Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc DH EG 2000 và ứng dụng phòng can thiệp dịch vào thực tế sản xuất

Thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn, khóa luận

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp I

-

Bùi Thanh Khiết

Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt

từ chủng virus vacxin nhược độc DH-EG-2000 và ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: Thú y Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: ts nguyễn bá hiên

Hà Nội - 2007

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ2

đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Bùi Thanh Khiết

Lời cám ơn

Quá trình học tập và nghiên cứu ở lớp cao học Thú y K14 Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy giáo, cô giáo Đến nay tôi đ2 hoàn thành khóa học Nhân dịp này tôi xin

được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với các thầy cô giáo trong Nhà trường, Khoa sau đại học, Khoa Chăn nuôi - Thú y, trong đó có các thầy cô giáo ở Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Bá Hiên người đ2 trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Viết Không - Trưởng bộ môn Hoá sinh - Miễn dịch - Bệnh lý cùng các đồng nghiệp ở Viện thú y quốc gia và các Trạm, Chi cục Thú y đ2 giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập

Xin chân thành cảm ơn Dự án P.H.E thuộc Trung tâm sinh thái nông nghiệp (Đại học Nông nghiệp I Hà Nội) đ2 hỗ trợ một phần kinh phí cho đề tài nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn các cơ quan, những người thân và bạn bè đ2

động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Rất mong nhận được những ý kiến góp ý của các thầy cô giáo đối với

đề tài nghiên cứu tôi đ2 thực hiện

Xin trân trọng cám ơn !

Tác giả

Bùi Thanh Khiết

Mục lục

2.4 Một số hiểu biết về vacxin phòng bệnh viêm gan vịt 26

3 Nội dung - nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu 30

4.1 Kiểm tra giống vacxin trước khi đưa vào sản xuất 474.1.1 Khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus vacxin nhược

4.1.2 Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng vurus vacxin

4.2.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin 574.2.3 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin 614.2.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin 634.2.5 Xác định khả năng bảo hộ của vacxin với vịt trong độ tuổi mẫn cảm 734.3 ứng dụng vacxin trong phòng, can thiệp dịch 794.3.1 Kết quả ứng dụng vacxin trong phòng bệnh cho vịt 804.3.2 ứng dụng vacxin trong việc can thiệp dịch 81

Danh môc ch÷ viÕt t¾t

DHV : Duck Hepatitis Virus RNA : Axit Ribonucleic DNA : Axit Desoxyribonucleic EID50 : 50 Percent Embryo Infective Dose ELD50 : 50 Percent Embryo Lethal Dose GDP : Gross Dometic Product

OIE : Office International des Epizooties GOT : Glutamat - Oxaloaxetat - Transaminaza GPT : Glutamat - Pyruvat – Transaminaza

®vth : §¬n vÞ trung hoµ

Danh mục bảng

2.1 Tình hình bệnh viêm gan vịt ở một số nước Châu á 74.1 Kết quả cấy truyền trên phôi gà để kiểm tra tính ổn định của

4.2 Kết quả thí nghiệm để xác định chỉ số ELD50 524.3 Kết quả thí nghiệm để xác định chỉ số EID50 544.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin nhược độc viêm

4.8 Kết quả công cường độc để kiểm tra hiệu lực của vacxin cho

4.9 Biến động hàm lượng kháng thể của vịt được tiêm vacxin

nhược độc viêm gan vịt DH - EG - 2000 (Lô 1) 754.10 Tổng hợp biến động hàm lượng kháng thể của vịt được tiêm

4.11 Tổng hợp kết quả phòng bệnh cho vịt con bằng tiêm vacxin

nhược độc viêm gan vịt sản xuất từ chủng virus DH - EG - 2000 814.12 Tổng hợp kết qủa can thiệp dịch bằng vacxin nhược độc viêm

4.13 Tổng hợp kết qủa can thiệp dịch bằng vacxin theo thời gian

Danh mục hình

4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhược độc viêm gan vịt

4.2 Biểu đồ biến động hàm lượng kháng thể ở vịt được tiêm vacxin

Danh mục ảnh

2.2 Phôi vịt bình thường (a) và phôi vịt xuất huyết do bị gây nhiễm

4.1 Phôi gà còi cọc, xuất huyết do gây nhiễm virus vacxin

4.2 Gan phôi gà xuất huyết, hoại tử sau khi gây nhiễm virus vaxin

4.3 Kết quả PCR với cặp mồi Duck HPBF2/Duck HPBR2 đặc hiệu

để nhận biết virus viêm gan vịt cường độc type I 64 4.4 Phôi vịt 12 ngày tuổi sau khi tiêm hỗn dịch huyết thanh-virus 67 4.5 Tư thế chết của vịt mắc bệnh viêm gan virus (Opisthotonus) 85 4.6 Gan vịt bình thường (a) và gan vịt bị xuất huyết do nhiễm

1 Mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là một trong những nước thuộc Đông Nam châu á có nền văn minh lúa nước lâu đời Với gần 70% dân số làm nông nghiệp Xuất phát từ những đặc điểm riêng biệt về địa hình, tập quán canh tác, điều kiện thuận lợi cho việc chăn thả tự nhiên nên vịt là loài thủy cầm được người nông dân nước

ta rất ưa chuộng vì chúng dễ nuôi, qui mô đàn đa dạng, phù hợp với tập quán chăn nuôi nhỏ lẻ Hơn nữa vịt là loài chịu khó tìm kiếm thức ăn, chúng thu nhặt được lương thực rơi v2i sau thu hoạch, tận dụng được nguồn thức ăn phong phú trong tự nhiên, tiết kiệm được chi phí cho người chăn nuôi Vì thế con vịt đ2 từ lâu đ2 gắn bó với người nông dân Việt Nam Nghề nuôi vịt cũng

là một nghề truyền thống của người nông dân Việt Nam

Những năm gần đây nước ta sản xuất khoảng 30000 đến 40000 tấn thịt vịt một năm; 800 triệu đến 1 tỷ quả trứng, 1000 đến 1500 tấn lông vũ Theo số liệu thống kê của FAO, (2003) [22] tổng số vịt của Việt Nam là 57 triệu con,

đứng thứ 2 thế giới, chỉ sau Trung Quốc, sản lượng thịt vịt của Việt Nam là 67,8 nghìn tấn, đứng thứ 5 thế giới

Trong chăn nuôi vịt, một trong những những bệnh thường gặp và gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng phải kể đến bệnh viêm gan do virus

Viêm gan virus ở vịt (Duck Virus Hepatitis - DVH) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan mạnh của loài vịt, tỷ lệ nhiễm và chết cao Vịt con dưới 6 tuần tuổi dễ cảm nhiễm Đặc biệt là vịt dưới 3 tuần tuổi và nặng nhất ở vịt con từ 1 - 7 ngày tuổi với tỷ lệ chết có thể lên đến 100%

Trên thế giới bệnh viêm gan virus ở vịt đ2 gây nhiều thiệt hại cho đàn

vịt nuôi Năm 1949, ở Long Island (Mỹ), Levine và Fabricant đ2 phát hiện bệnh trên đàn vịt Bắc Kinh ở 70 trại vịt lớn Tổng số vịt con chết trong vụ dịch lên đến 750.000 con Sau đó bệnh được phát hiện trên khắp thế giới

ở Việt Nam, năm 1978 Trần Minh Châu và cộng sự đ2 ghi nhận có bệnh viêm gan virus ở vịt Sau đó phát hiện bệnh xảy ra ở nhiều địa phương gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ chăn nuôi vịt Năm 2001, các tác giả Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly cho biết: Qua điều tra 20 ổ dịch ở Hưng Yên, Hà Nội, Hà Tây, Tuyên Quang số vịt con chết vì bệnh này lên đến hàng chục nghìn con, tỷ lệ chết trong đàn từ 48,57% đến 90,00%, tập trung ở vịt con từ 2 - 5 ngày và dưới 3 tuần tuổi (Nguyễn Văn Cảm, 2001) [3]

Theo quyết định số 63/2005/QĐ-BNN ngày 13 tháng 10 năm 2005 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, bệnh viêm gan virus ở vịt được xếp vào danh mục các bệnh nguy hiểm của động vật

