khả năng hòa tan trong nước nên việc sử dụng chúng rất hạn chế Vì thế để nâng cao giá trị sử dụng của chitin lên, người ta nghiên cứu theo hướng sản xuất các chế phẩm từ chitin như: oligochitin, glucosamine,… hòa tan nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng và góp phần hạn chế hiện trạng ô nhiễm môi trường trong ngành thủy sản của nước ta hiện nay

Oligochitin tan tốt trong nước và nó có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa , điều hòa đất,… Khi sử dụng oligochitin trong bảo quản thủy sản sẽ không gây độc hại cho sản phẩm, vẫn giữ được giá trị cảm quan, chất lượng được đảm bảo Oligochitin sẽ là chất bảo quản thay thế các hóa chất bảo quản vẫn dùng trong bảo quản thủy sản hiện nay như: Hàn the, ure, nitrit,…

Thủy sản được xem là ngành kinh tế mũi nhọn của nước ta, hằng năm nó đem lại cho đất nước một nguồn lợi kinh tế lớn Năm 2012 tổng sản lượng thủy sản của

cả nước đạt 5.9 triệu tấn tăng 8.8% so với năm 2011, và kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2012 đạt 6.12 tỉ USD bằng năm 2011

Chế biến thủy sản là ngành công nghiệp thải ra môi trường một lượng phế liệu lớn lên tới 70.000 tấn/năm (năm 2011) Nếu không được xử lí thích hợp lượng phế liệu này sẽ gây ra ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Phế liệu từ thủy sản chủ yếu là

vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực,… Thành phần chính của các phế liệu chủ yếu là: protein, khoáng, chitin, sắc tố,…trong đó chitin chiếm khoảng 20%

Chitin (poly-N-acetylglucosamine) là một polymer sinh học có nhiều trong cấu trúc khớp, sụn của các động vật bậc thấp, trong thành phần tế bào của một số vi sinh vật như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn,… và trong lớp vỏ của các loài giáp xác như tôm, cua, ốc, hến,… Quá trình thu nhận, tách chiết chitin, chitosan, oligochitin

và glucosamin được ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm, y học, nông

nghiệp, điều chỉnh và kiểm soát pH, chất làm dai giấy viết, thuốc chữa xương khớp,

da nhân tạo,…

Do đó hướng nghiên cứu oligochitin từ chitin để sử dụng trong bảo quản thực phẩm đang được các nhà khoa học quan tâm Đề tài: “Nghiên cứu quy trình sản xuất oligochitin từ chitin sản xuất từ vỏ tôm thẻ bằng enzyme hemicellulase” cũng là một hướng như vậy

Nội dung đề tài:

1 Xây dựng quá trình sản xuất oligochitin từ chitin vỏ tôm thẻ bằng enzyme hemicellulase

2 Tối ưu hóa được các thông số nhiệt độ, thời gian, pH, nồng độ enzyme để hiệu suất thu hồi oligochitin là cao nhất

3 Sơ bộ đánh giá được hiệu quả oligochitin thu được

Tính khoa học của đề tài:

Đề tài đã đưa ra được quy trình sản xuất oligochitin từ chitin vỏ tôm thẻ bằng enzyme hemicellulase Đưa ra được các thông số tối ưu thích hợp cho quá trình thủy phân chitin bằng enzyme chitinase và sản phẩm thu được là oligochitin Đây là một chất có hoạt tính sinh học, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

có dạng công thức cellulose

Vào năm 1834, Children phát hiện sự có mặt của nitơ trong chitin, 9 năm sau

đó tức năm 1843 sự tồn tại của nitơ trong chitin đã được Lassaigne chứng minh một lần nữa

Đến năm 1859, C.Rouget phát hiện ra một hợp chất mới khi đun hoàn lưu chitin trong dung dịch KOH đặc, có tính chất khác với chitin, ông gọi nó là

số nguyên tử giống như trong chitin và gọi nó là chitosan

Năm 1912, Brach và Furth nhận thấy tỷ lệ acid acetic và glucosamine là 1:1, ông gọi nó là “polyme mono acetyl glucosamine”

Năm 1928, Meyer và Mark dựa trên phổ nhiễu xạ tia X kết luận rằng chitin

và chitosan nằm ở dạng liên kết β (1→4) giữa các mắt xích pyranoz

Từ những năm 1930 đến 1940 có rất nhiều nghiên cứu về chitin và chitosan, khoảng 50 phát minh đã được đăng ký Với những nghiên cứu của mình, Purchase

và Braum chứng minh được chitin là một polysaccharide của glucosamine bằng cách thủy phân chitin theo nhiều cách khác nhau, hay với nghiên cứu của Rammelberg đã xác định một cách chính xác nguồn gốc của chitin

Vào năm 1948, Matsusshima cũng đã có một phát minh sản xuất glucosamine từ vỏ cua

Năm 1950, người ta đã sử dụng tia X để phân tích nhằm nghiên cứu sâu hơn

sự hiện diện của chitin trong nấm và trong thành tế bào

Và đến năm 1951, quyển sách đầu tiên viết về chitin đã được xuất bản Bấy giờ, người ta đã phát hiện tiềm năng của các polyme thiên nhiên này

