tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn giao tử nội và ngoại nhập

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 26 tháng 03 năm 2009) TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG CÔNG NGHỆ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PHAN KIM NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/2009 TÓM TẮT Nhân giống bằng công nghệ phôi hiện đại là giải pháp khả thi nhất góp phần triển khai thành công Chương trình Quốc gia 200.000 bò sữa. Đề tài tiến hành nhằm nghiên cứu và hoàn thiện quy trình tạo phôi bò bằng công nghệ thụ tinh ống nghiệm tại khu vực Tp HCM đồng thời góp phần đào tạo cán bộ kỹ thuật cho lĩnh vực CNSH động vật. Nội dung 1: buồng trứng được thu nhận tại lò mổ và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nước muối sinh lý sau đó thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút bằng kim tiêm 18G và xi lanh 5ml, nuôi chín trong môi trường C 1 (TCM -199 bổ sung FBS, EGF) và tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh ngoại nhập. Kết quả thụ tinh được đánh giá thông qua phôi 2 tế bào. Tiến hành sinh thiết và xác định giới tính phôi nang bằng kỹ thuật PCR và LAMP. Nội dung 2: trứng thu nhận bằng phương pháp siêu âm, sau khi nuôi chín, tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh ngoại nhập. Tiến hành sinh thiết và xác định giới tính phôi dâu và phôi nang bằng kỹ thuật PCR. Nội dung 3: thụ tinh trong ống nghiệm giữa trứng đông lạnh (do phòng thí nghiệm tự đông lạnh và trứng mua) và thử nghiệm cấy truyền phôi cho các bò mẹ mang thai hộ. Kết quả nội dung 1: tỷ lệ trứng chín 69,83 ± 8,04% (Trứng thu tại lò mổ Vissan) và 81,19 ± 2,75% (Trứng thu tại lò mổ Long An); tỷ lệ thu tinh 48,43 ± 6,74%; 18,01 ± 4,91% phát triển đến giai đoạn phôi nang; sinh thiết phôi bằng kỹ thuật PCR và LAMP lần lượt đạt tỉ lệ 41,53% và 46,29%. Kết quả nội dung 2: tỷ lệ trứ ng chín đạt 82,78 ± 7,01%; tỷ lệ thu tinh đạt 67,83 ± 2,61%; 27,32 ± 3,68% phát triển đến phôi nang; sinh thiết phôi đạt tỷ lệ 47,86%. Kết quả nội dung 3: tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm đạt 11,67% (trứng do phòng thí nghiệm tự đông lạnh) và có 46/144 phôi (3,72%) phát triển đến giai đoạn phôi nang và có 02 bê cái ra đời khỏe mạnh. Từ khóa: nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm, đông lạnh trứng, đông lạnh phôi, xác định giới tính phôi, chuyển phôi. ABSTRACT Breeding by modern embryo production technology is the most feasible solution, contributing to the success of the 200,000 milk cows National Program. The main target of our research is studying and improving bovine embryo production process by in vitro fertilization technology in Ho Chi Minh city, simultaneously, contributing to train technicians of animal biotechnology field. In the first experiment, cow ovaries were obtained from abattoir and transported to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution at 33 to 35 o C. The cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by aspiration of 2 to 8 mm follicles using an 18-gauge needle attached to 5ml syringe. Oocytes with a two or three layers of cumulus cells (CC) and homogeneous cytoplasm were washed in flushing medium. Groups of 25 to 30 oocyte were placed in 100 µl drops of C 1 maturation medium (TCM-199 medium supplemented with 10% FBS, 0.2 mM sodium pyruvate, 50µg/ml gentamicin, 10ng EGF) under sterile mineral oil at 38.5◦C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO 2 in air for 22h - 24 h. Mature oocytes were inseminated with imported sperm suspension to a final concentration of 1.10 6 sperms/ml at 38.5◦C in a humidified atmosphere of 5% (v/v) CO 2 in air. The insemination rate is evaluated by 2-cell embryo. Sex of blastocyst embryos were determined by PCR and LAMP technique. In the second experiment, the cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by ultrasound guided ovum pick-up technique. After 22- 24h culture, mature oocytes were inseminated with sperm suspension. Sex of morula and blastocyst embryo is determined by PCR. In the last experiment, IVF was performed with