Ngày nay, chủ trương chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi nhằm tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất nông nghiệp được đông đảo nông dân hưởng ứng Xu hướng chăn nuôi thủy cầm thương phẩm với quy mô lớn ngày càng

được ưa chuộng ở các vùng đồng bằng do thời gian chăn nuôi ngắn, quay vòng vốn nhanh, hiệu quả kinh tế cao Ngoài những lợi ích kinh tế, việc chăn nuôi với quy mô tập trung cao lại tạo điều kiện cho bệnh viêm gan virus ở vịt càng

có cơ hội lây lan mạnh trên diện rộng và diễn biến phức tạp Trong khi đó các biện pháp dùng kháng sinh phòng bệnh này là không có hiệu quả

Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt hiện đang dùng được chế từ các chủng virus cường độc TT (Trần Minh Châu và cộng sự, 1985) [6] và từ chủng virus viêm gan vịt nhược độc TN của Asplin (Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, 1984) [9]

Xuất phát từ mức độ nguy hiểm, diễn biến ngày càng phức tạp của bệnh

và yêu cầu của thực tế sản xuất đang cần một loại vacxin phòng bệnh có hiệu

quả cao để chủ động phòng dịch bệnh nhằm góp phần khôi phục và nhân nhanh đàn thủy cầm ngay sau khi khống chế được dịch cúm gia cầm Từ năm

2000, bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý đ2 có chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược độc DH-EG-2000 có xuất xứ từ nước ngoài, những nghiên cứu bước đầu đ2 cho thấy tính ưu việt của chủng virus vacxin này Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc DH-EG-2000 và ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất"

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Kiểm tra các đặc tính sinh học của giống virus vacxin nhược độc viêm gan vịt DH- EG - 2000

- Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc DH- EG- 2000 trên phôi gà ấp 9 - 11 ngày tuổi

- Thử nghiệm vacxin để phòng chống bệnh cho đàn vịt nuôi ở nước ta 1.3 ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp cho các cơ quan chuyên môn đề ra các biện pháp phòng trị bệnh viêm gan vịt do virus đạt hiệu quả cao cho đàn vịt nuôi ở nước ta

- Làm cơ sở cho việc sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc DH- EG - 2000

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Bệnh viêm gan virus ở vịt

Bệnh viêm gan virus là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1- 6 tuần tuổi, mẫn cảm nhất là vịt con dưới 3 tuần tuổi Bệnh lây lan rất nhanh do 3 type virus khác nhau gây ra: virus viêm gan vịt type I, type II và type III, phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt type I Bệnh có biểu hiện bệnh tích đặc trưng: gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên gan

2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh

Bệnh viêm gan virus ở vịt (Duck virus Hepatitis-DVH) được Levine và Hofstad phát hiện lần đầu tiên vào mùa xuân năm 1945 tại Mỹ, nhưng chưa phân lập được mầm bệnh Đến mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricant đ2 theo dõi các trường hợp bệnh tương tự như năm 1945 trên đàn vịt trắng Bắc Kinh ở đảo Long (Hoa Kỳ) và thu thập được các thông tin như sau: Bệnh xảy ra

ở 70 trại vịt lớn, đầu tiên bệnh xảy ra ở đàn vịt 2-3 tuần tuổi sau đó tấn công vào

đàn vịt ít tuần tuổi hơn rồi đến vịt dưới 1 tuần tuổi Tỷ lệ chết ở những trại nhiễm bệnh nặng có khi lên tới 95% ước tính vịt chết trong trận dịch đó là khoảng 750.000 con chiếm 15% tổng đàn (Woolcock và Fabricant, 1997) [41] Năm 1950, Levine và Fabricant đ2 phân lập được virus viêm gan vịt type

I trên môi trường tế bào xơ phôi gà, virus này khác hẳn với virus dịch tả vịt (Levine và Fabricant, 1950) [26]

Đến năm 1956, Hanson và Alberts đ2 phát hiện ở bang Massachuset, Illinois, Michigan và xảy ra khắp nước Mỹ (Woolcock và Fabricant, 1997) [41] Năm 1958, Asplin đ2 chế được vacxin nhược độc phòng được bệnh cho vịt con Từ năm 1960, trên thế giới đ2 có vacxin phòng bệnh này, đặc biệt là

vacxin được chế từ chủng nhược độc Asplin (Asplin, 1958) [17]

Năm 1965, ở Norfolk - Anh đ2 xảy ra một ổ viêm gan virus ở vịt mặc dù

đàn đ2 tiêm phòng vacxin nhược độc type I Người ta đ2 phân lập được virus viêm gan vịt type II khác hẳn với virus viêm gan type I Virus type II chỉ gây bệnh ở Anh và đến giữa năm 1980 bệnh không còn xảy ra nữa (Woolcock và Fabricant, 1997) [41]

Năm 1968, Tempel và Beer cho rằng bệnh viêm gan vịt do virus type I đ2 xảy ra trên khắp thế giới trong đó có Trung Quốc và Hàn Quốc (Woolcock và Fabricant, 1997) [41]

Năm 1968, Toth đ2 quan sát thấy bệnh viêm gan xảy ra ở đàn vịt con đ2 được miễn dịch đối với viêm gan type I ông đ2 phân lập được loại virus có những đặc

điểm khác với virus type I và type II, ông đ2 đặt tên là virus viêm gan vịt type III Bệnh do virus này chỉ xảy ra ở Mỹ (Woolcock và Fabricant, 1997) [41]

Năm 1972-1974, một số tác giả như Friend, Trainer…đ2 tiến hành nghiên cứu về bệnh viêm gan virus ở vịt trời (Woolcock và Fabricant, 1997) [41]

Năm 1976-1988, các tác giả Hanson, Balla, Veress, Crighton, Woolcock

đ2 tiến hành nhiều nghiên cứu về việc tạo ra miễn dịch cho vịt con bằng các chủng vacxin nhược độc viêm gan vịt (Woolcock và Fabricant, 1997) [41] Năm 1991, Woolcock đ2 nghiên cứu vacxin virus type I vô hoạt dùng cho vịt đẻ Còn Zhao, Philips, Li và Zhong đ2 nghiên cứu về việc phát hiện kháng thể viêm gan vịt do virus bằng phương pháp ELISA (Woolcock và Fabricant, 1997) [41]

Cho đến nay, bệnh viêm gan do virus type I ở vịt đ2 phân bố rộng r2i trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam

ở Việt Nam, năm 1978 Trần Minh Châu đ2 nghi có bệnh viêm gan vịt do virus nhưng chưa phân lập được virus (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985) [5] Từ năm 1979 đến năm 1983, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương và làm chết nhiều vịt như: năm 1979-1980 dịch lớn xảy ra ở Đông Anh – Hà Nội (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985) [5], năm 1983 dịch xảy ra ở Gia Lâm – Hà Nội đ2 làm chết hàng ngàn vịt (Lê Thanh Hoà, 1984 ) [9]

Sáu tháng đầu năm 2001, Công ty cổ phần Dược và Vật tư thú y đ2 điều tra một số ổ dịch ở Từ Liêm, Đông Anh (Hà Nội), Hà Tây, Hà Nam và Tuyên Quang và kết luận là có 5032 vịt con bị bệnh, trong đó số vịt chết chiếm tới 73% (3311 con) (Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn Đức Lưu, Trần Thu Hiền, Nguyễn Khánh Ly, 2001) [15]

Theo Lê Văn Tạo (2001), tháng 3 năm 2001 tại Nông Cống (Thanh Hoá) xảy ra bệnh viêm gan virus ở vịt có tỷ lệ chết cao, xoá sổ nhiều đàn vịt, chỉ trong 5 ngày có đàn chết không còn con nào (Cục Thú y, 2002) [8]

Theo Phạm Minh Đạo (2001): một vài năm gần đây bệnh này đ2 xuất hiện tại Nam Định Tháng 5-2001, một ổ dịch lớn xảy ra ở x2 Hồng Giang, huyện Nam Trực Đàn vịt 10000 con mới nở đ2 mắc bệnh và đến 5 ngày tuổi chết 7000 con, những ngày sau số chết giảm dần nhưng tổng số chết chiếm 80% tổng đàn (Cục Thú y, 2002) [8]