Nhưng sự cạnh tranh của các loại polyme tổng hợp nên đã kìm hãm sự phát triển thương mại của chitin và chitosan Cho đến năm 1970, hàng loạt nghiên cứu về chitin và chitosan được tiến hành với mục đích ban đầu là tận dụng nguồn phế liệu dồi dào từ việc chế biến thủy sản (vỏ tôm) nhằm tránh gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên các nhà khoa học đã phát hiện ra các tính chất đặc biệt của chitin và các dẫn xuất của nó không những giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn mở ra một triển vọng rất lớn trong việc ứng dụng chitin và các dẫn xuất của chúng vào sản xuất

Vào năm 1978, một hội nghị đầu tiên nói về chitin và chitosan diễn ra tại Mỹ

và thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới

Hiện nay, những nghiên cứu về chitin và chitosan đã đạt những thành công nhất định Tại Nhật, một chương trình nghiên cứu dài hơn 10 năm cũng bắt đầu khởi động Trung Quốc, tuy là nước bắt đầu nghiên cứu chậm hơn so với những nước khác nhưng lại đang phát triển rất nhanh trong lĩnh vực này [23]

Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong một năm/1m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin tồn tại cả ở động vật và thực vật

Đối với cơ thể động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: Côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong thế giới thực vật chitin có ở thành tế bào của một số nấm và tảo như:

nấm Zygemycether, một số tảo Chlorophiceae, nấm bất toàn (Fugiimperfecti), tảo khuẩn (Phycomycetes),… Chitin không hiện diện một mình trong lớp vỏ ngoài của

loài nấm mà nó được liên kết với những thành phần khác Lượng chitin được tinh chế từ một số loài nấm thông thường từ 3÷5 %

Trong động vật thủy sản đặc biệt trong vỏ tôm, cua, ghẹ và xương mực hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ cao, từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ, xương mực là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng Chitin là polysaccharide mạch thẳng, có thể xem như là dẫn xuất của xenlulose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên từ C2 được thay thế bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH3) Chitin là polysaccharide chứa đạm không độc hại, có khối lượng phân

tử lớn Cấu trúc của chitin là một tập hợp các phân tử liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Vì thế mà chitin làm tăng

độ bền, độ cứng và là điểm tựa cho các sinh vật (Riccarclo, 1996) Chitin rất hiếm tồn tại ở trạng thái tự do, hầu như luôn liên kết bởi các cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác trong vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ [16]

Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia

X, người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ – chitin [24] Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N- acetyl – D- glucosamine) trong mạch

Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm – NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ – chitin được mô tả như sau:

α-chitin β-chitin γ-chitin

Hình1.1: sắp xếp các mạch trong phân tử chitin

α- chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên Dạng α có nhiều trong các loại tôm, các loài nguyễn thể, thức

ăn của cá voi, trong dây chằng và vỏ tôm hùm, cua cũng như trong biểu bì của các loài côn trùng

γ, β-chitin do mắt xích ghép lại với nhau theo kiểu song song (β-chitin) và hai song song một ngược chiều (γ –chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn Dạng β tồn tại ít nó được tìm ra trong protein của mực ống, còn dạng γ thì rất hiếm [24]

Vì thế mà người ta thường thủy phân dạng α – chitin do nó tồn tại nhiều và phổ biến

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của chitin

Chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị N-acetyl-β- D-Glucosamin nối với nhau nhờ cầu nối β- 1,4 Glucozit Có công thức phân tử là [C8H13O5]n, trong

đó có chứa 47.29%C, 6.45%H, 39.37%O, 6.89%N và n thay đổi phụ thuộc vào nguyên liệu

Ví dụ: Ở tôm thẻ: n= 400-500

Ở tôm hùm: n= 700-800

Ở cua: n= 500-600

Phân tử lượng: Mchitin= (203.09)n

Chitin là một polysaccharide có tính kiềm, bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi trường acid Dựa vào tính chất này người ta đã sản xuất glucosamine bằng phương pháp hóa học từ chitin bằng cách đun nóng chitin trong acid HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao, chitin sẽ bị thủy phân hoàn toàn, tạo thành 88.5% D-Glucosamin và 12.5% acid acetic

Chitin ở dạng tinh thể, màu trắng ngà không định hình, không tan trong nước, trong acid loãng, kiềm, chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schweizei Sapranora Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành phức chất cần thiết Chitin hòa tan trong dung dịch đặc nóng của các muối: thioxianat Liti (LiSCN), thioxianat Canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo Chitin hòa tan được trong dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4 Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884-890 cm-1

Chititn ổn định với các chất chống oxy hóa khử như: Thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Clorua vôi Ca(ClO)2… từ đó lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các chất oxy hóa để khử màu cho chitin [16]

Khi đun nóng chitin trong dung dịch kiềm đặc, chitin bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan Dựa vào đặc tính này người ta đã sản xuất chitosan từ chitin

Chitin NaOH 40-50% chitosan

Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamine:

độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học dựa vào đặc tính này, gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp phụ và liên kết cộng hóa trị qua cầu nối glutaradehyt Tuy nhiên,

do tính chất kị nước nên bề mặt tiếp xúc của enzyme cố định và cơ chất rất hạn chế

Vì vậy hoạt tính của ezyme cố định trên chitin thường rất thấp [16]

1.1.2 Tổng quan về oligochitin

Oligochitin là sản phẩm của quá trình thủy phân chitin bằng các con đường hóa học hoặc sinh học, chiếu xạ Tùy theo từng điều kiện, chế độ thủy phân mà các Oligochitin có khối lượng phân tử, phân đoạn khác nhau

