2.2.2.1. Quy trình tinh sạch chitin thương mại
Chitin từ vỏ tôm thẻ, loại thương mại vẫn còn hàm lượng khoáng và protein khá cao (>1%) và chứa các tạp chất, màu sắc không đạt yêu cầu nên cần được xử lý tinh sạch để đạt yêu cầu thí nghiệm.
Quy trình tinh sạch chitin: [14]
Hình 2.3. Quy trình tinh sạch chitin
Nguyên liệu là vỏ tôm khô thương mại, xử lý sơ bộ loại bỏ tạp chất, sau đó rửa sạch được đem đi khử khoáng bằng dung dịch HCl 2% với tỷ lệ m/v= 1/10 (g/ml), ủ
Chitin khô thương mại
Xử lý sơ bộ Khử khoáng bằng HCl 2%. Tomt, τ = 6 giờ, m/v = 1/10 Rửa trung tính Khử protein bằng NaOH 2%, to= 65oC, τ = 12 giờ, m/v = 1/5 Rửa trung tính Phơi khô
ở nhiệt độ thường trong 6 giờ. Mỗi giờ đảo một lần để quá trình khử khoáng tốt hơn. Sau đó vớt ra rửa trung tính. Tiếp theo, ta tiến hành khử protein bằng cách ngâm trong dung dịch NaOH 2% với tỷ lệ m/v= 1/5 trong thời gian 12 giờ, ở nhiệt độ to = 65oC. Sau đó, vớt ra rửa trung tính. Đem phơi khô, rồi đem mẫu đi xác định hàm lượng ẩm, độ khoáng, hàm lượng protein, đạt yêu cầu thì được.
2.2.2.2. Quy trình xử lý chitin huyền phù
Do chitin không tan trong nước nên để tiến hành thủy phân cần huyền phù hóa chitin. Dịch huyền phù chitin được xử lý như sau:
Hình 2.4: Quy trình xử lí huyền phù chitin
Cân 25g chitin, sau đó cho 100ml dung dịch HCl đậm đặc vào. Khuấy liên
tục trong 3 phút ở nhiệt độ 40oC trên máy khuấy từ. Sau đó, tạo chitin huyền phù
chitin Xử lí HCl 30% Khuấy từ ở 40oC, trong 3 phút Chitin huyền phù Nước lạnh (2÷4oC) Ly tâm Đưa lên pH = 4.5 bằng nước lạnh (2÷4oC) Dịch huyền phù chitin
bằng cách cho thêm từ từ nước lạnh (2-4oC) đến 1000ml. Dịch được thu lại bằng cách li tâm bằng máy li tâm loại lớn, tốc độ 3500 vòng/phút. Dịch huyền phù được đưa lên pH = 4.5 bằng cách rửa nhiều lần bằng nước lạnh (2-4oC). Bảo quản huyền phù ở điều kiện lanh.
2.2.2.3. Quy trình dự kiến
Sau khi tham khảo tài liệu, quy trình sản xuất oligochitin từ chitin bằng enzyme hemicellulase dự kiến được đề xuất như sau:
Hình 2.5: Quy trình dự kiến sản xuất oligochitin
Giải thích quy trình: Chitin Xử lí Thủy phân Đun cách thủy Lọc/ li tâm
Sấy thăng hoa
Oligochitin - nồng độ enzyme - pH -nhiệt độ (to) - thời gian (τ) Dịch lọc/li tâm Huyền phù
-Nguyên liệu: Chitin đạt tiêu chuẩn được sản xuất từ vỏ tôm thẻ theo quy trình như bên quy trình tinh sạch chitin ở mục 2.2.1.
Mục đích: dùng chitin đạt chỉ tiêu trong thí nghiệm để thủy phân tạo hiệu suất thu hồi oligochitin cao.
-Xử lý : Chitin đạt tiêu chuẩn được xay nhỏ, để đảm bảo quá trình thủy phân dễ dàng.
-Huyền phù chitin: Được tạo thành theo quy trình ở mục 2.2.2.
Mục đích: Để quá trình thủy phân dễ dàng, enzyme tiếp xúc với cơ chất nhiều hơn.