B¶ng 2.1 T×nh h×nh bÖnh viªm gan vÞt ë mét sè n−íc Ch©u ¸

bã tay, ng−êi n«ng d©n hoang mang, lo ng¹i, nhiÒu hé ch¨n nu«i bÞ ph¸ s¶n (Côc Thó y, 2002) [8]

Theo thèng kª míi nhÊt cña OIE, ViÖt Nam lµ mét trong nh÷ng n−íc bÞ bÖnh viªm gan vÞt g©y thiÖt h¹i nÆng nÒ nhÊt (B¶ng 2.1) N¨m 1997, bÖnh ®2 lµm chÕt

24 073 trong tæng sè 32 784 vÞt N¨m 2001, cã 10 276 vÞt chÕt v× bÖnh viªm gan trong tæng sè 68 995 vÞt (OIE, 2006) [31]

2.1.2 TruyÒn nhiÔm häc

2.1.2.1 Loµi m¾c bÖnh

Trong tù nhiªn, bÖnh viªm gan vÞt do virus type I g©y ra chØ x¶y ra ë vÞt

con (Nguyễn Xuân Bình, 1995) [2] ở những đàn vịt bị bệnh, tỷ lệ nhiễm bệnh 100%, tỷ lệ vịt chết tuỳ theo lứa tuổi: vịt dưới 1 tuần tuổi chết 95%; 1 - 3 tuần tuổi chết ít hơn: 50%; 4 - 5 tuần tuổi tỷ lệ chết không đáng kể Vịt trưởng thành bị nhiễm virus không có triệu chứng lâm sàng, không ảnh hưởng đến sản lượng trứng Gà, gà tây và các động vật khác không mắc bệnh Gia cầm non một vài ngày hay vài tuần tuổi vẫn có thể bị nhiễm bệnh, con vật có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích và có kháng thể trung hoà trong máu Asplin (1961) [18] cho biết gà con có thể bị nhiễm bệnh, bệnh thể hiện không điển hình và có thể truyền virus cho con khác

Trong phòng thí nghiệm, dùng virus viêm gan vịt type I gây bệnh cho vịt con bằng cách cho uống hoặc tiêm phúc mạc, vịt có bệnh tích: gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên gan, túi mật sưng, lách sưng và có thể phân lập được virus

từ gan 17 ngày sau khi cho uống

Các loài vật khác như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng, chó đều không cảm thụ với bệnh

Trong tự nhiên và trong phòng thí nghiệm, virus viêm gan vịt type II, type III chỉ gây bệnh cho vịt con

2.1.2.2 Đường xâm nhập và cách lây lan

Trong đàn vịt con bị bệnh, virus viêm gan vịt type I lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao 100% Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp hoặc qua vết thương

Priz (1973) [32] đ2 gây bệnh cho vịt con bằng đường lây nhiễm qua không khí Trong các trường hợp gây bệnh này, virus xâm nhập vào cơ thể qua thanh quản và đường hô hấp trên Ngoài ra có thể gây bệnh cho vịt bằng cách cho uống Những vịt chưa bị nhiễm virus, cho sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít ngày

Bệnh không truyền lây qua trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958) [17]

Theo Asplin (1961) [18] các loài chim hoang d2 mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, đây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa, chuột cống nâu có thể là vật chủ dự trữ của virus viêm gan vịt type I ở loại động vật này virus được thu nhận vào cơ thể, tồn tại 35 ngày, sau đó được bài tiết ra bên ngoài trong khoảng thời gian 18 - 22 ngày sau khi nhiễm Trong huyết thanh của chuột có kháng thể và kháng thể tồn tại 12 -

24 ngày ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất ra ngoài theo phân sau 8 tuần (Reuss, 1959) [34]

Virus viêm gan vịt type II xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá và

đường lỗ huyệt ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất theo phân ít nhất 1 tuần sau khi nhiễm bệnh

2.1.2.3 Cơ chế sinh học

Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hoá, hô hấp hoặc vết thương rồi vào máu Theo máu, virus đến các cơ quan phủ tạng đặc biệt là gan, cơ quan thích hợp nhất đối với virus ở giai đoạn đầu do tác dụng của virus, trao đổi chất ở gan bị rối loạn Các kiểm tra tổ chức học cho thấy lượng glycogen trong gan giảm thấp nhưng ngược lại lượng lipit lại tăng cao do trao

đổi mỡ ở gan, đặc biệt là trao đổi cholesterol bị đình trệ Vì vậy vịt con ở thời

kỳ sau bào thai thiếu năng lượng nên sức đề kháng giảm sút ở giai đoạn hai virus trực tiếp phá hoại tế bào gan Tế bào nội mô huyết quản bị phá hoại, gây xuất huyết đặc trưng

Virus sinh sản trong tế bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kuffer Khi kiểm tra thấy tổ chức gan bị phá hoại, cơ thể không

được giải độc làm con vật chết do ngộ độc

2.1.3 Triệu chứng, bệnh tích

2.1.3.1 Triệu chứng

Thời kỳ nung bệnh từ 1-5 ngày, đôi khi kéo dài 8 ngày thậm chí 13 ngày Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào độc lực của virus, liều lượng tiêm và phương pháp gây bệnh cũng như tình trạng cơ thể

Vịt con có thể mắc bệnh và chết vào ngày đầu tiên sau khi nở Bệnh xuất hiện bất ngờ, vịt ít vận động, buồn ngủ, cánh s2, bỏ ăn Một số trường hợp bị

ỉa chảy, phân lo2ng, triệu chứng này không phải xuất hiện ở tất cả vịt

Một, hai giờ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên thấy có chứng xanh tím niêm mạc, rối loạn vận động, co giật Con vật thường chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt, nghiêng sườn và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang bên sườn và vịt con thường chết ở tư thế này Đây là một trong những dấu hiệu đặc trưng của bệnh (Nguyễn Phục Hưng, 2004) [10] Bệnh kéo dài 2-3 ngày và đôi khi dài hơn Vịt ốm có triệu chứng rất ít khi khỏi, phần lớn là chết, còn những con ốm không có triệu chứng lâm sàng sau khi khỏi bệnh sẽ hình thành kháng thể trong máu

Bệnh viêm gan vịt truyền nhiễm do virus có tỷ lệ chết biến động từ vài phần trăm đến 90% (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [13]

2.1.3.2 Bệnh tích

* Bệnh tích đại thể

Bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ Trong một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin Bề mặt loang lổ do có nhiều xuất huyết, kích thước và hình dạng khác nhau Xuất huyết lan rộng không có ranh giới Sự xuất huyết gan không phải có ở tất cả vịt chết do bệnh viêm gan virus Sự xuất huyết ở gan rõ rệt nhất khi nhỏ bệnh phẩm vào niêm mạc mũi Khi tiêm vào phúc mạc, các cơ quan khác ít bị tổn thương và càng ít hơn khi gây ra bệnh qua đường miệng Trong gan có thể gặp

các ổ hoại tử do bệnh viêm gan bị biến chứng sang bệnh phó thương hàn Lách

có thể sưng, thận tụ máu

Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly đ2 mổ khám

751 cá thể vịt chết trong các ổ dịch tự nhiên thấy bệnh tích ở gan biểu hiện ở trong 691 con (92,01%), ở thận 141 con (18,77%), ở lách 97 con (12,91%) (Nguyễn Đức Lưu, 2002) [12]

* Bệnh tích vi thể

Những biến đổi vi thể trong viêm gan virus ở vịt con chủ yếu thấy ở gan và

đại n2o Trong gan có những đám tế bào bị hoại tử, tăng sinh ống mật và xung quanh mạch, lúc đầu là những bạch cầu hạt sau đó là tế bào lympho và các tương bào ở một nửa số vịt con thấy các bệnh tích viêm tăng sinh quanh mạch và viêm tăng sinh mô thần kinh đệm Sự tổn thương của tế bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan virus giống những tổn thương như ở viêm gan của người

Bệnh tích trong n2o vịt chết do viêm gan giống viêm n2o thể thanh dịch Trong các tế bào gan cũng như các tế bào của hệ thống lưới nội mô có thể chứa các tiểu thể bao hàm Với phương pháp nhuộm giemsa, hematoxylin- eosin các thể bao hàm có kích thước từ 1-3àm, hình tròn hoặc hình bầu dục