Oligochitin là một saccharide, được kết hợp bởi các monosaccharide từ 2÷10 trong cấu trúc của chitin Oligochitin có khối lượng phân tử thấp, nó có khả năng hòa tan tốt trong nước và là một chất có tính sinh học cao

Oligochitin được xem như một thực phẩm chức năng, có khả năng chống nấm mốc,

vi khuẩn, chống oxy hóa lipid, chống ung thư, chống bướu, chống bệnh tim mạch [16] Công thức cấu tạo của oligochitin:

n = 2÷10

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của oligochitin

Oligochitin có dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vị đặc biệt chúng có khả năng tan tốt trong nước, độ nhớt thấp, phân tử lượng nhỏ và dễ kết tinh, có hoạt tính sinh học cao như: Cải thiện thiếu máu, bệnh gan, điều hòa huyết áp trong máu, điều hòa lượng Cholesterol, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, chống ung thư máu,…Ngoài ra, oligochitin còn có khả năng kháng nấm, kháng bệnh cho cây trồng vật nuôi

Các phương pháp sản xuất oligochitin: Hiện nay có nhiều phương pháp sản xuất oligochitin như:

- Phương pháp hóa học: Ledderhose thu được từ sự thủy phân chitin trong dung dịch acid một sản phẩm dạng tinh thể mà ông gọi là glucosamine vào năm

1876 Năm 1902, một phương pháp thủy phân nhẹ nhàng hơn tạo nên 2 – acetamiddo-deoxy- D-glucose Như vậy cấu trúc và thành phần chính của chitin đã được cô lập 2-acetamiddo-2-deoxy-D-glucose hydrochloride đã tách rời với hiệu suất 60÷70% do sự thủy phân chitin từ cua với acid chlohydric đậm đặc

- Phương pháp sinh học: Với chế phẩm enzyme từ ốc sên, Hackman đã thu được một lượng 44% tinh thể 2-acetamiddo-2-deoxy-D-glucose và chỉ 0.5% 2-amino-2-deoxy-D-glucose từ chitin Trong thí nghiệm tương tự với một enzyme H Pomatia, tinh thể 2-acetamiddo-2-deoxy-D-glucose thu được từ chitin của nấm men

và tôm hùm với lượng tương ứng là 50% và 80%

- Phương pháp chiếu xạ: Dùng các tia gamma để thủy phân chitin thu oligochitin

1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin, oligochitin

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nước ta là nước có ngành chế biến thủy sản khá phát triển nên các phế phẩm

từ thủy sản đang là vấn đề được quan tâm rất lớn đối với các công ty chế biến Các phế phẩm từ đầu tôm, mai mực, mai ghẹ nếu thải ra môi trường sẽ làm ô nhiễm nặng, mà trong các phế phẩm đó có một lượng lớn chitin nếu được xử lí thu hồi chitin thì không những vấn đề môi trường được giải quyết mà còn kiếm được một nguồn lợi nhuận cao từ phế phẩm thủy sản.Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất chitin, oligochitin và ứng dụng của chúng rất phổ biến và được quan tâm Tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất oligochitin còn là một vấn đề khá mới mẻ, mới bắt đầu được quan tâm và đi vào nghiên cứu Ở nước ta, trường Đại học Nha Trang bắt đầu nghiên cứu tách chiết chitin từ năm 1978 với quy trình của cô Đỗ Minh Phụng nhưng chưa có ứng dụng trong sản xuất cụ thể Gần đây với yêu cầu bức bách trong

xử lí phế phẩm từ thủy sản, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin, chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, đồng thời nghiên cứu quá trình thủy phân chitin tạo các sản phẩm mới có ứng dụng cao trong sản xuất và thực phẩm, cũng như đời sống

Hiện nay, có nhiều cơ sở đang nghiên cứu sản xuất chitin trong đó Trung tâm Chế biến Trường Đại học Nha Trang là nơi sản xuất chitin có chất lượng cao

Ở miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitin và ứng dụng của nó

Ở miền Nam, trung tâm Công nghệ Sinh học và Sinh học Thủy sản phối hợp với một số cơ quan khác như: Đại học Y dược TP.HCM, Phân viện Khoa học Việt Nam, viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin trong các lĩnh vực nông nghiệp, y dược

Năm 2003 một dự án sản xuất thử nghiệm chitin đã hoàn thành tại trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang đã chuyển giao công nghệ sản xuất chitin cho một số cơ sở sản xuất Sản phẩm chitin của Trung tâm Chế biến Thủy sản của Trường Đại học Nha Trang đang có uy tín cao, sản phẩm bắt đầu ứng dụng mạnh mẽ vào một số

cơ sở sản xuất và được đưa đi chào hàng ở Thái Lan Sản phẩm chitin của trường Đại học Nha Trang đã góp phần giảm nhập khẩu chitin từ nước ngoài

Năm 2005 Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất olygosaccharide từ chitin – chitosan bằng phương pháp hóa học Hiện nay công nghệ đã được hoàn thiện, sản phẩm đang tiếp tục được sản xuất tuy nhiên năng suất còn nhỏ

