VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu quy trình sản xuấ- 123docz.net

2.1.1. Vật liệu chính

 Chitin từ vỏ tôm thẻ, loại thương mại được mua tại Nha Trang sau đó được

xử lý lại đạt tiêu chuẩn chitin sử dụng cho thí nghiệm, cụ thể:

-Màu sắc: trắng ngà. -Độ ẩm: <10%. -Hàm lượng protein: <1%. -Hàm lượng khoáng: <1%. -Độ deacetyl: 20%. Hình 2.1: Vật liệu chitin

 Enzyme hemicellulase: loại tinh khiết sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ

vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của hãng Sigma–Aldrich, địa chỉ 3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103.

Enzyme có đặc điểm như sau: -Dạng bột.

-Tan trong nước.

-Có hoạt tính 1.5 UI/mg.

Hình 2.2: Enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ Aspergillus niger

2.1.2. Vật liệu phụ

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm được mua ở phòng hóa của trung tâm Chế biến Đại học Nha Trang như: Dung dịch HCl đậm đặc, NaOH đậm đặc.

- Dung dịch đệm acetate: Đệm được pha từ: Acid acetic (0.1M), natri acetate (0.1M).

2.2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp phân tích 2.2.1. Phương pháp phân tích

- Xác định hàm lượng khoáng của chitin bằng phương pháp nung ở 500-600oC đến

khối lượng không đổi - TCVN 4327-93.

-Xác định hàm lượng ẩm của nguyên liệu chitin ban đầu bằng phương pháp

sấy ở 105oC - TCVN 1867:2001.

-Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu chitin ban đầu bằng phương

pháp so màu Biuret, so màu trên máy UV-Vis - TCVN 4328:1-2007.

-Xác định hoạt độ enzyme hemicellulase bằng phương pháp định lượng. [13]

-Xác định màu sắc của chitin bằng phương pháp cảm quan- TCVN 3215-79.

-Xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp kết tủa.

-Xác định khả năng chống oxy hóa của oligochitin bằng phương pháp MIC.

2.2.2. Bố trí thí nghiệm

2.2.2.1. Quy trình tinh sạch chitin thương mại

Chitin từ vỏ tôm thẻ, loại thương mại vẫn còn hàm lượng khoáng và protein khá cao (>1%) và chứa các tạp chất, màu sắc không đạt yêu cầu nên cần được xử lý tinh sạch để đạt yêu cầu thí nghiệm.

Quy trình tinh sạch chitin: [14]

Hình 2.3. Quy trình tinh sạch chitin

Nguyên liệu là vỏ tôm khô thương mại, xử lý sơ bộ loại bỏ tạp chất, sau đó rửa sạch được đem đi khử khoáng bằng dung dịch HCl 2% với tỷ lệ m/v= 1/10 (g/ml), ủ

Chitin khô thương mại

Xử lý sơ bộ Khử khoáng bằng HCl 2%. Tomt, τ = 6 giờ, m/v = 1/10 Rửa trung tính Khử protein bằng NaOH 2%, to= 65oC, τ = 12 giờ, m/v = 1/5 Rửa trung tính Phơi khô

ở nhiệt độ thường trong 6 giờ. Mỗi giờ đảo một lần để quá trình khử khoáng tốt hơn. Sau đó vớt ra rửa trung tính. Tiếp theo, ta tiến hành khử protein bằng cách ngâm trong dung dịch NaOH 2% với tỷ lệ m/v= 1/5 trong thời gian 12 giờ, ở nhiệt độ to = 65oC. Sau đó, vớt ra rửa trung tính. Đem phơi khô, rồi đem mẫu đi xác định hàm lượng ẩm, độ khoáng, hàm lượng protein, đạt yêu cầu thì được.

2.2.2.2. Quy trình xử lý chitin huyền phù

Do chitin không tan trong nước nên để tiến hành thủy phân cần huyền phù hóa chitin. Dịch huyền phù chitin được xử lý như sau:

Hình 2.4: Quy trình xử lí huyền phù chitin

Cân 25g chitin, sau đó cho 100ml dung dịch HCl đậm đặc vào. Khuấy liên

tục trong 3 phút ở nhiệt độ 40oC trên máy khuấy từ. Sau đó, tạo chitin huyền phù

chitin Xử lí HCl 30% Khuấy từ ở 40oC, trong 3 phút Chitin huyền phù Nước lạnh (2÷4oC) Ly tâm Đưa lên pH = 4.5 bằng nước lạnh (2÷4oC) Dịch huyền phù chitin

bằng cách cho thêm từ từ nước lạnh (2-4oC) đến 1000ml. Dịch được thu lại bằng cách li tâm bằng máy li tâm loại lớn, tốc độ 3500 vòng/phút. Dịch huyền phù được đưa lên pH = 4.5 bằng cách rửa nhiều lần bằng nước lạnh (2-4oC). Bảo quản huyền phù ở điều kiện lanh.