Nguyễn Văn Cảm và cộng sự (2001) [3] khi nghiên cứu bệnh tích vi thể của 180 cá thể phát hiện thấy tất cả gan của vịt bệnh đều bị viêm, xuất huyết hoại tử (100%) ở các mức độ khác nhau Gan thoái hoá mỡ 84 con (46,66%), tăng sinh các tế bào biểu mô ống mật Gặp nhiều bạch cầu đơn nhân ở quanh ống mật hoặc tập trung từng đám trong nhu mô gan, hồng cầu thoát ra ngoài mạch quản lan tràn, tỷ lệ đến 100%

* Bệnh tích siêu vi thể

Gây bệnh viêm gan virus cho vịt 6 ngày tuổi bằng nhỏ mũi hay tiêm bắp Tiến hành mổ khám sau 14-24 giờ và lấy gan làm tiêu bản siêu vi thể kiểm tra

dưới kính hiển vi điện tử Kết quả là sau 1 giờ có hiện tượng vỡ glycogen trong tế bào gan và quan sát thấy những hạt có đường kính 100-300nm, các tế bào hoại tử sau 12 giờ nhiễm Các hạt virus được tìm thấy sau 1 giờ và 18 đến 24 giờ gây bệnh Adamiker đ2 kiểm tra lách và cơ của vịt nhiễm virus viêm gan vịt type I dưới kính hiển vi điện tử, quan sát thấy lách có sự biến đổi nhân trong tương bào,

tế bào cơ chỉ có biến đổi nhẹ (Adamiker, 1970) [16]

2.1.4 Chẩn đoán

Để chẩn đoán sơ bộ bệnh viêm gan vịt do virus và có biện pháp xử lý kịp thời tại cơ sở chăn nuôi, người ta dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và diễn biến bệnh lý Tuy nhiên trong nhiều trường hợp diễn biến bệnh phức tạp nên việc chẩn đoán còn dựa vào kết quả của các kỹ thuật chẩn đoán 2.1.4.1 Chẩn đoán phân biệt

Chẩn đoán phân biệt là phương pháp dựa vào dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh để phân biệt với các bệnh khác Cần phải chẩn

đoán phân biệt bệnh viêm gan virus vịt với các bệnh sau:

Bệnh dịch tả vịt (Duck plague): Vịt mắc bệnh viêm gan virus thường dễ nhầm với bệnh dịch tả, vì vậy trước tiên cần phân biệt hai bệnh này Bệnh dịch tả vịt thường xảy ra ở mọi lứa tuổi với các triệu chứng điển hình như : sưng

đầu, đau mắt, liệt chân, liệt cánh, đặc biệt là có hiện tượng đi ngoài phân trắng Mổ khám thấy hiện tượng viêm xuất huyết đường ruột

Bệnh phó thương hàn vịt (Duck Salmonellosis): Vịt mắc bệnh phó thương hàn do Salmonella thường có biểu hiện gầy, đi ngoài phân trắng, vịt đẻ giảm, vỏ trứng mỏng dễ vỡ Quan sát bệnh tích thấy chưa tiêu hết lòng đỏ trứng ở vịt con, Dịch hoàn, trứng non teo và dị hình Vi khuẩn salmonella có thể nuôi cấy phân lập được trong phòng thí nghiệm trên các môi trường thạch thông thường, và bệnh có thể điều trị bằng kháng sinh

Chứng nhiễm độc aflatoxin: Chứng nhiễm độc aflatoxin có bệnh tích

gần giống với bệnh viêm gan virus ở vịt nhưng đặc biệt không có hiện tượng lây lan trong đàn Bệnh tích chủ yếu là: xoang bụng và xoang bao tim tích nước, gan sưng có màu nhợt nhạt, thận và lách xuất huyết Kiểm tra tổ chức học thấy tổ chức nhu mô gan và thận bị phá huỷ nghiêm trọng

2.1.4.2 Phương pháp phân lập xác định mầm bệnh

Virus có thể được phân lập bằng nhiều cách như :

- Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm gan hoặc máu của vịt nhiễm bệnh vào xoang niệu mô của phôi gà 8-10 ngày tuổi Sau 5-8 ngày phôi chết với các bệnh tích: phôi còi cọc, da xuất huyết và phù, gan sưng hơi xanh với các ổ hoại tử Tiêm truyền lần sau, tỷ lệ phôi chết có bệnh tích điển hình tăng

- Tiêm truyền phôi vịt 10-14 ngày tuổi (có nguồn gốc từ đàn vịt đẻ mẫn cảm) thích hợp hơn tiêm vào phôi gà, tỷ lệ chết phôi và bệnh tích ở phôi xuất hiện sớm hơn so với phôi gà

- Tiêm bắp hoặc dưới da huyễn dịch bệnh phẩm cho vịt con 1-7 ngày tuổi (phương pháp này dễ thành công hơn) Sau 17 đến 18 giờ, vịt có biểu hiện triệu chứng lâm sàng và chết với bệnh tích điển hình Vịt con thường chết tập trung vào ngày thứ 2 đến thứ 4 sau khi gây nhiễm

Để chẩn đoán nhanh, chính xác bệnh viêm gan virus vịt có thể sử dụng

kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp trên tiêu bản gan

Ngoài ra còn phương pháp nuôi cấy virus trên môi trường tế bào một lớp gan phôi vịt, virus gây ra hiện tượng co tròn và hoại tử tế bào

2.1.4.3 Phương pháp huyết thanh học

Các phản ứng huyết thanh không được sử dụng trong việc chẩn đoán các ổ bệnh cấp tính Tuy nhiên, ngay từ thời gian đầu tìm ra virus, Levine và Fabricant (1950) [26] đ2 dùng phản ứng trung hoà cho mục đích khác nhau như: giám định

virus, đánh giá miễn dịch đối với vacxin và điều tra về dịch tễ học

Thông thường các phản ứng xét nghiệm thường dùng là phản ứng trung hoà trên phôi gà, phôi vịt hay ở vịt con Nhưng theo báo cáo của Malinovskaya thì phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) nhạy hơn phản ứng trung hoà (Woolcock và Fabricant, 1997) [41]

* Tạo miễn dịch với virus viêm gan vịt cho vịt con bằng cách tạo cho chúng có khả năng chống lại bệnh viêm gan virus như:

- Tiêm huyết thanh miễn dịch

- Tiêm lòng đỏ trứng của đàn vịt đẻ đ2 gây tối miễn dịch

- Tạo miễn dịch cho đàn vịt đẻ đảm bảo đạt mức kháng thể cao rồi truyền cho vịt con qua lòng đỏ trứng

Việc tạo miễn dịch chủ động ở vịt con nhờ tiêm phòng bằng vacxin chế

từ chủng virus viêm gan vịt nhược độc Chủng virus viêm gan vịt type I nhược

độc thích hợp cho việc chế vacxin bằng cách tiêm truyền qua phôi gà hay phôi vịt Asplin làm mất khả năng gây bệnh của virus viêm gan vịt cho vịt con sau khi nuôi cấy virus qua phôi gà Một số tác giả khác cũng tiến hành thí nghiệm

và thu được một số chủng nhược độc của virus sau mỗi chuỗi tiêm truyền

Chủng virus viêm gan vịt tiêm truyền qua phôi gà tới thời gian thích hợp được

sử dụng thường xuyên như vacxin (Asplin, 1958) [17]

* Tiêm phòng cho vịt con

Có thể tiêm phòng cho vịt con vacxin viêm gan vịt nhược độc type I chế qua phôi gà bằng cách chủng màng chân, tiêm bắp, nhỏ mũi hay phun sương Thời gian xuất hiện kháng thể ở vịt con phụ thuộc vào đường đưa vacxin như: qua đường uống thì mất 6 ngày mới đạt giá trị bảo hộ, còn tiêm bắp thì chỉ mất 3 ngày