cryopreservated oocytes (from our lab or purchase). The morulas and blastocysts created by this procedure were transferred into the recipient cows. . In the first experiment, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after IVM are 69.83 ± 8.04% (Vissan slaughter - house) and 81.19 ± 2.75% (Long An slaughter - house); insemination rates are 48.43 ± 6.74% and 18.01 ± 4.91% blastocysts. The rates of successful sex determination by PCR and LAMP technique are 41.53% and 46.29%, respectively. In the second experiment, the rate of MII oocytes after IVM is 82.78 ± 7.01%; insemination rate is 67.83 ± 2.61%; and having 27.32 ± 3.68% blastocysts. The rate of successful sex determination by PCR is 47.86%. In the last experiment, insemination rate is 11.67% (oocytes from our lab) and two calves were born. Keywords: in vitro maturation, in vitro fertilization, cryopreservation, vitrification, embryo biopsy, embryo transfer MỤC LỤC Trang Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt và tiếng Anh) I Mục lục IV Danh sách các chữ viết tắt VII Danh sách bảng VIII Danh sách hình IX PHẦN MỞ ĐẦU 1 1. Tên đề tài/dự án Chủ nhiệm đề tài/dự án Cơ quan chủ trì Thời gian thực hiện Kinh phí được duyệt Kinh phí đã cấp 1 1 1 1 1 1 2. Mục tiêu 1 3. Nội dung 2 4. Sản phẩm của đề tài/dự án 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆ U 1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 5 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 10 1.2. Lý do chọn đề tài 14 1.3. Đối tượng nghiên cứu 15 1.4. Ý nghĩa khoa học và khả năng ứng dụng thực tiễn 15 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung 1: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng thu nhận từ lò mổ và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 16 2.1.1. Chuẩn bị trứng 16 2.1.2. Chuẩn bị tinh trùng 19 2.1.3. Thụ tinh trong ống nghiệm 20 2.1.4. Nuôi phôi và đánh giá phôi 21 2.1.5. Sinh thiết phôi 21 2.1.6. Xác định giới tính bằng kĩ thuật PCR và LAMP 23 2.1.7. Đông lạnh phôi 26 2.2. Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng thu từ siêu âm và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 28 2.3. Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng đông lạnh và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 29 2.4. Xử lí số liệu 31 CH ƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu nội dung 1 32 3.1.1. Kết quả thu nhận và nuôi trứng trửơng thành 32 3.1.2. Kết quả đông lạnh trứng 35 3.1.3. Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 36 3.1.4. Kết quả nuôi phôi 37 3.1.5. Kết quả sinh thiết phôi 39 3.1.6. Kết quả xác định giới tính 40 3.1.7. Kết quả đông lạnh phôi 42 3.2. Kết quả nghiên cứu nội dung 2 42 3.2.1. Kết quả thu nhận và nuôi trưởng thành trứng 42 3.2.2. Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 44 3.2.3. Kết quả nuôi phôi 3.2.4. Kết quả sinh thiết phôi 46 3.2.5 Kết quả xác định giới tính 46 3.2.6. Kết quả đông lạnh phôi 47 3.3. Kết quả nghiên cứu nội dung 3 48 3.3.1. Kết quả giải đông trứng mua 48 3.3.2. Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 49 3.3.3. Kết quả nuôi phôi 53 3.3.4. Kết quả đông lạnh phôi 55 3.4. So sánh kết quả của các nội dung thí nghiệm 58 3.4.1. So sánh kết quả nuôi chín trứng từ các nguồn trứng khác nhau 58 3.4.2. So sánh kết quả IVF từ các nguồn trứng khác nhau 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 61 4.2. Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO Dimethyl sulfoxide EG Ehthylen glycol FSH Folliccle Stimulating Hormone Hormone kích thích nang trứng GVBD Germinal vesicle break dowm Giai đoạn túi mầm ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM In Vitro Maturation Nuôi trưởng thành trong ống nghiệm LAMP Loop mediated isothermal amplification Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt MII Methaphase II Kỳ methaphase của nhiễm phân II. MPF Maturation Promoting Factor Nhân tố thúc đẩy sự trưởng thành. PCR Polymere Chain Reaction Phản ứng chuỗi PN Pronuclear Tiền nhân PTN Phòng thí nghiệm PVP polyvinylpyrolidone PZD Partial Zona Disection Tiêm tinh trùng vào khoang quanh noãn SUZI Subzonal Sperm Injection Tạo lỗ thủng nhân tạo ở màng zona. TE Trophoblast embryonic Lớp dưỡng bào phôi ZP Zona pellucidae Lớp màng trong su ốt bảo vệ trứng. DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 Error! Bookmark not defined. Hình 2. 