2.2.2.3. Quy trình dự kiến

Sau khi tham khảo tài liệu, quy trình sản xuất oligochitin từ chitin bằng enzyme hemicellulase dự kiến được đề xuất như sau:

Hình 2.5: Quy trình dự kiến sản xuất oligochitin

Giải thích quy trình: Chitin Xử lí Thủy phân Đun cách thủy Lọc/ li tâm

Sấy thăng hoa

Oligochitin - nồng độ enzyme - pH -nhiệt độ (to) - thời gian (τ) Dịch lọc/li tâm Huyền phù

-Nguyên liệu: Chitin đạt tiêu chuẩn được sản xuất từ vỏ tôm thẻ theo quy trình như bên quy trình tinh sạch chitin ở mục 2.2.1.

Mục đích: dùng chitin đạt chỉ tiêu trong thí nghiệm để thủy phân tạo hiệu suất thu hồi oligochitin cao.

-Xử lý : Chitin đạt tiêu chuẩn được xay nhỏ, để đảm bảo quá trình thủy phân dễ dàng.

-Huyền phù chitin: Được tạo thành theo quy trình ở mục 2.2.2.

Mục đích: Để quá trình thủy phân dễ dàng, enzyme tiếp xúc với cơ chất nhiều hơn.

-Thủy phân: Công đoạn thủy phân có tác dụng làm yếu và cắt các liên kết glucozit trong mạch chitin. Nó quyết định đến hiệu suất sản phẩm. Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ, pH, thời gian với các thông số thích hợp. Trong quá trình thủy phân cần khuấy hoặc lắc đều liên tục để tăng cường khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Đồng thời theo dõi nhiệt độ và pH để đảm bảo nhiệt độ và pH luôn ổn định trong quá trình thủy phân.

-Đun cách thủy: Sau khi thủy phân dịch thủy phân được mang đi đun cách thủy nhằm đình chỉ hoạt động của enzyme và tăng nồng độ chất khô của dung dịch tạo thuận lợi cho quá trình lọc/ li tâm.

Dịch thủy phân xong được cho vào nồi đun cách thủy trong 30 phút.

-Lọc/li tâm: Nhằm tách phần chitin không tan còn lại sau quá trình thủy phân. Do oligochitin tan trong nước nên sau khi lọc/ li tâm thu được dịch oligochitin hòa tan.

-Sấy thăng hoa: Mục đích: thu hồi oligochitin ở dạng bột.

Dịch thủy phân sau li tâm tách bớt nước được đem đi sấy chân không thăng

hoa ở 30oC đến khô để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật

a. Xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới quá trình thủy phân

Theo như thông tin do hãng sản xuất Sigma-Aldrich thì enzyme Hemicellulase hoạt động ở pH=4.5, nhiệt độ là 37oC. Và theo như các nghiên cứu của Aiba và

Muraki (năm 1996) có thể dùng enzyme hemicellulase thủy phân chitin ở nhiệt độ

37oC và pH=4,5 với thời gian là 3 ngày. Vì thế trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng

của nồng độ chọn nồng độ enzyme là từ 0.01÷0.04 UI/ml so với bước nhảy là 0.01. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cổ điển, cố định các thông số rồi thay đổi nồng độ enzyme.

Hình 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân

pH=4.5 t= 37oC

thời gian: 3 ngày chitin

Xử lý

Thủy phân với nồng độ enzyme là

[E] = 0.01UI/ml [E] = 0.02UI/ml [E] = 0.03UI/ml [E]= 0.04UI/ml

Đun cách thủy

oligochitin

Đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin

Chọn nồng độ enzyme thích hợp Dịch huyền phù

b. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình thủy phân

ngày. Vì thế trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chọn là từ 27-42oC

với bước nhảy là 5oC. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cổ điển, cố định các

thông số rồi thay đổi nhiệt độ.