Thực tế cho thấy, việc dùng vacxin có hiệu quả hay không còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: kháng thể từ mẹ truyền sang, thời gian vịt con tiếp xúc với virus cường độc viêm gan vịt Nếu vịt con sinh ra không có miễn dịch thì cần tiêm phòng trong vòng 24 giờ đầu tiên, sau đó tiêm nhắc lại sau 4-7 ngày, mỗi lần tiêm là 0,5 ml kháng thể lòng đỏ hay kháng huyết thanh ở đàn vịt con mang kháng thể từ đàn vịt mẹ có miễn dịch sau khi nhiễm bệnh tự nhiên thì việc dùng vacxin đạt hiệu quả kém Còn đối với đàn vịt con đ2 tiếp xúc với virus cường độc sớm thì việc sử dụng vacxin là không có hiệu quả Vì vậy việc

áp dụng các biện pháp vệ sinh thú y thích hợp và tẩy uế chuồng trại sẽ góp phần rất quan trọng trong việc giải quyết căn bệnh này

2.1.5.2 Điều trị và khống chế bệnh

Đối với bệnh viêm gan virus ở vịt, để làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra,

có thể tiến hành một số biện pháp sau:

- Phát hiện bệnh sớm, can thiệp bằng cách tiêm huyết thanh miễn dịch hay kháng thể viêm gan vịt chế từ lòng đỏ trứng cho vịt Bệnh do virus viêm gan vịt type I gây ra, dùng huyết thanh miễn dịch của vịt khỏi bệnh type I hay dùng kháng thể viêm gan vịt type I chế từ lòng đỏ trứng tiêm cho vịt con với liều 0,5 ml cho một con

Hiện nay các nhà khoa học đ2 nghĩ tới việc dùng kháng thể phòng bệnh

và trị bệnh Tháng 8-2001, công ty HANVET chế tạo thành công kháng thể viêm gan vịt Liều phòng 0,5ml/con, liều điều trị 1ml/con, tiêm dưới da hoặc cho uống (Nguyễn Hữu Vũ và cộng sự, 2001) [15]

- Tiêm thẳng vacxin vào ổ dịch cũng có thể khống chế được bệnh viêm gan virus ở vịt Việc khống chế bệnh bằng cách này dựa trên cơ sở của hiện tượng cản nhiễm (Interference) trong miễn dịch chống virus của cơ thể sinh vật

2.2 Virus gây bệnh viêm gan vịt (Duck Hepatitis Virus = DHV)

2.2.1 Hình thái, kích thước, phân loại virus

Virus viêm gan vịt là những hạt virus (virion) có kích thước rất nhỏ, xuyên qua được màng lọc Beckefeld và Seitz (Levine và Fabricant, 1950) [26]; Theo Reuss (1959) [34] dưới kính hiển vi điện tử virus là những hạt tròn bề mặt xù xì, không có vỏ bọc, kích thước từ 20-40nm (ảnh 2.1)

¶nh 2.1 H×nh th¸i cÊu tróc virus viªm gan vÞt (Duck Hepatitis Virus)

¶nh 2.2 Ph«i vịt b×nh th−êng (a) và ph«i vịt xuÊt huyÕt

do bị g©y nhiÔm virus viªm gan vịt (b)

* Virus viêm gan vịt type I do Levine và Fabricant phân lập vào năm

1950 là một Enterovirus, nằm trong họ Picornaviridae, loại RNA, kích thước

20 - 40nm (Richter, 1964) [35], không có vỏ bọc ngoài, có 32 capsome

Virus không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của gà, vịt, cừu, ngựa, chuột lang, thỏ, lợn virus không ngưng kết hồng cầu khỉ khi thí nghiệm ở

pH 6,8 - 7,4 và nhiệt độ 40C; 240C; 370C

Trong tự nhiên kháng nguyên của virus viêm gan vịt type I không ổn

định, dễ bị biến dị (Shalaby, 1978) [38] Người ta đ2 phân lập được các type virus biến dị ở ấn độ, Nước ngoài và chứng minh sự biến dị của virus type I bằng phản ứng huyết thanh học Sandhu (1988) [37] cho biết vịt được miễn dịch với type I không đủ bảo hộ khi công cường độc bằng chủng virus biến dị

* Virus viêm gan vịt type II

Virus viêm gan vịt type II được Asplin xác định năm 1965, đây là một Astrovirus có tính kháng nguyên khác với Astrovirus của gà, gà tây (Asplin, 1965) [19] Virus có đường kính 28-30nm khi quan sát bằng kính biển vi điện tử

ở vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt type II, triệu chứng, bệnh tích giống như khi nhiễm virus viêm gan vịt type I

Nghiên cứu quá trình nuôi cấy cho thấy virus có thể nhân lên trên phôi vịt, khi gây nhiễm virus vào xoang niệu mô hay túi lòng đỏ, trên môi trường này virus nhân lên yếu hơn so với virus viêm gan vịt type I, cụ thể 6 - 10 ngày sau khi gây nhiễm mới phát hiện được sự nhiễm virus của phôi, phôi còi cọc, hoại tử gan

Trên phôi gà, sau nhiều lần cấy truyền mù qua xoang niệu mô, virus mới gây chết một số phôi ở thời điểm 7 ngày sau khi gây nhiễm Những phôi chết

có biểu hiện còi cọc, gan có hoại tử màu xanh

Trên môi trường nuôi cấy tế bào, virus không có khả năng nhân lên trên các loại tế bào của phôi gà, vịt

Virus viêm gan vịt type II mất khả năng gây bệnh ở nhiệt độ 500C trong

60 phút

* Virus viêm gan vịt type III

Virus viêm gan vịt type III được Toth phát hiện vào năm 1969 ở Mỹ (Toth, 1969) [39], virus là một Picornavirus, có tính kháng nguyên không quan hệ với virus viêm gan vịt type I, quan sát dưới kính hiển vi điện tử trên tế bào thận vịt nhiễm virus cho thấy: virus là loại RNA có đường kính 30nm trong tế bào chất Nghiên cứu quá trình nuôi cấy virus cho thấy:

Trên phôi vịt 9-10 ngày tuổi, sau khi gây nhiễm virus qua màng nhung niệu, 8-9 ngày sau mới có phôi chết, tỷ lệ phôi chết ở mức độ thấp Nếu cấy truyền virus nhiều lần qua phôi vịt, thời gian phôi chết sẽ sớm hơn Quan sát bệnh tích trên phôi cho thấy màng nhung niệu biến màu, dầy gấp 10 lần so với bình thường, phôi có bệnh tích còi cọc, phù, xuất huyết dưới da; gan, thận, lách sưng

Trên phôi gà, virus viêm gan vịt type III không có khả năng nhân lên ở môi trường tế bào thận, gan của phôi vịt hoặc của vịt con, virus có khả năng nhân lên, có thể dùng môi trường này để xác định virus

creolin 15%, naphthalysol, xylonaphtha hay anhydrous sodium carbonat 20%

Virus bị hoàn toàn vô hoạt bởi formaldehyde 1% hay NaOH 1% trong 2 giờ ở nhiệt độ 150C -200C; chloramin 3% trong thời gian 5 giờ; formalin 0,2% trong 2 giờ

ở 500C trong 1 giờ không ảnh hưởng đến chuẩn độ virus, nhưng phần lớn virus bị vô hoạt ở 560C sau 30 phút

ở nhiệt độ 370C, virus viêm gan vịt tồn tại 21 ngày Còn ở điều kiện môi trường tự nhiên virus tồn tại ít nhất 10 tuần trong các đàn bị nhiễm và hơn

37 ngày trong điều kiện chuồng mát và ẩm thấp, đặc biệt ở nhiệt độ -200C

Theo Reuss (1959) [34] virus mất độc lực trong các điều kiện nhiệt độ phòng từ 48 đến 96 giờ Trong tủ lạnh, sức hoạt động của virus tồn tại 120 giờ Làm lạnh đến -380C giữ được khả năng lây lan của virus trong 8 tháng hoặc lâu hơn Virus có sức đề kháng với tác dụng của 5000 UI Penicilin và 100mg Streptomyxin trên 1ml huyễn dịch trong 1 giờ (Lê Minh Chí, 1999) [7]

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy

2.2.3.1 Nuôi cấy trên phôi trứng

Virus viêm gan vịt có thể phát triển được trên cả phôi gà và phôi vịt Để gây bệnh, người ta dùng huyễn dịch các cơ quan của vịt con đ2 chết do bệnh viêm gan vịt (gan, phổi, thận…) đ2 được xử lý bằng kháng sinh rồi gây bệnh chủ yếu vào màng nhung niệu Tiêm bệnh phẩm vào màng nhung niệu, vào túi no2n hoàng cũng có hiệu quả như tiêm vào niệu nang (Reuss, 1959) [34]