Năm 2006 Trần Thị Luyến triển khai sản xuất olygosaccharide bằng enzyme Đây là một hướng nghiên cứu mới, cần được tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối tượng enzyme khác nhau [11]

Một số quy trình sản xuất chitin và oligosaccharide ở trong nước

1 Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản Hà nội:

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lí tách khoáng lần 1 trong dung dịch HCl 4% trong thời gian τ = 24 giờ ở nhiệt độ phòng với tỉ lệ w/v = ½ Sau đó vớt ra rửa trung tính và dùng NaOH 2% để tách protein lần

1 với tỉ lệ w/v = ½., ở nhiệt độ t0 = 90 ÷ 950C trong thời gian τ = 3 giờ Sau đó rửa trung tính và khử khoáng lần 2 cũng bằng HCl 4% với tỉ lệ w/v = ½, ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 24 giờ và đem rửa trung tính Để tách protein lần 2 ta ngâm trong dung dịch NaOH 2% với tỷ lệ ½.8 ở nhiệt độ t0 = 90÷950C sau 3 giờ vớt

ra và rửa trung tính rồi tiến hành khử khoáng lần 3 giống 2 lần trên Sản phẩm đem phơi hoặc sấy khô ta thu được chitin

Ưu điểm: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu Nhược điểm: Tốn hóa chất Thời gian sản xuất kéo dài, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp thời gian xử lí dài làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm [7]

+ Quy trình của GVC Đỗ Minh Phụng – Đại học Nha Trang (1980)

Nguyên liệu là vỏ tôm khô, được xử lý sạch không lẫn tạp chất được đem đi khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/m = 1/2.5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ vớt ra

và rửa trung tính Tiếp theo ngâm trong NaOH 8% ở nhiệt độ to =100oC trong thời gian τ = 2 giờ với tỷ lệ w/m = 1/2.5 để khử protein, sau đó vớt ra và rửa trung tính Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10% trong 60 phút ,sau đó đem rửa sạch và tiếp tục tẩy màu bằng Na2SO3 1.5% trong thời gian 15 phút rồi vớt ra rửa sạch ta thu được chitin

Nhận xét:

Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp

Nhược điểm: Sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm, thời gian xử lý dài [7]

+ Quy trình sử dụng enzyme papain sản xuất chitosan của PGS - TS Trần Thị Luyến:

Vỏ tôm khô được xử lý trong điều kiện: Dung dịch HCl 10% với tỷ lệ w/m = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ Nguyên liệu vỏ tôm tươi được xử lý tương tự nhưng với tỷ lệ w/m = 1/5 Sau đó tiến hành rửa sạch và khử protein bằng enzyme papain theo phương pháp bổ sung dung dịch 13% papain vào khối vỏ tôm đạt tỷ lệ w/m

= 1/5, dùng HCl điều chỉnh pH về 5 ÷ 5.5 và nâng nhiệt độ lên 70 ÷ 80oC trong thời gian

4 giờ Sau đó rửa sạch, làm khô ta thu được sản phẩm chitin [11]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Nghiên cứu sự tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và công nghệ tách chiết chitin

đã có từ những năm 30 của thế kỷ này Theo Hiranol công nghệ sản xuất chitosan lần đầu tiên trên thế giới bởi Kyowa Yushi.Inc (1988), từ đó một vài công ty Nhật tham gia sản xuất chitin thương mại Công nghệ chitin cũng được sản xuất với quy

mô vừa và nhỏ ở Mỹ và một số quốc gia khác

Mãi đến năm 1975 những áp dụng của chitin mới phát hiện Kể từ đó, chúng được đưa vào ứng dụng có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong đó, Nhật

và Mỹ là hai nước sử dụng chitin đứng hàng đầu thế giới với sản lượng 400÷600 tấn/năm, kế tiếp là Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp

Trong năm 1990, tổng sản lượng chitin và chitosan thế giới sử dụng là 12000 tấn Hằng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5.11 triệu tấn trên toàn thế giới [26] Theo đánh giá của FAO, nhu cầu dùng chitin trên thế giới còn tăng cao trong thế kỷ tới

Do những hạn chế về khả năng hòa tan của chitin nên người ta tiến hành nghiên cứu các chế phẩm từ chitin

Năm 1859 nhờ vào phát minh đầu tiên của Rouget khi đun sôi chitin trong dung dịch HCl đậm đặc Và về sau đã có nhiều công trình nghiên cứu về chitin và các sản phẩm thủy phân từ chitin [17]

Năm 1994 Shigermase và các cộng sự cho rằng Lysozyme có khả năng thủy phân chitin rất tốt trong điều kiện to = 37oC, pH = 5.4 với phương pháp:

Phương pháp A (sử dụng một lượng nhỏ Lysozyme): Sự thủy phân chất keo chitin bởi Lysozyme Cho một ít chất keo chitin (0.5% w/v, 10ml) trong 0.2

M dung dịch đệm acetate (pH = 5.4) với 0.05% NaN3, được ủ với lysozyme (2mg/ml, 1ml), tại 370C trong 3 ngày và sau đó cho thêm dung dịch enzyme lysozyme vào (1ml) Sau 3 ngày, lấy đi ly tâm và những sản phẩm trên bề mặt dung dịch mang đi phân tích bởi HPLC