Hình 2.7: Sơ đồ thí nghiệm xác định nhiệt độ của quá trình thủy phân

pH=4.5

thời gian: 3 ngày [E]:thích hợp chitin

Xử lí

Thủy phân với các nhiệt độ là

27oC 32oC 37oC 42oC

Đun cách thủy

oligochitin

Đánh giá hiệu suất thu

hồi

Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân Dịch huyền phù

c. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân

Theo như thông tin do hãng sản xuất Sigma-Aldrich thì enzyme Hemicellulase hoạt động ở pH=4.5, nhiệt độ là 37oC. Và theo như các nghiên cứu của Aiba và Muraki (năm 1996) có thể dùng enzyme hemicellulase thủy phân chitin ở nồng độ enzyme thích hợp như thí nghiệm a và pH =4.5, với nhiệt độ thích hợp như thí nghiệm b. Vì thế trong công đoạn khảo sát ảnh hưởng của thời gian chọn là từ 1÷4 ngày với bước nhảy là 1 ngày. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp cổ điển, cố định các thông số rồi thay đổi thời gian

Hình 2.8: Sơ đồ thí nghiệm xác định thời gian thủy phân

pH=4.5

nhiệt độ thích hợp [E]:thích hợp chitin

Xử lí

Thủy phân với các thời gian là

1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày

Đun cách thủy

oligochitin

Đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin

Chọn thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân Dịch huyền phù

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu Dụng cụ: Dụng cụ: -Pipet, ống đong. -Bình tam giác. -Bếp ga. -Cốc thủy tinh, bình định mức. -Các lọ làm thí nghiệm.  Thiết bị: -Bể ổn nhiệt, tủ ấm.

-Nhiệt kế, máy đo pH.

-Cân phân tích, tủ lạnh. -Tủ sấy, máy li tâm.

-Máy so màu.

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. SẢN XUẤT CHITIN TINH SẠCH VÀ CHITIN HUYỀN PHÙ 3.1.1. Sản xuất chitin tinh sạch 3.1.1. Sản xuất chitin tinh sạch

Sau khi tinh sạch chitin theo quy trình, nó có các chỉ tiêu chất lượng như sau:

- Màu sắc: Trắng ngà.

- Độ ẩm: 9.37%.

- Hàm lượng protein: 0.75%.

- Hàm lượng khoáng: 0.855%

3.1.2. xử lý chitin huyền phù

Sau khi xử lý, chitin huyền phù được tạo ra có các đặc điểm:

- Màu sắc: trắng sữa.

- Độ ẩm: 76%.

- pH: 4.5.

3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CỦA QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITIN 3.2.1. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình sản xuất oligochitin 3.2.1. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình sản xuất oligochitin

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thu hồi oligochitin được thể hiện trên đồ thị hình 3.1 như sau:

Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 cho thấy: Hiệu suất thu hồi oligochitin cao nhất là 49.28% ở nồng độ enzyme là 0.04 UI/ml, hiệu suất thu hồi oligochitin thấp nhất là 39.36% ở nồng độ enzyme là 0.01 UI/ml. Ở các nồng độ enzyme là 0.02 UI/ml thì hiệu suất thu hồi oligochitin là 40.97%, ở nồng độ enzyme 0.03% thì hiệu suất thu hồi oligochitin là 47.71%. Theo như đồ thị hình 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi oligochitin tăng dần theo nồng độ enzyme tăng, từ nồng độ enzyme 0.01 ÷ 0.02 UI/ml thì hiệu suất tăng 1.61%, hiệu suất thu hồi oligochitin tăng nhiều nhất là 6.74 % ở nồng độ enzyme 0.02÷0.03 UI/ml. Từ nồng độ enzyme 0.03÷0.04 UI/ml hiệu suất thu hồi oligochitin tăng lên 1.57%.

Như vậy khi nồng độ enzyme tăng lên hiệu suất thu hồi oligochitin tăng lên, tuy nhiên khi nồng độ enzyme tăng lên cao thì hiệu suất thu hồi oligochitin không tăng lên đáng kể, có thể do nồng độ enzyme càng tăng thì enzyme thủy phân cơ chất càng nhiều. Khi nồng độ enzyme thấp, cơ chất nhiều nên thủy phân không cho hiệu suất cao. Hơn nữa, do chitin không phải là cơ chất chính của enzyme hemicellulase nên hoạt lực của enzyme không đạt tối đa làm cho hiệu suất thu hồi oligochitin không cao. Khi nồng độ enzyme tăng lên, cơ chất vẫn giữ nguyên thì enzyme tiếp xúc cơ chất nhiều, thủy phân tốt hơn. Tuy nhiên ở nồng độ cao nhất 0.04 UI/ml hiệu suất thu hồi cao nhất nhưng không cao hơn ở nồng độ enzyme 0.03 UI/ml là bao nhiêu nên nếu chọn ở nồng độ 0.04 UI/ml thì sẽ tốn enzyme mà enzyme giá đắt.