Đối với phôi gà thường sử dụng phôi 9-10 ngày tuổi, tiêm virus vào xoang niệu mô, phôi thường chết sau 3-6 ngày, có một số trường hợp phôi gà

bị nhiễm bệnh còn sống Trong thiên nhiên có một số chủng độc có độc lực giảm, nó có thể không gây chết phôi ở những lần cấy truyền đầu tiên (Asplin, 1958) [17] ở phôi gà chết và bị giết từ 5-6 ngày sau khi gây nhiễm đ2 phát

hiện có xuất huyết nặng dưới da, phôi còi, phôi bị thuỷ thũng thành chất nhầy như gelatin Gan bào thai sưng, màu vàng-xanh lá cây hoặc màu xanh-đen, trên gan thường thấy các ổ hoại tử từng điểm hoặc từng vệt nhỏ xoắn lấy nhau hình thành từng đám như hình lưới hay có nhiều điểm xuất huyết loang lổ Khi gây bệnh bằng chủng có độc lực yếu có thể không quan sát thấy sự kìm h2m phát triển của phôi thai (Reuss, 1959) [34]

Nuôi cấy trên phôi gà liên tục trong 68 đời, hiệu giá virus duy trì ở mức

độ 10-4 đến 10-6 (Asplin, 1958) [17] Như vậy gây bệnh cho bào thai có thể

được sử dụng để chẩn đoán viêm gan do virus

Đối với phôi vịt, virus viêm gan vịt có thể sinh sản trên phôi vịt từ 12 đến

20 ngày tuổi (Reuss, 1959) [34] Phôi vịt càng non bao nhiêu càng ít sức đề kháng bấy nhiêu Ví dụ, phôi vịt 12 đến 14 ngày tuổi chết 100%, trong khi đó phôi từ 18 đến 22 ngày tuổi phần lớn còn sống Những bệnh tích trên phôi vịt giống với bệnh tích khi cấy truyền trên phôi gà

ở phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước ối có màu xanh và gan bị xanh-đen, những bệnh tích này ít thấy ở phôi gà (Nguyễn Đức Lưu, 2001) [11]

2.2.3.2 Nuôi cấy trên môi trường tổ chức tế bào

Sau khi gây nhiễm thấy hàm lượng virus tăng dần và sau một vài lần hoặc nhiều lần cấy truyền trên tế bào thì thấy virus huỷ hoại tế bào (CPE: Cytopathogen effect) với biểu hiện nhân bị co tròn, nguyên sinh chất đặc lại tạo không bào, tế bào vỡ ra rồi chết Căn cứ vào đó ta có thể đánh giá hiệu giá virus Năm 1963 Fitzgerald đ2 sử dụng tế bào thận của phôi vịt để nuôi cấy virus và ông đ2 chứng minh rằng virus có thể phát triển và gây huỷ hoại tế bào sau 8 lần cấy truyền Các tác giả cho rằng virus viêm gan vịt phát triển theo mô hình đường cong trên môi trường tế bào thận phôi vịt Với virus cấy truyền lần thứ 25 trên tế bào thận phôi vịt không còn khả năng gây huỷ hoại tế bào

trên tế bào thận phôi gà Năm 1968, Maiboroda và Kontrimacachus đ2 nuôi cấy và quan sát được sự phá hủy tế bào thận ở phôi ngỗng Năm 1972 Maiboroda và cộng sự đ2 theo dõi sự phát triển của virus viêm gan vịt trên tế bào thận phôi vịt một lớp với kỹ thuật kháng thể huỳnh quang thấy virus gây biến đổi bệnh tích tế bào, hàm lượng virus cao nhất sau 2 ngày (Maiboroda,1972) [27] Kurilenco và Strelnikov cũng đưa ra kết quả tương tự

ở tế bào thận lợn con (woolcock và Fabricant, 1997) [41]

2.2.3.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ

Virus viêm gan vịt chỉ có thể phát triển tốt trên vịt con dưới 7 ngày tuổi Dùng huyễn dịch bệnh phẩm chứa virus viêm gan vịt đem tiêm dưới da, tiêm bắp, cho uống hoặc nhỏ mũi cho vịt Sau 2- 4 ngày nung bệnh, vịt có biểu hiện

đặc trưng: con vật mệt mỏi nghiêm trọng, nằm một chỗ, đầu ngoẹo ra đằng sau hay về một bên, co giật toàn thân rồi chết Khi mổ khám quan sát bệnh tích đặc trưng ở gan thấy: gan sưng nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ, trên mặt gan có những điểm xuất huyết, đôi khi có những điểm hoại tử màu trắng xen kẽ Quan sát những biến đổi vi thể trên gan thấy tổ chức gan bị viêm tụ máu, tăng sinh ống mật, các mạch máu bị sưng, các tế bào gan bị tích mỡ Một số trường hợp trong nguyên sinh tế bào gan xuất hiện những thể bao hàm Ngoài ra lách

có thể hơi sưng

2.3 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt

Miễn dịch là khả năng nhận ra và loại các vật lạ ra khỏi cơ thể (Vũ Triệu

An, 1997) [1], (Đặng Đức Trạch, 1984) [14], để có được khả năng này, cơ thể phải nhờ đến hệ thống miễn dịch

Theo OIE (2000) [30] khi đưa vacxin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần

đầu hay lần thứ hai, thứ ba, Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2-3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm Sử dụng vacxin lần đầu đáp ứng miễn dịch được gọi là sơ cấp hay tiên phát Sử dụng vacxin lần hai đáp ứng miễn dịch gọi là thứ cấp hay thứ phát Trong đáp ứng miễn dịch thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm hơn

Sự khác biệt của đáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp là do vai trò của các tế bào nhớ miễn dịch Trong đáp ứng miễn dịch thứ cấp, các tế bào này phát triển nhanh và mạnh, tạo ra một lớp tế bào sản xuất kháng thể nhanh và nhiều hơn nên kháng thể xuất hiện sớm, hàm lượng nhiều hơn rõ rệt Nếu cách lần dùng vacxin đầu 3-4 tuần, sử dụng tiếp lần thứ hai thì đáp ứng miễn dịch

sẽ nhanh hơn, mạnh hơn, có thể gấp hàng trăm lần và thời gian miễn dịch dài hơn Đây là cơ sở khoa học cho việc tiêm phòng vacxin nhắc lại tạo mức độ miễn dịch cao cho cơ thể

Khi kiểm tra hàm lượng kháng thể trong cơ thể đ2 sử dụng vacxin kết hợp với phương pháp công cường độc, người ta nhận thấy rằng không phải kháng thể cứ xuất hiện trong máu là con vật được bảo vệ khỏi sự tấn công của mầm bệnh cường độc mà lượng kháng thể phải đạt đến một trị số nhất định thì cơ thể mới có mức độ miễn dịch bảo vệ Trị số kháng thể này được gọi là ngưỡng bảo hộ Hàm lượng kháng thể càng cao hơn ngưỡng bảo hộ thì mức độ miễn dịch của cơ thể càng cao và ngược lại

Mỗi loại vacxin khi đưa vào cơ thể sẽ gây ra đáp ứng miễn dịch và trạng thái miễn dịch ở động vật được duy trì một thời gian nhất định gọi là độ dài miễn dịch Tùy từng loại vacxin mà thời gian này dài ngắn khác nhau, khi hết thời gian đó cơ thể không còn khả năng chống lại mầm bệnh nữa, vì vậy người

ta phải tiến hành tái chủng

Như vậy để duy trì đáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng miễn dịch,

cứ khoảng một thời gian nhất định nên tái chủng vacxin một lần cho động vật tùy theo loại vacxin, tùy theo loài động vật và tình hình dịch tễ

Vacxin vô hoạt, nhất là vacxin vi khuẩn thường có thời gian miễn dịch ngắn, 3-9 tháng Vacxin nhược độc, nhất là các vacxin virus thường cho đáp ứng miễn dịch mạnh, ổn định và thời gian miễn dịch kéo dài, có thể được một năm, thậm chí suốt đời