Phương pháp B (sử dụng một lượng lớn enzyme lysozyme): Chitosan đã được deacetyl 30 -72% Enzyme lysozyme (20mg) cho thêm vào, tạo nên một hỗn hợp, đem đi ủ ở 37oC Trong thời gian ủ, tách ra 0,5ml đưa ra ngoài, acetylated và phân tích bằng HPLC [17]

Năm 1997 Muzzarelli cho rằng Strepmyces griseus HUT 6037 tiết ra enzyme

ngoại bào chitinase ứng dụng thủy phân chitin của loài giáp xác [18]

Quy trình sản xuất chitin của Hackman

Vỏ tôm được làm sạch bằng cách cạo và rửa dưới vòi nước chảy rồi sấy khô trong lò sấy ở nhiệt độ 100oC Lượng dùng là 220 g được ngâm trong 2 lít HCl 2N trong thời gian 5 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó vớt ra rửa kỹ với nước và sấy ở

100oC Sau đó nghiền thành bột, bột nhuyễn này được trích trong bình cầu và lắc mạnh trong 48 giờ với 0.5 lít HCl 2N, ly tâm bỏ phần lỏng, phần rắn được rửa kỹ,

và tiếp tục được chiết bằng cách lắc mạnh trong 12 giờ với 0.5 lít NaOH 1N ở

100oC Quy trình trích ly trong dung dịch kiềm được thực hiên 3 lần, sau đó phần rắn được thu hồi và rửa nhiều lần với nước cho đến khi trung tính Cuối cùng rửa với ethanol và ether, rồi sấy khô, chitin thu được có màu vàng [23]

1.3 Ứng dụng của chitin và oligochitin

Chitin và các dẫn xuất của nó có nhiều đặc tính quý báu như: Có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, có khả năng tự phân hủy sinh học cao, không gây dị ứng, không gây độc hại cho người và gia súc, có khả năng tạo phức với một số kim loại chuyển tiếp như: Cu(II), Ni(II),… Do vậy chitin và dẫn xuất của nó được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực: trong lĩnh vực xử lí nước thải và bảo

vệ môi trường, dược học và y học, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học… Ngoài ra chitin khi mang trên các vật liệu mao quản có khả năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực xúc tác dị thể

1.3.1 Ứng dụng của chitin

Trong y tế:

+ Chitin được dùng làm chỉ khâu phẫu thuật: Trường đại học Delaware đã chế tạo thành công chỉ khâu phẫu thuật từ chitin nhờ phát hiện một số dung môi đặc biệt có khả năng hòa tan chitin ở nhiệt độ thường mà không làm phá hủy cấu trúc polymer Những chỉ khâu chitin mới có thể được hấp thụ bởi cơ thể, loại bỏ sự cần thiết phải phẫu thuật cắt bỏ Một công ty Nhật Bản mua bản quyền bằng sáng chế, và các vật liệu khâu sản xuất tại Nhật Bản Ngoài ra, công ty này sử dụng chitin băng cho vết bỏng, vết thương

bề mặt, và các thủ thuật ghép da, có tác dụng đáng kể trong việc chữa lành vết thương

và giảm đau so với phương pháp băng thông thường [22]

Ở Việt Nam, các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia và bác sĩ trường Đại học y Hà Nội đã nghiên cứu thành công da nhân tạo có tên Vinachitin Vinachitin dùng trong các trường hợp bệnh nhân bị thương, bỏng trên diện tích rộng, bệnh nhân bị choáng do mất nước

dẫn đến bị nhiễm trùng Có tác dụng chống mất nước, tăng khả năng tái tạo da, khi lành không để lại sẹo

+ Sản xuất thuốc kháng virut: Hiện nay thuốc kháng virut có nguồn gốc từ acid N –acetylneuraminic hay gọi tắt là NANA có thể được tổng hợp hoặc thu từ tự nhiên Cả hai trường hợp đều rất tốn kém Nay, các nhà nghiên cứu tại Đại học Vienna đang phát triển một kĩ thuật mới để chuyển chitin thành NANA với chi phí thấp, một loại gen của

vi khuẩn đã được cấy vào loài nấm Trichoderma Thông thường loài nấm này sẽ ăn chitin, phá vỡ cấu trúc của nó để biến thành đường amino monomer Nhờ sự bổ sung loại gen mới vào nấm và qua vài bước tinh chế, kết quả cuối cùng thu được NANA với giá thành thấp hơn các phương thức cũ Nấm Trichoderma có thể nuôi cấy nhân tạo và sinh khối cho nó là chitin thì rất phổ biến [20]

Trong nông nghiệp: Người ta dùng chitin để xử lí hạt giống nhằm tăng hiệu quả phát triển và thúc đẩy sự tăng trưởng cho hạt giống Ngoài ra chitin cho vào hỗn hợp đất sẽ làm giảm đáng kể các gốc cây bị sâu và ức chế nấm [20]

Trong công nghiệp dệt may các dẫn xuất của chitin được sản xuất và sử dụng trong in ấn và chuẩn bị hoàn thiện vải dệt Bên cạnh đó, chitin và chitosan có những đóng góp đáng kể cho ngành y tế liên quan đến khâu dệt, sợi và chất xơ

Chitin được ứng dụng khá phổ biến trong xử lý môi trường nhờ khả năng hấp phụ, tạo phức với các ion kim loại (Pb, Hg, Fe,…) các chất màu, khả năng keo tụ, tạo bông rất tốt với các chất hữu cơ Do đó, chitin được sử dụng như một chất để xử lý nước thải, thu hồi protein trong nước thải, trong xử lý chất màu của nước thải từ nhà máy dệt nhuộm