Kết luận: Chọn nồng độ enzyme 0.03UI/ml cho các lần thí nghiệm sau.

3.2.2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình sản xuất oligochitin

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thu hồi oligochitin được thể hiện trên đồ thị hình 3.2 như sau:

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá trình sản xuất oligochitin

Từ kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy: Hiệu suất thu hồi oligochitin cao nhất là 51.37% ở nhiệt độ 42oC, hiệu suất thu hồi oligochitin thấp nhất là 42.75% ở nhiệt độ 27oC. Còn ở nhiệt độ 32oC hiệu suất thu hồi oligochitin là 44.82% và ở nhiệt độ

37oC hiệu suất thu hồi oligochitin là 51.06%. Từ đó cho thấy khi nhiệt độ tăng thì

hiệu suất thu hồi oligochitin tăng lên cụ thể: từ 27÷32oC hiệu suất thu hồi tăng

2.07%, còn từ 32÷37oC hiệu suất thu hồi tăng nhiều nhất 6.24%, từ 37÷42oC hiệu

suất tăng nhưng tăng chậm chỉ tăng 0.31%.

Kết quả như trên là do: Đối với enzyme hemicellulase có nguồn gốc từ

Aspergillus niger hoạt động ở khoảng nhiệt độ tối thích 35÷ 45oC trong điều kiện

pH bằng 4.5. Vì vậy ở nhiệt độ 27÷32oC, enzyme này hoạt động không cao làm cho

hiệu suất thu hồi oligochitin không cao. Còn ở 37oC đây là nhiệt độ tối thích cho enzyme này hoạt động tốt nhất nên hoạt tính của enzyme tại đây mạnh nhất và cho hiệu suất thu hồi cao. Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng lên nữa thì enzyme cũng cho hiệu suất thu hồi cao nhưng hiệu suất này tăng lên không đáng kể. Mặt khác điều

này cũng phù hợp với công trình nghiên cứu của Aiba và Muraki (1996, 1997) cho rằng enzyme hemicellulase thủy phân chitin ở nhiệt độ t = 37oC là tốt nhất.

Kết luận: Chọn nhiệt độ 37oC cho các lần thí nghiệm sau.

3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi oligochitin

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thu hồi oligochitin được thể hiện trên đồ thị hình 3.3 như sau:

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thu hồi oligochitin

Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.3 cho thấy: Hiệu suất thu oligochitin cao nhất là 54.04% ở thời gian là 4 ngày, hiệu suất thu hồi oligochitin thấp nhất là 47.22% ở thời gian là 1 ngày, ở thời gian 2 ngày thì hiệu suất thu oligochitin là 49.13% và thời gian 3 ngày thì hiệu suất thu oligochitin là 52.85%. Hiệu suất thu oligochitin tăng dần khi thời gian thủy phân tăng, tăng nhiều nhất là từ thời gian 1 ngày ÷ 2 ngày, hiệu suất tăng 1.91%. Khi thời gian thủy phân tăng từ 2 ngày ÷ 3 ngày thì hiệu suất thu oligochitin tăng 3.72%, thời gian tăng từ 3 ngày ÷ 4 ngày thì hiệu suất thu oligochitin tăng 1.19%.

Do thời gian đầu enzyme chưa thích nghi với môi trường cơ chất mới nên hoạt động chưa hiệu quả làm cho hiệu suất thu hồi thấp, thời gian sau enzyme thích nghi được khi để thời gian càng dài thì enzyme và cơ chất càng có cơ hội tiếp xúc với nhau nhiều hơn, làm cho quá trình phân cắt xảy ra nhiều hiệu suất thu hồi oligochitin càng cao. Tuy nhiên khi thời gian càng tăng thì hiệu suất thu oligochitin lại tăng không nhiều, có thể là do khoảng thời gian thích hợp để enyme thủy phân lượng cơ chất chitin đó là phù hợp chứ không phải thời gian càng nhiều thì enzyme thủy phân càng triệt để, tăng thời gian enzyme vẫn tiếp tục thuỷ phân lượng chitin còn lại nhưng hiệu suất thu được không tăng là mấy, thời gian thì cần nhiều mà lượng oligochitin thu được tăng lên không nhiều sẽ làm tốn thời gian, tăng công sản xuất lên. Nên sẽ lựa chọn thời gian là 3 ngày cho các thí nghiệm.

Kết luận: Chọn thời gian 3 ngày cho các thí nghiệm.

3.3. QUY TRÌNH HOÀN THIỆN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG ENZYME HEMICELLULASE BẰNG ENZYME HEMICELLULASE

3.3.1. Sơ đồ quy trình