Cũng như nhiều bệnh truyền nhiễm khác, miễn dịch chống bệnh viêm gan virus của vịt gồm miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động

Miễn dịch thụ động

ở gia cầm non, hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện, vì vậy ngay từ lúc sơ sinh, cơ thể của chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại tác nhân gây bệnh một cách chủ động và đặc hiệu Trạng thái miễn dịch đặc hiệu có thể có được khi cơ thể gia cầm mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể

đặc hiệu cho con non qua lòng đỏ trứng

Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch bị động ở vịt con nhận được từ mẹ

được nhiều tác giả nghiên cứu Asplin (1958) [17] dùng virus viêm gan vịt type I nhược độc qua phôi gà, tiêm bắp cho vịt giống vào thời điểm 2-4 tuần trước khi lấy trứng đem ấp đ2 tạo được miễn dịch thụ động cho vịt con Reuss (1959) [34] cho biết tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo được kháng thể thụ

động cho đàn vịt con Rispens (1969) [36] khuyến cáo người chăn nuôi nên tiêm cho đàn vịt giống 2 liều vacxin cách nhau ít nhất 6 tuần Vịt mẹ có khả năng truyền kháng thể thụ động cho vịt con trong khoảng thời gian 9 tháng sau lần tiêm vacxin thứ hai

Golubnichi (1984) [23] cho biết hàm lượng kháng thể ở vịt mẹ phải đạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động hoặc 1/32 trong phản ứng trung hoà mới có thể bảo hộ cho vịt con với bệnh

Theo OIE (2000) [30] nếu dùng vacxin viêm gan vịt nhược độc type I tiêm cho vịt mẹ vào các thời điểm 12 - 8 - 4 tuần trước khi đẻ sẽ tạo được miễn dịch cơ sở, sau đó tiêm bắp vacxin vô hoạt sẽ tạo được miễn dịch thụ

động cho vịt con

Miễn dịch thụ động ở vịt con với bệnh viêm gan vịt còn được tạo ra bằng cách dùng huyết thanh miễn dịch của vịt khỏi bệnh hoặc kháng thể từ lòng đỏ tiêm cho vịt con Rispens (1969) [36] cho biết có thể tạo miễn dịch thụ động cho vịt con bằng cách tiêm kháng thể thụ động chế từ lòng đỏ trứng của vịt đ2

được gây miễn dịch Quy trình này sau được cải tiến dùng virus cường độc viêm gan vịt typ I gây tối miễn dịch cho gà rồi thu trứng, chế kháng thể từ lòng đỏ (OIE, 2000) [30]

ở khu vực có mặt virus viêm gan vịt type I, type III, để tạo miễn dịch thụ

động cho vịt con nên dùng vacxin nhược độc viêm gan vịt type I từ hai đến ba lần vào các thời điểm 12 - 8 - 4 tuần trước khi vịt đẻ và dùng vacxin viêm gan vịt nhược độc type III hai lần vào thời điểm 12 - 4 tuần trước khi đẻ sẽ tạo

được miễn dịch thụ động cho vịt con với virus viêm gan vịt type I, III

Với vacxin viêm gan vịt type II, chưa một tài liệu nào nói về sử dụng vacxin cho đàn vịt giống đạt hiệu quả

trọng Theo Asplin (1961) [18] trong huyết thanh của vịt khỏi bệnh có kháng thể trung hoà Davis (1987) [21] cho biết: ở vịt 2 ngày tuổi kháng thể trung hoà xuất hiện 4 ngày sau khi tiêm vacxin nhược độc viêm gan vịt type I Malinovskaya bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động khi nghiên cứu

đáp ứng miễn dịch với virus viêm gan vịt type I của vịt giống và vịt con 7 ngày tuổi, cho biết: trong kháng thể dịch thể, kháng thể 7S nhiều hơn kháng thể 19S (7S thì mẫn cảm với Cystein, 19S kháng Cystein) (Malinovskaya,1982) [28] Theo Gough và Spackman (1981) [24] có thể tạo được miễn dịch ở vịt con sau khi dùng cho đàn vịt giống 3 lần vacxin vô hoạt nhũ dầu

2.4 Một số hiểu biết về vacxin phòng bệnh viêm gan vịt

Theo Hwang (1956) [25] các chủng virus viêm gan vịt cường độc sau khi

đ2 cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng gây bệnh cho vịt con nhưng virus vẫn nhân lên trong tế bào các mô, so với chủng virus viêm gan vịt cường

độc thì mức độ nhân lên của virus này là thấp hơn

Trên cơ sở nghiên cứu này nhiều chủng virus viêm gan vịt nhược độc ra

đời bằng phương pháp giảm độc trên phôi: Asplin tạo ra chủng TN sau khi đ2 giảm độc virus qua cấy truyền trên phôi gà Theo ông, virus viêm gan vịt giảm

độc sau khi cấy truyền trên phôi gà từ đời thứ 23 (Asplin, 1958) [17]

Hiện nay vacxin viêm gan vịt nhược độc type I loại dùng chủ yếu ở châu

Âu được giảm độc sau 53-55 lần truyền đời qua phôi gà, ở Mỹ loại giảm độc sau 84- 89 lần cấy truyền Vacxin nhược độc viêm gan vịt type I được sản xuất trên phôi gà 8-10 ngày tuổi, vị trí tiêm xoang niệu mô, nuôi cấy ở nhiệt độ

370C Sau khi tiêm phần lớn phôi chết trong vòng 2-3 ngày với bệnh tích gây

ra trên phôi: phôi còi cọc, phù phôi, xuất huyết trên da, gan sưng, xuất huyết Sau 3-5 ngày thu vacxin, thời điểm này lượng virus đạt số lượng cao nhất Phôi chết trước thời điểm 24 giờ loại bỏ Vacxin bảo quản ở nhiệt độ -700C trong vài năm

Quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt nhược độc type III giống như virus nhược độc viêm gan vịt type I, loại vacxin này không dùng trong sản xuất, chỉ sử dụng cho vịt con trong điều kiện phòng thí nghiệm

Vacxin viêm gan vịt nhược độc type III được giảm độc khi cấy truyền

30 lần trên màng nhung liệu của phôi vịt Vacxin được sản xuất trên phôi vịt

10 ngày tuổi, vị trí tiêm màng nhung niệu, nuôi cấy ở nhiệt độ 370C Sau khi tiêm phôi chết trong vòng từ 6-10 ngày với bệnh tích của virus gây ra trên phôi Thu nước và màng nhung liệu, bảo quản ở nhiệt độ - 700C trong vài năm Nghiên cứu đường đưa vacxin vào cơ thể, Asplin (1961) [18] cho biết phương pháp cho uống, tiêm dưới da, tiêm bắp với vacxin nhược độc viêm gan vịt type I đều tạo được miễn dịch tốt

Theo OIE (2000) [30], có thể đưa vacxin nhược độc viêm gan vịt type II vào cơ thể bằng đường cho uống, tiêm dưới da, tiêm bắp Còn virus viêm gan vịt type III nên đưa vào cơ thể bằng đường tiêm dưới da sẽ tạo được đáp ứng miễn dịch cao cho đàn vịt

Vacxin viêm gan vịt được giảm độc trên phôi gà khi sử dụng cho vịt rất

an toàn, độc lực của chủng virus vacxin ổn định và không trở lại độc lực với vịt mẫn cảm

Nghiên cứu hiệu lực của vacxin viêm gan vịt nhược độc trên phôi, các tác giả cho biết vacxin có khả năng tạo miễn dịch tốt Vịt con mới nở được tiêm vacxin viêm gan vịt type I, sau 48 đến 72 giờ có miễn dịch, miễn dịch kéo dài trong suốt thời gian vịt mẫn cảm với bệnh (Crighton, 1978) [20]

Chưa có tài liệu nào nói về dùng vacxin viêm gan vịt nhược độc type III cho vịt con một ngày tuổi

Vacxin viêm gan vịt nhược độc có khả năng tạo miễn dịch cao cho đàn vịt khi sử dụng phương pháp tiêm nhắc lại Theo Reuss (1959) [34]; OIE (2000) [30] muốn tạo được miễn dịch cao cho đàn vịt giống để truyền kháng thể bị động cho vịt con phải tiêm vacxin nhắc lại Với vacxin type I: tiêm 2