2. Rửa buồng trứng Error! Bookmark not defined. Hình 2. 3. Thu nhận trứng từ buồng trứng Error! Bookmark not defined. Hình 2. 4. Cọng rạ chứa trứng Error! Bookmark not defined. Hình 2. 5. Giải đông cọng rạ chứa tinh trùng trong water bath 37 0 C. Error! Bookmark not defined. Hình 2. 8. Cách hút phôi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined. Hình 2. 9. Hút phôi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined. Hình 2. 10.Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2 Error! Bookmark not defined. Hình 2. 11. Một số hình ảnh siêu âm thu nhận trứng bò Error! Bookmark not defined. Hình 2. 12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3 Error! Bookmark not defined. Hình 3. 1.Trứng bò trước khi IVM (a) và sau khi IVM (b; c); trứng trưởng thành xuất hiện thể cực thứ nhất sau 22 – 24h nuôi (d) Error! Bookmark not defined. Hình 3. 2. Phôi 4 tế bào Error! Bookmark not defined. Hình 3. 3. Phôi 8 tế bào Error! Bookmark not defined. Hình 3. 4. Phôi dâu Error! Bookmark not defined. Hình 3. 5. Phôi nang Error! Bookmark not defined. Hình 3.6. Xác định giới tính phôi bò bằng phản ứng PCR. M: thang chuẩn, Giếng 1: thịt bò đực, Giếng 2: Thịt bò cái, Giếng 3, 4: Phôi đực, Giếng 5, 6,7: Phôi cái, Giếng 8, 9: Phôi không xác định. Error! Bookmark not defined. Hình 3.7. Xác định giới tính phôi bò bằng phản ứng LAMP Error! Bookmark not defined. Hình 3.8. Trứng bò trước khi IVM (a) xuất hiện thể cực sau khi IVM (b) Error! Bookmark not defined. Hình 3.9. Phôi 2 tế bào (a) 8 tế bào (b), phôi morula (c) và phôi nang (d) Error! Bookmark not defined. Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR, các mẫu phôi bò đực (a), bò cái (b) Error! Bookmark not defined. Hình 3.11.Phôi 2 tế bào, thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh với trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined. Hình 3. 12. Trứng đã thụ tinh (phôi 2) từ IVF trứng mua Error! Bookmark not defined. Hình 3.13. Phôi bò. (a) 4-8 tế bào, (b) 16 tế bào, (c) morula và (d) phôi nang. Phôi này thu được từ IVF từ trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined. Hình 3.14. Bê cái sinh ra từ phôi tạo ra trong ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 17/04/2008 tại gia đình ông Nguyễn Văn Cường Error! Bookmark not defined. Hình 3.15. Bê cái sinh ra từ phôi tạo ra trong ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 26/02/2008 tại gia đình ông Võ Văn Sa Error! Bookmark not defined. Hình 3.16. Bê cái (có đốm trắng dười bụng) sinh ra từ phôi tạo ra trong ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 26/02/2008 Error! Bookmark not defined. Biểu đồ 3. 1. Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng thu tại lò mổ Error! Bookmark not defined. Biểu đồ 3. 2. Kết quả đông lạnh trứng Error! Bookmark not defined. Biểu đồ 3.3. Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng siêu âm Error! Bookmark not defined. Biểu đồ 3.4. Kết quả thu nhận trứng sau giải đông Error! Bookmark not defined. Biểu đồ 3.5. Kết quả thụ tinh từ nguồn trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined. Biểu đồ 3.6. So sánh hiệu quả tạo phôi ở các giai đoạn khác nhau ………… 59 [...]... đông lạnh Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng siêu âm bò lai F2 và tinh trùng nhập ngoại đông lạnh Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng đông lạnh và tinh trùng đông lạnh nhập ngoại 4 SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI 1.7.1 Kết quả khoa học - 01 Quy trình tạo phôi và xác định giới tính phôi bằng kĩ thuật PCR và LAMP bằng trứng thu từ lò mổ với tinh trùng đông lạnh Trong quy trình này... Xuân: Thử nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn trứng bò đông lạnh 1.7.4 Bài báo, báo cáo đã công bố - 01 bài đăng trong Hội nghị Công nghệ sinh học trong nông nghiệp tại Đại học Nông Lâm, 2007 (Ứng dụng kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm tạo phôi bò) - 01 bài đăng trong Hội nghị Sinh hóa và Sinh học Phân tử, Hà Nội, 2008 (Xác định giới tính phôi bò bằng kĩ thuật LAMP) - 01 bài đăng trong Hội nghị... đồng sẽ giao sau khi nghiệm thu 2 MỤC TIÊU (1) Xây dựng và hoàn thiện quy trình tạo phôi bò bằng công nghệ thụ tinh ống nghiệm tại khu vực Tp HCM - Thiết lập quy trình kĩ thuật hoàn thiện nhằm chủ động tạo được nguồn phôi từ công nghệ thụ tinh in vitro làm tiền đề cho khả năng ứng dụng quy trình vào sản xuất quy mô công nghiệp nguồn phôi bò với chất lượng cao và giá thành hạ, nguyên liệu cho công tác... bị tinh trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, sinh thiết phôi, xác định giới tính phôi và đông lạnh phôi (Xem Phụ lục 1) - 01 Quy trình tạo phôi và xác định giới tính phôi bằng kĩ thuật PCR và LAMP bằng trứng thu từ siêu âm và tinh trùng đông lạnh Trong quy trình này bao gồm: quy trình chuẩn bị trứng, chuẩn bị tinh trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, sinh thiết phôi, xác định giới tính phôi và đông lạnh phôi. .. tạo ra không thể kiểm soát được giới tính, trong khi đó, bò cho sữa là bò cái Vì thế, việc áp dụng chương trình này ở nông thôn vấp phải khó khăn vì người dân thường không đồng ý thụ tinh bò sữa do họ sợ bò sữa sinh ra là bò đực và chắc chắn là không có giá trị kinh tế bằng bò thịt Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ. .. bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ) - 01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2009 (Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện) - 01 bài đăng trong Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2009 (Thử nghiệm cấy truyền phôi bò đông lạnh đã xác định giới tính từ thụ tinh trong ống nghiệm của giao tử đông lạnh; đang chờ phản biện) - 01 bài đăng trong. .. nuôi trứng chín từ các nguồn trứng Error! Bookmark not defined Bảng 3.21 Kết quả IVF từ các nguồn trứng Error! Bookmark not defined PHẦN MỞ ĐẦU 1 TÊN ĐỀ TÀI TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG CÔNG NGHỆ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP Chủ nhiệm đề tài: Phan Kim Ngọc Cơ quan chủ trì: Trường ĐH KHTN, ĐH Quốc gia TPHCM Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ tháng 12/2006 đến... công nghệ thụ tinh in vitro tạo phô bò trên đối tượng bò vàng địa phương Việt Nam và bò lai Hà - Ấn Hướng nghiên cứu khẳng định về khả năng tạo được nguồn phôi ở quy mô công nghiệp và giá thành rẻ để thay thế công nghệ sản xuất phôi bằng kỹ thuật gây rụng trứng nhiều Kết quả cho thấy tỷ lệ thụ tinh đạt 54,7-60,9% và tỷ lệ phát triển thành phôi dâu và phôi nang từ 22,8-26,9% tùy theo giống bò dùng khai... Đào tạo cán bộ kỹ thuật cho lĩnh vực Công nghệ sinh học động vật Bước đầu xây dựng các quy trình về thụ tinh trong ống nghiệm, xác định giới tính phôi bò Có khả năng ứng dụng thực tiễn cao CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 NỘI DUNG 1: TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG TRỨNG THU NHẬN TỪ LÒ MỔ VÀ TINH TRÙNG NGOẠI NHẬP ĐÔNG LẠNH Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 2.1.1 CHUẨN BỊ TRỨNG - Hóa... và nhân nhanh đàn bò sữa của Tp Hồ Chí Minh - Thử nghiệm nghiên cứu một số quy trình nhằm bảo quản nguồn phôi in vitro tạo ra cho công tác cấy truyền về sau, quy trình xác định giới tính phôi (nhằm chọn được phôi cái) (2) Góp phần đào tạo cán bộ kỹ thuật cho lĩnh vực CNSH động vật 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng lò mổ và tinh trùng nhập ngoại đông lạnh Nội . trùng nhập ngoại đông lạnh. Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng siêu âm bò lai F2 và tinh trùng nhập ngoại đông lạnh. Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng. blastocyst bằng trứng thu từ siêu âm và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 28 2.3. Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng đông lạnh và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh 29 2.4 năm 2009) TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG CÔNG NGHỆ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PHAN KIM NGỌC