-Thủy phân: Công đoạn thủy phân có tác dụng làm yếu và cắt các liên kết glucozit trong mạch chitin. Nó quyết định đến hiệu suất sản phẩm. Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ, pH, thời gian với các thông số thích hợp. Trong quá trình thủy phân cần khuấy hoặc lắc đều liên tục để tăng cường khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Đồng thời theo dõi nhiệt độ và pH để đảm bảo nhiệt độ và pH luôn ổn định trong quá trình thủy phân.
-Đun cách thủy: Sau khi thủy phân dịch thủy phân được mang đi đun cách thủy nhằm đình chỉ hoạt động của enzyme và tăng nồng độ chất khô của dung dịch tạo thuận lợi cho quá trình lọc/ li tâm.
Dịch thủy phân xong được cho vào nồi đun cách thủy trong 30 phút.
-Lọc/li tâm: Nhằm tách phần chitin không tan còn lại sau quá trình thủy phân. Do oligochitin tan trong nước nên sau khi lọc/ li tâm thu được dịch oligochitin hòa tan.
-Sấy thăng hoa: Mục đích: thu hồi oligochitin ở dạng bột.
Dịch thủy phân sau li tâm tách bớt nước được đem đi sấy chân không thăng
hoa ở 30oC đến khô để đảm bảo chất lượng sản phẩm.
2.2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật
a. Xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới quá trình thủy phân
Theo như thông tin do hãng sản xuất Sigma-Aldrich thì enzyme Hemicellulase hoạt động ở pH=4.5, nhiệt độ là 37oC. Và theo như các nghiên cứu của Aiba và
Muraki (năm 1996) có thể dùng enzyme hemicellulase thủy phân chitin ở nhiệt độ
37oC và pH=4,5 với thời gian là 3 ngày. Vì thế trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng
của nồng độ chọn nồng độ enzyme là từ 0.01÷0.04 UI/ml so với bước nhảy là 0.01. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cổ điển, cố định các thông số rồi thay đổi nồng độ enzyme.
Hình 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân
pH=4.5 t= 37oC
thời gian: 3 ngày chitin
Xử lý
Thủy phân với nồng độ enzyme là
[E] = 0.01UI/ml [E] = 0.02UI/ml [E] = 0.03UI/ml [E]= 0.04UI/ml
Đun cách thủy
oligochitin
Đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin
Chọn nồng độ enzyme thích hợp Dịch huyền phù
b. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình thủy phân
Theo như thông tin do hãng sản xuất Sigma-Aldrich thì enzyme Hemicellulase hoạt động ở pH=4.5, nhiệt độ là 37oC. Và theo như các nghiên cứu của Aiba và Muraki (năm 1996) có thể dùng enzyme hemicellulase thủy phân chitin ở nồng độ enzyme thích hợp như đã làm thí nghiệm ở trên (a) và pH=4.5 với thời gian là 3
ngày. Vì thế trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chọn là từ 27-42oC
với bước nhảy là 5oC. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cổ điển, cố định các
thông số rồi thay đổi nhiệt độ.
Hình 2.7: Sơ đồ thí nghiệm xác định nhiệt độ của quá trình thủy phân
pH=4.5
thời gian: 3 ngày [E]:thích hợp chitin
Xử lí
Thủy phân với các nhiệt độ là
27oC 32oC 37oC 42oC
Đun cách thủy
oligochitin
Đánh giá hiệu suất thu
hồi
Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân Dịch huyền phù
c. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân
Theo như thông tin do hãng sản xuất Sigma-Aldrich thì enzyme Hemicellulase hoạt động ở pH=4.5, nhiệt độ là 37oC. Và theo như các nghiên cứu của Aiba và Muraki (năm 1996) có thể dùng enzyme hemicellulase thủy phân chitin ở nồng độ enzyme thích hợp như thí nghiệm a và pH =4.5, với nhiệt độ thích hợp như thí nghiệm b. Vì thế trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của thời gian chọn là từ 1÷4 ngày với bước nhảy là 1 ngày. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cổ điển, cố định các thông số rồi thay đổi thời gian
Hình 2.8: Sơ đồ thí nghiệm xác định thời gian thủy phân
pH=4.5
nhiệt độ thích hợp [E]:thích hợp chitin
Xử lí
Thủy phân với các thời gian là
1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày
Đun cách thủy
oligochitin
Đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin
Chọn thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân Dịch huyền phù