Chitin nếu để thế thì không tan trong nước, acid loãng, kiềm nên ứng dụng của chitin rất hạn chế, tuy nhiên nếu thủy phân chitin tạo các đồng phân, các sản phẩm thủy phân như chitosan, oligochitin, glucosamine,… do các sản phẩm tan tốt trong nước, có khả năng tạo độ nhớt, có độ kháng khuẩn cao nên được ứng dụng nhiều Các sản phẩm thủy phân chitin được ứng dụng trong y học, bảo quản rau quả do có tính kháng khuẩn Ngoài ra, các sản phẩm của quá trình thủy phân chitin còn được

dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, làm tăng độ bền của giấy Các sản phẩm này còn được dùng để bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng Dùng tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy thực phẩm Hơn nữa, các sản phẩm thủy phân còn dùng trong công nghiệp mỹ phẩm, sản xuất kem giữ

ẩm cho da [20], [21]

1.3.2 Ứng dụng của oligochitin

Trong công nghệ thực phẩm: Oligochitin được dùng để bảo quản cá, tôm, … Trong nông nghiệp: Oligochitin được dùng để tạo lớp phủ ngoài bảo quản hạt giống, điều hòa đất, làm tăng trưởng lá, tiêu diệt mầm bệnh, kháng nấm,…

Oligochitin còn ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của ngô Trong y học: Oligochitin và các chế phẩm của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh Đồng thời oligochitin còn được sử dụng làm thuốc để hạ cholesterol trong máu [7] Trường Đại học Pukyong National Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công ứng dụng của oligochitin trong việc tăng sức đề kháng điều hòa lượng cholesterol, cải thiện máu và bệnh gan, điều hòa áo suất trong máu, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, điều trị các bệnh: Viêm loét dạ dày, bệnh tiêu chảy,…

Oligochitin có tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nên được sử dụng để làm chất bảo quản nguyên liệu thủy sản

1.4 Tổng quan về enzyme

1.4.1 Giới thiệu chung về enzyme

Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống đều do enzyme xúc tác Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học Chúng không những có khả năng xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống, mà sau khi tách khỏi tế bào chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng hóa học Mặt khác, enzyme còn có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm nghìn lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường [2], [3]

Ví dụ: Trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng sacaraza làm chất xúc tác thì tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2.1012 lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác

a Nguồn gốc của enzyme:

Việc điều chế enzyme bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc rất khó khăn và đầy tốn kém, nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: Các mô và cơ quan động vật, mô và

cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

Từ thực vật: Thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả Nhựa đu đủ tách papain, hạt đậu tương tách urease, thân và quả dứa tách bromelain,…

Từ động vật: Từ một số mô và cơ quan động vật người ta có thể thu nhận nhiều enzyme khác nhau và enzyme thường có ở các tuyến tụy, màng nhầy dạ dày, tim,… như dạ dày thu được enzyme pepsin, từ tụy tạng thu được enzyme trypsin,…

Từ vi sinh vật: Vi sinh vật thường đùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm nhiều loại: Aspergillus, Baccillus, Pencillium, Clostridium, Streptomyces và các loại nấm men Vi sinh vật là đối tượng thích hợp để sản xuất enzyme [3]

b Enzyme đều có đặc tính sinh học chung:

- Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật: Quá trình tổng hợp enzyme rất phức tạp

- Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi tách ra khỏi tế bào sống

- Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện ôn hòa

- Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối

- Enzyme có thể thực hiện một phản ứng Các phản ứng này xảy ra ở ngoài tế bào

- Phản ứng enzyme tiêu hao năng lượng rất ít Trong khi đó, các phản ứng hóa học tiêu hao năng lượng nhiều hơn

Ví dụ: trong quá trình thủy phân saccharose

Saccharose Fructose + Glucose

Năng lượng hoạt hóa: + Không có xúc tác: 32000 cal/ptg

+ Acid : 25000 cal/ptg

+ Enzyme saccharase: 9000 cal/ptg

- Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng [24]

c Đặc điểm của enzyme:

Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi không phân cực Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrat Lượng nước hydrat này khá lớn và có vai trò quan trọng là làm môi trường cho các phản ứng sinh hóa [1]

Enzyme cũng bị kết tủa bởi các tác nhân gây kết tủa protein Các tác nhân vật

lý và hóa học làm biến tính protein thì cũng làm biến tính enzyme, vì vậy, enzyme cũng bị mất hoạt tính khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng

d Phân loại enzyme: Có nhiều cách phân loại enzyme, có thể dựa vào bản chất hóa học của enzyme, cũng có thể dựa vào kiểu xúc tác của enzyme để phân loại

- Phân loại theo bản chất hóa học: Enzyme được chia làm 2 lớp: Lớp enzyme đơn giản và lớp enzyme phức tạp

- Phân loại theo cơ chế xúc tác:

Mỗi loại enzyme có đặc tính riêng của nó, dựa theo cơ chế xúc tác thì enzyme được chia thành 6 lớp

Lớp 1: Oxydoreductase: Những enzyme xúc tác cho các phản ứng oxy hóa – khử Lớp 2: Transferase: Những enzyme xúc tác cho phản ứng vận chuyển một nhóm nguyên tử hay một nguyên tử từ chất này sang chất kia