đến 3 lần vào các thời điểm 12-8-4 tuần trước khi đẻ Sau khi đẻ, 3 tháng một lần tiêm nhắc lại.Với vacxin type III: tiêm 2 lần vào các thời điểm 12- 4 tuần trước khi đẻ, sau khi đẻ 6 tháng tiêm nhắc lại 1 lần

Sử dụng vacxin viêm gan vịt nhược độc kết hợp với vacxin vô hoạt cũng tạo được miễn dịch cao ở đàn vịt giống Tiêm vacxin viêm gan vịt nhược độc type I, sau đó tiêm bắp một lần vacxin vô hoạt cho vịt sẽ tạo miễn dịch thụ

động tốt ở đàn vịt con trong suốt chu kỳ đẻ trứng của vịt mẹ

2.4.2 Vacxin vô hoạt

Trong quá trình nghiên cứu vacxin phòng bệnh viêm gan vịt, ngoài vacxin nhược độc còn có vacxin vô hoạt Theo Woolcock (1991) [40], vacxin viêm gan vịt vô hoạt được sản xuất từ virus viêm gan vịt type I Virus được nuôi cấy trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng BEL (Binary Ethylenmine), dùng bổ trợ dạng nhũ dầu LE- STM (Lipid Emulsion System- Salmonella typhimurium) và có lympho B phân bào Bảo quản ở 40C trong thời gian 20 tháng vẫn giữ được hiệu lực của vacxin

Nghiên cứu hiệu lực của vacxin viêm gan vịt vô hoạt, các tác giả đều cho biết vacxin có khả năng tạo miễn dịch cao cho đàn vịt Theo Gough (1981) [24]

sử dụng 3 lần vacxin viêm gan vịt type I vô hoạt nhũ dầu chế từ virus nuôi cấy trên phôi gà cho đàn vịt giống sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho đàn vịt con Theo tác giả dùng vacxin viêm gan vịt nhược độc cho vịt lúc 2 đến 3 ngày tuổi

và vào thời điểm 22 tuần tuổi tiêm lại bằng vacxin vô hoạt sẽ tạo được lượng kháng thể trung hoà cao hơn khi sử dụng 3 lần vacxin vô hoạt

2.4.3 Vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam

Năm 1983, Trần Minh Châu và cộng sự đ2 phân lập được chủng virus viêm gan vịt cường độc ở trại vịt Phú Xuyên – Hà Sơn Bình (chủng TT) Các tác giả làm giảm độc virus bằng cách cấy truyền 39 đời trên phôi gà và tạo

được chủng virus nhược độc (chủng VN) có lg ELD50/0,2ml là 4 – 5 (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985) [5]

Năm 1985, các tác giả Trần Minh Châu, Lê Thị Nồng, Nguyễn Đức Tạo

đ2 xây dựng quy trình sản xuất vacxin từ 3 chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược độc: TN (Hungari), E52 (Pháp) và VN (Việt Nam) Các tác giả cho biết cả 3 chủng virus vacxin đều an toàn và có hiệu lực khi sử dụng Khi tạo miễn dịch cho vịt con rồi thử thách với cường độc thì bảo hộ được 70% – 100% vịt con (Trần Minh Châu và cộng sự, 1985) [6]

Nghiên cứu đặc tính sinh học của virus vacxin viêm gan vịt nhược độc chủng TN của Asplin và ứng dụng quy trình sản xuất vacxin của Hungari vào

điều kiện Việt Nam, Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên (1984) [9] cho biết vacxin đạt chỉ tiêu an toàn và hiệu lực khi sử dụng

Hiện nay, bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý (Khoa Thú y Trường Đại học Nông nghiệp I) đang sở hữu giống virus vacxin nhược độc viêm gan vịt DH-EG-2000 thích nghi trên phôi gà có xuất xứ từ nước ngoài Những nghiên cứu khảo sát ban đầu về đặc tính sinh học và hiệu lực của vacxin cho kết quả tốt, đáp ứng được yêu cầu phòng chống bệnh viêm gan vịt

ở Việt Nam

3 Nội dung, nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu

3.1 Nội dung nghiên cứu

3.1.1 Kiểm tra đặc tính sinh học giống virus vacxin trước khi đưa vào sản xuất

- Khả năng thích ứng và tính ổn định của giống

- Xác định các chỉ số ELD50 và EID50 của giống

3.1.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin nhược độc viêm gan vịt từ

chủng virus vacxin DH- EG- 2000

3.1.2.1 Quy trình sản xuất vacxin

3.1.2.2 Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin

3.1.2.3 Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin

- Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin tại phòng thí nghiệm

- Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin ngoài thực tế

3.1.2.4 Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin

- Giám định giống virus cường độc viêm gan vịt VG-04 gây bệnh trên thực địa để phục vụ nghiên cứu chỉ tiêu hiệu lực vacxin bằng phản ứng PCR

- Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực bằng phản ứng trung hòa trên phôi vịt

- Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực bằng phương pháp công cường độc cho vịt nuôi ở phòng thí nghiệm

- Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực bằng phương pháp công cường độc cho vịt nuôi ngoài thực địa

3.1.2.5 Xác định khả năng bảo hộ của vacxin với vịt trong độ tuổi mẫn cảm

3.1.3 ứng dụng vacxin trong phòng bệnh và can thiệp khi có dịch ở một số

tỉnh miền núi, trung du, đồng bằng

3.2 Nguyên liệu

3.2.1 Giống virus

- Giống virus vacxin nhược độc viêm gan vịt DH-EG-2000 thích nghi trên phôi gà được bảo quản ở nhiệt độ - 86OC do bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý (Trường Đại học Nông nghiệp I) cung cấp

- Giống virus viêm gan vịt cường độc gây bệnh thực địa VG-04 do bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý (Trường Đại học Nông nghiệp I) phân lập Giống virus VG-04 đ2 được xác định đặc tính sinh học (Trong đó có ELD50 = 10-21,15/0,1ml; EID50 = 10-23,69/0,1ml; LD50 = 10-15,33/0,5ml)

3.2.2 Cặp mồi

Cặp mồi đặc hiệu Duck HPTypeBF2 và Duck HPTypeBR2 để giám

định chủng virus viêm gan vịt cường độc dùng trong phản ứng PCR do Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch - Bệnh lý (Viện thú y quốc gia) cung cấp

Các hóa chất, vật liệu và thiết bị cần thiết để tiến hành phản ứng RT – PCR 3.2.3 Phôi gia cầm

- Phôi vịt 12 ngày tuổi khoẻ mạnh từ trứng của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh chưa tiêm phòng vacxin viêm gan vịt

- Phôi gà 10 ngày tuổi, khoẻ mạnh từ trứng của đàn gà bố mẹ khoẻ mạnh

- Trứng vịt của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh chưa tiêm phòng vacxin viêm gan vịt

3.2.4 Động vật thí nghiệm

- Vịt con 2 đến 7 ngày tuổi nở ra từ trứng của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh chưa tiêm phòng vacxin viêm gan vịt nuôi tại phòng thí nghiệm và ngoài thực địa

3.2.5 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm

- Buồng cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ ấm 37oC, tủ sấy, tủ lạnh - 86oC, nồi hấp −ớt, nồi đun cách thuỷ, máy ly tâm, máy ảnh

- Kháng sinh: Penicilline, Streptomycine

- Bình inox lạnh 25 dm3 (vận chuyển vacxin)

- Bố trí thí nghiệm: Chuẩn bị 120 phôi gà 10 ngày tuổi chia đều thành 4 lô, trong đó có 3 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng

Virus đ−ợc pha thành huyễn dịch có nồng độ 10-2 tiêm vào xoang niệu mô, liều tiêm 0,2 ml/phôi

- Cách thức tiến hành:

+ Chuẩn bị trứng gà giống (trứng của đàn gà bố mẹ khoẻ mạnh) + ấp trứng ở tủ ấp (370C) đến ngày thứ 10, lấy trứng ra soi, chọn những trứng có phôi khoẻ mạnh, đánh dấu buồng hơi và vị trí đầu phôi