Lớp 3: Hydrolase: Gồm những enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân

Lớp 4: Liase: Gồm những enzyme xúc tác cho các phản ứng tách 1 nhóm nào

đó ra khỏi một chất mà không cần nước

Lớp 5: Ligase (Syntetase): Gồm những enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp các chất hữu cơ đặc hiệu cho cơ thể mà năng lượng được lấy từ cá hợp chất cao năng

Lớp 6: Isomerase: Gồm những enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển đồng phân: D L,… cùng phân tử nhưng khác cấu tạo [29]

e Cơ chế tác động của enzyme:

Apoenzyme quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme Coenzyme quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung Vận tốc của phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị hoạt hóa tức là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứt liên kết cần thiết và hình thành liên kết mới Hầu hết các biến đổi hóa sinh trong tế bào và sơ thể sống đều được xúc tác bởi enzyme ở pH trung tính, nhiệt độ

và áp suất bình thường Nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme – cơ chất mà

cơ chất được hoạt hóa Khi cơ chất kết hợp với enzyme, do kết quả của sự cực hóa,

sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, tham gia phản ứng dễ dàng

Phương trình phản ứng enzyme như sau:

ES + S ES P + E Trong đó:

E: Enzyme; S: Cơ chất; ES: Phức hợp enzyme- cơ chất; P: Sản phẩm Enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất trải qua ba giai đoan:

Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp

Giai đoạn II: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa, đây là giai đoạn xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn III: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme, đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng Từ đó cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu [1]

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: Tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Vander Waals

Enzyme có tính đặc hiệu phản ứng: Mỗi enzyme chỉ tác động lên một loại phản ứng nhất định Mỗi kiểu phản ứng chỉ có một enzyme tác động Ví dụ như: thủy phân liên kết glycoside là enzyme glycosidase

Enzyme chỉ tác động lên một và chỉ một cơ chất Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt như sau:

1- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

2- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao 3- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

4- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

5- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme

6- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng [22]

Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme có những ưu điểm sau:

- Có thể chủ động trong quá trình sản xuất

- Chu kì sinh trưởng phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ vi sinh vật trong một thời gian ngắn từ 36-60 giờ

- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzyme với số lượng lớn

- Giá thành các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các chế phẩm enzyme từ các nguồn gốc khác Vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền

f Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme

- Nhiệt độ: Các enzyme có bản chất protein nên nhiệt độ thấp hay cao đều làm biến tính enzyme Hầu hết các enzyme hoạt động được từ 30 ÷ 70oC, nếu nhiệt độ nằm ngoài khoảng đó có thể làm biến tính enzyme, làm mất khả năng hoạt động của nó

- pH môi trường: Mỗi loại enzyme thì hoạt động ở một khoảng pH tối thích, tại đó cả enzyme và cơ chất đều ở trạng thái ion hóa tốt nhất, chúng dễ dàng kết hợp với nhau để tạo thành phức cơ chất – enzyme Hầu hết các loại enzyme hoạt động ở khoảng pH gần bằng 7 Nếu pH quá cao hay quá thấp sẽ làm biến tính protein, làm biến tính enzyme Tuy nhiên vẫn có một số loại enzyme hoạt động ở pH thấp hoặc cao, ví dụ: Enzyme pepsin dạ dày hoạt động ở pH = 1.5÷2.5

- Ảnh hưởng của cơ chất hoạt hóa: Là những chất làm tăng khả năng xúc tác của enzyme Mỗi enzyme đòi hỏi cho mình chất hoạt hóa khác nhau Chất hoạt hóa

có thể là các cation: K+,… các anion: Cl-,…làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất Trong phản ứng mà các chất hoạt hóa cao sẽ làm tăng khả năng xúc tác cho enzyme

- Ảnh hưởng của chất ức chế: Các chất này làm enzyme từ hoạt động sang trạng thái không hoạt động, từ hoạt động mạnh sang hoạt động yếu Các chất này

mà càng nhiều thì phản ứng xảy ra càng chậm do enzyme bị ức chế hoạt động

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme: Tốc độ đa số các phản ứng do enzyme kiểm soát bị thay đổi theo nồng độ cơ chất, nhưng khi nồng độ cơ chất còn tương đối thấp Khi nồng độ cơ chất tăng nhiều thì tốc độ phản ứng trở nên

ít phụ thuộc vào nồng độ cơ chất mà tùy thuộc vào lượng enzyme có mặt [30]

g Ưu – nhược điểm của phương pháp enzyme so với các phương pháp khác trong quá trình thủy phân chitin

Ưu điểm:

- Tốc độ phản ứng nhanh

- Giá thành rẻ, đơn giản

- Không độc

Nhược điểm:

- Cần kiểm soát chặt các điều kiện nhiệt độ, pH hoạt động của môi trường

1.4.2 Một số nghiên cứu và ứng dụng của enzyme Hemicellulase

Hemicellulase là một hỗn hợp các enzyme thủy phân bao gồm: Xylan endo –1,3- β- xylosidase, EC 3.2.1.32; xylan 1,4- β- xylosidase, EC 3.2.1.37; và α- L- arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55, EC 3.2.1.72 Hemicellulase hoạt động tốt ở pH = 4.5÷ 5.5 và nhiệt độ dưới 500C [26], [27] Hemicellulase thủy phân phân giải các liên kết β-glycoside như: β-1,6; β-1,3 hay β-1,4-glycoside trong phân tử

a Cơ chất của enzyme

Hemicellulase là một enzyme thủy phân hemicelluloses Hemicelluloses là một dạng của polysaccharides kết hợp với cellulose và lignin Hemicelluloses có mặt ở thành tế bào, kém bền, có thể bị thủy phân bởi dung dịch acid yếu và kiềm Khác với cellulose, hemicelluloses vừa là vật liệu cấu trúc vỏ tế bào vừa là nguyên liệu dự trữ năng lượng cho các quá trình trao đổi chất trong rau quả Khi thủy phân hemicelluloses sẽ thu được các monosaccharide như: manose, galactose, xylose hay arabinose

Hemicellulase là một hỗn hợp enzyme có thể thủy phân những thành phần khó tiêu hóa của mô thực vật Nó sẽ tấn công vào hemicelluloses và giải phóng ra những phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn

b Phân loại enzyme hemicellulase

Trong thực vật thì xylan là loại hemicellulose thường gặp nhất Xylan là một polysaccharide dị thể, mạch chính được cấu tạo bới các đơn vị D-glucose nối nhau bằng liên kết 1,4-β-xylopyranosyl, mạch nhánh liên kết với arabinose, aicd glucuronic hay acid arabinoglucuronic Vì vậy để thủy phân hoàn toàn xylan phải

có sự kết hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau Các enzyme tham gia vào quá trình phân cắt xylan bao gồm [31]:

+ Xylanase (EC 3.2.1.8) hay endo-β1,4-xylanase thuộc nhóm enzyme thủy phân, là enzyme phân cắt xylan do thủy giải liên kết 1,4- β-xylopyranosyl trong xylan

+ β-xylosidase (EC 3.2.1.37): Enzyme này có khả năng thủy phân xylobiose

và xylooligosaccharide Β-xylosidase không phân cắt được xylan nhưng lại có thể thủy phân p-nitrophrnyl- β-D-xylopyranoside

+ α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.31): Enzyme này có tính đặc hiệu cao về cơ chất, chỉ phân cắt liên kết giữa 4-O-methylglucuronic và xylooligosaccharide, có hoạt tính thấp trên các polymer glucuronoxylan Enzyme này hoạt động có hiệu quả khi có sự phối hợp với xylanase và β-xylosidase

+ α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55): Đây là exo-enzyme có khả năng phân cắt liên kết α-1,3-arabibofuranoside từ các đơn vị xylopyranoxyl trên chuỗi xylooligosacchride và xylan

+ Acetyl xylan esterase (EC 3.2.1.72): Enzyme thủy phân liên kết ester trên xylan Enzyme tác động lên các nhóm acetyl trên polymer xylan và có thể khử acetyl trên cơ chất tự nhiên một cách nhanh chóng Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân xylan vì khi nhóm acetyl bị phân cắt, các enzyme khác

sẽ dễ dàng tấn công mạch chính của phân tử xylan

Hình 1.4: Cấu trúc không gian của hỗn hợp enzyme hemicellulase

1.4.3 Một số ứng dụng của enzyme Hemicellulase

Hemicellulase có khả năng thủy phân chitin trong điều kiện pH= 4.5, nhiệt độ 370C Sản phẩm thu được có khả năng hòa tan được trong nước, sản phẩm được ứng dụng nhiều

trong các ngành công nghệ thực phẩm như để bảo quản thủy sản, nông sản, … Ngoài ra, sản phẩm của quá trình thủy phân còn dùng trong y học, trong nông nghiệp

Enzyme hemicellulase còn có khả năng thủy phân chitosan có độ deacetyl trên 22%, trong điều kiện pH = 4.5, nhiệt độ = 370C

Ngoài ra, hemicellulase được ứng dụng trong xử lí phế liệu rau quả do hemicellulase trong rau quả chủ yếu là pentose, hemicellulase sẽ thủy phân pentose tạo thành những phân tử đường có khối lượng thấp hơn giúp cơ thể sinh vật hấp thu tốt [16] Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về ứng dụng của hemicellulase, như trong sản xuất tinh dầu dừa tinh khiết trong điều kiện pH = 7, nhiệt độ = 500C, thời gian 6 ngày Trong công nghiệp sản xuất bia, dùng enzyme hemicellulase để đường hóa các tinh bột khác thay thế cho malt [15]

Hơn nữa, enzyme hemicellulase còn được dùng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp thành các hợp chất đơn giản dễ tiêu hóa

CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu chính

 Chitin từ vỏ tôm thẻ, loại thương mại được mua tại Nha Trang sau đó được

xử lý lại đạt tiêu chuẩn chitin sử dụng cho thí nghiệm, cụ thể:

 Enzyme hemicellulase: loại tinh khiết sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ

vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của hãng Sigma–Aldrich, địa chỉ 3050

Spruce Street, Saint Louis, MO 63103

Enzyme có đặc điểm như sau:

- Dạng bột

- Màu trắng

- Tan trong nước

- Dung dịch đệm acetate: Đệm được pha từ: Acid acetic (0.1M), natri acetate (0.1M)

2.2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

- Xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp kết tủa

- Xác định khả năng kháng khuẩn của oligochitin bằng phương pháp MIC